预防和延缓皮肤衰老的多肽及组合物

预防和延缓皮肤衰老的多肽及组合物

所属技术领域

本发明涉及一种预防和延缓皮肤衰老的多肽及组合物，尤其涉及一种从牛奶及相关原 料中制备多肽及组合物，用来预防和延缓皮肤衰老的方法。

发明技术背景

众所周知，牛奶中除了含有多种营养物质外，还含有能促进细胞生长的活性物质，在 牛奶中发现在结构上与血小板衍生因子(PDGF)相关的类胰岛素生长因子(IGF-I和II)和牛 初乳生长因子(BCGF)。

世界专利申请(WO 97/16460)中，公开了牛奶对大鼠乳房和成纤维细胞系(Rama 27)有 促进生长活性，但这种细胞系没有明显的被类胰岛素生长因子(IGF)或血小板衍生因子 (PDGF)所刺激生长。

动物实验证实，引发这种促进生长活性的类似表皮生物因子(EGF)样作用的是某一系列 多肽，这些序列多肽的结构类似于α-S₂酪蛋白前体C末端的结构。

世界专利申请(WO 91/00994，WO 95/29933，WO 96/34614)公开了牛奶的提取物用作 生长促进剂和消化道损伤的制剂，但未包括专门用于促进皮肤生长和延缓衰老。

多家国外研究机构的动物实验证实，具有促进细胞生长活性，预防和延缓皮肤衰老的 多肽及组合物，结构类似与α-S₂酪蛋白前体的相关类型，这些多肽的氨基酸序列含有三个 或更多的氨基酸，并以游离状态存在于牛奶中，也可以通过牛奶蛋白的蛋白水解消化获得。 这种多肽及组合物中氨基酸的数目没有特别限制，只要有三个或更多的氨基酸，但并不包 括酪蛋白N末端结构，多肽中氨基酸的数目在3～50，4～50，5～50，6～50之间，这些多肽 可能是通过刺激成纤维细胞的生长，来实现其抗皮肤衰老的功能。

本发明所要解决的技术问题是，从牛奶或者相关原料中制备具有促进细胞生长，对抗 皮肤衰老的多肽及组合物，并应用各种美容化妆产品中。

发明内容

本发明解决技术问题所采用的技术方案，其特征是，采用超微滤膜或阳离子交换树脂 方式从牛初乳、牛奶或乳清中提取、分离天然多肽及组合物，采用蛋白分解酶从牛奶蛋白 中通过蛋白水解方式制备多肽及组合物，单独或联合应用分离提取的天然多肽或蛋白水解 物制备多肽，应用于各种美容化妆产品中，预防和延缓皮肤衰老。

本发明地技术特征是，可以采用超滤方式从牛初乳、牛奶或乳清中提取对抗皮肤衰老 的天然多肽及组合物，其方法是，应用脱脂牛初乳、脱脂牛奶或乳清，采用分子量为8,000～ 15,000D的超微滤膜，最好是分子量为10,000D的超微滤膜，应用普通超滤设备，最好是交 错切面流体超滤设备，分离过滤、收集过滤上清液，再用分子量为1,000D超滤膜浓缩至起 始容积的20％～30％，采用真空干燥或冷冻干燥的方式干燥成粉备用，内含丰富的对抗皮 肤衰老的多肽及组合物。

本发明的技术特征是，也可以采用阳离子交换树脂吸附游离多肽及组合物的方式从牛 初乳、牛奶和乳清中制备对抗皮肤衰老的天然多肽及组合物，其方法是，应用脱脂牛初乳、 脱脂牛奶，乳清经0.1～10.mu.m的微滤膜过滤分离大分子物质，可采用任何类型的阳离子 交换树脂，但最好选用平均颗粒直径超过100.mu.m，并拥有足够的机械强度来对抗高流速 压力类型的阳离子交换树脂，应采用PH为5.5～7.5的磷酸缓冲液来预平衡层析柱，工作 温度最好低于10℃，以减少微生物繁殖，过柱表面积应超过500cm/小时，液体过柱率应在 100～600床容量/小时，过柱后，用PH为5.5～7.5，浓度为0.2mol以下的氯化钠冲洗， 洗脱液应采用PH为5.5～7.5，浓度为0.25～0.5mol的氯化钠溶液洗脱，洗脱液用分子量 为1,000D的超滤膜浓缩至起始体积20％～30％后，真空干燥或冷冻干燥成粉，内含丰富的 对抗皮肤衰老的多肽及组合物。

本发明的技术特征是，通过蛋白水解方式制备本发明对抗皮肤衰老多肽及组合物的原 料是牛奶蛋白，包括酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等牛奶中的蛋白，可以采用牛奶、 牛初乳清等液体牛奶原料，也可以采用酪蛋白粉、乳浆蛋白粉或乳浆蛋白浓缩粉等蛋白干 粉作为原料。如果选用蛋白干粉作为原料，酪蛋白可以选用酸酪蛋白或无脂肪乳固体 (NFDM)，乳清蛋白可以选用干酪制造过程中得到的乳清，尤其是甜乳清制备的干粉或者是 经超滤得到的蛋白浓缩物，乳清蛋白还可以选用经离子交换或电透析而脱矿物质的乳清蛋 白，也可以选用干酪酸盐例如干酪酸钠、干酪酸钾或工业干酪素作为原料。

本发明的技术特征是，如果采用牛奶或牛初乳作为原料，需要以离心方式脱脂，同时 采用超滤设备以分子量为30,000～40,000D的超滤膜去除矿物质、乳糖等小分子物质，并 浓缩蛋白质至10～60克蛋白/升，最好是40～60克蛋白/升浓度；如果以蛋白干粉或蛋 白液体浓缩液作为原料，蛋白可稀释或复原成约10～60克蛋白/升，最好是40～60克蛋 白/升的溶液，其中酪蛋白与乳清蛋白比例为9∶2～2∶8，最好是8∶2～6∶4；如果采用胰蛋 白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物作为蛋白分解酶，该混合物中胰蛋白酶活性为800～1800USP 单位/毫克，最好是等于或大于1800USP单位/毫克，胰凝乳蛋白酶的活性为150～350USP 单位/毫克，最好是等于或大于350USP单位/毫克，胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶之比为1～ 18，最好是4～6，酶混合物与水解蛋白总量的重量百分比为0.2～1.4％，最好是0.6～0.8 ％(重量百分比)。蛋白水解的程序及方法是，蛋白溶液调节PH至6.5～6.8，加热至75℃～ 85℃约10～30分钟进行预热，使白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(Ig)变性，降温至30℃～ 50℃后缓慢加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物，通过高压、短时间的充分均质，使酪 蛋白和乳清蛋白充分分散于溶液中，达到充分与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶接触，从而使酶 解反应进行得更加完全彻底，均质工作压力为8～15Mpa，酶解温度30℃～50℃，酶解时间 持续4～8小时，酶解时PH值应维持在6.5～8范围内，在酶解过程结束时，应该通过灭活 酶活性来进行酶失活的步骤，可以通过热处理来使酶失活，加热温度至85℃～95℃维持10～ 15分钟，使酶失活。收集蛋白水解液，用分子量为10,000D的超滤膜进行过滤分离，以去 除未充分水解的大分子蛋白质，最后用分子量为1,000D的超微滤膜浓缩后，喷雾干燥成粉， 内含丰富的抗皮肤衰老多肽。

本发明的技术特征是，如果以乳清蛋白为原料，包括乳清蛋白粉、乳清浓缩蛋白粉等， 应该加蒸馏水调配成2％～8％的蛋白溶液，最好是4％～6％的蛋白溶液(40克～60克蛋白 质/升溶液)，在调配蛋白溶液过程中可以加温至40℃～50℃帮助蛋白质溶解，调配的蛋白 溶液用于蛋白水解过程；如果以干酪酸盐，例如干酪酸钠、干酪酸钾为原料，应该加蒸馏 水调配成3％的干酪酸盐溶液，每100升干酪酸盐溶液中加20ml凝乳酶(rennet)，在30℃～ 45℃温度下，维持40～60分钟，加酸剂调PH至4.6～4.8，加热至30℃～50℃维持20～40 分钟，离心方式或过滤方式收集凝固的酪蛋白，准备进一步进行蛋白水解程序。

本发明的技术特征是，收集已调配的乳清蛋白溶液或酪蛋白溶液，投料量溶解于50℃～ 85℃的蒸馏水中，加碱液调PH至7～9，均质工作压力8～15Mpa高压均质成糊状基料，按 加酶量0.08％～1.5％，最好是0.4％～0.6％投入胰蛋白酶，调PH值至3～6，在37℃～ 54℃温浴下维持2～8小时，水解酪蛋白，酶解过程完成后，迅速加温至85℃保温10分钟 灭活胰蛋白酶，蛋白水解液通过分子量为5,000～15,000D的超滤膜，分离未充分水解的大 分子蛋白，收集超滤上清液，用分子量为1,000～5,000D，最好是2,000～3,000D的超滤膜 浓缩后，喷雾干燥或真空干燥成粉，内含丰富的抗皮肤衰老的多肽及组合物。

本发明的技术特征是，为了让蛋白水解过程充分，并确保大多数蛋白链断裂，一种改 良的方式可以是，在蛋白水解进行一小时后，持续用交错切面流体超滤装置，采用分子量 为8,000～12,000D的超滤膜持续过滤分离，分子量小于超滤膜孔径的小分子多肽持续被收 集，而分子量大于超滤膜孔径的未充分水解的蛋白质分子又被重新送回蛋白水解反应锅内 继续水解，这种方法不仅使已经被水解的小分子多肽持续被收集，还能促进蛋白和酶之间 的交互反应接触，使蛋白水解更彻底。

本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗皮肤衰老的多肽及组合物具有对抗皮肤衰 老的效应，包括预防和延缓皮肤松驰，皮肤起皱纹，增加皮肤弹性，促进表皮再生，其对 抗皮肤衰老的作用通过刺激成纤维细胞生长，促进胶原合成和分泌，刺激角质形成细胞的 生长，具有与成纤维生长因子(EGF)相似的作用，由于不含蛋白质，故它们不会致敏，而 且产品属于纯天然产品，长期使用不会出现副作用。

本发明的技术特征是，本发明从牛初乳、牛奶和乳清中提取的天然多肽及组合物和通 过蛋白水解制备的多肽及组合物，可以单独应用或联合应用，联合应用可能是更好的选择， 本发明方法制备的抗皮肤衰老多肽及组合物可以作为添加剂加入各类美容产品中和化妆品 中，包括但不限于护肤霜、护肤水、冷霜、日霜、晚霜、洗面奶、护肤油、护肤膏等，帮 助使用者预防和延缓皮肤衰老。

本发明的有益效果是，以天然原料制备有明确抗衰老效应的多肽及组合物，长期使用 安全无副作用，有效帮助使用者对抗皮肤衰老。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

                                实例1

                  从牛奶中制备抗皮肤衰老的多肽及组合物

收集新鲜牛奶100升，以离心方式脱脂，采用分子量为10,000D的超微滤膜，应用交 错切面流体超滤装置(美国Pall公司生产TFF装置)分离过滤，收集的上清液抽入同一设备， 以分子量为1,000D的超滤膜浓缩至起始容积20％后，用60℃真空干燥，制备干粉，内含 丰富的对抗皮肤衰老的多肽及组合物。

收集首次过滤的超滤浓缩液，用真空泵或蠕动泵抽入至交错切面流体超滤装置，以分 子量为40,000D的超滤膜分离小分子量物质，并浓缩蛋白质至50克/升，泵抽蛋白溶液至 反应锅，加温至85℃维持10分钟使免疫球蛋白变性，冷却至50℃，加入胰蛋白酶和胰凝 乳蛋白酶混合物，其量相当于水解蛋白量的0.8％(重量百分比)(其中胰蛋白酶∶胰凝乳蛋白 酶＝5∶1，胰蛋白酶活性等于或大于1800USP单位/毫克，胰凝乳蛋白酶活性等于或大于 350USP单位/毫克)，调整PH至6.8，维持温度在50℃，持续6小时，高压均质，均质工 作压力为10MPa，酶解过程结束，加温至95℃维持10分钟使酶灭活，用真空泵抽蛋白水解 液进入交错切面流体超滤装置，采用分子量为10,000D的超滤膜分离未水解的大分子蛋白 质，收集超滤上清液，直接喷雾干燥制备干粉，内含丰富的抗衰老的多肽及组合物。

                                 实施例2

             以酪蛋白为原料制备抗皮肤衰老的多肽及组合物

以100公斤干酪酸钠为原料，用蒸馏水溶解调配3％的干酪酸钠溶液，加入凝乳酶20ml /100升溶液，调PH至6.8，升温至37℃维持50分钟，加入4N HCL调PH至4.6，加热至 40℃维持20分钟，用离心机5000转/分的速度离心15分钟，沉淀凝集的酪蛋白。

在浓度为6.2％的酪蛋白溶液内投入50℃的蒸馏水，加2N氢氧化钾调PH至8，均质工 作压力为12Mpa，加酶量为4克/L(重量/容积百分比)，加入胰蛋白酶(Sigma Pancretin of bovin origin having an activity 4 NF)，反应锅内PH用2N的氢氧化钾维持在PH 8左 右，温度维持在37℃～40℃，持续6小时，在酶解开始后一小时，蛋白水解液开始在交错 切面流体超滤装置(超滤膜分子量为10,000D)和酶解反应锅之间反复循环，收集渗透超滤膜 的小分子多肽，将大分子量的未水解蛋白再送入反应锅内酶解，酶解过程结束，加温至90 ℃维持10分钟，灭活胰蛋白酶，反应锅内蛋白水解液经超滤装置(超滤膜分子量为10,000D) 分离过滤，合并超滤上清液，用分子量为2,000D的超滤膜浓缩至起始容量的20％，喷雾干 燥成干粉，内含丰富的抗皮肤衰老的多肽及组合物。

                                实施例3

           抗皮肤衰老多肽及组合物增加成纤维细胞中胶原合成的证明

培养Rama27大鼠细胞生长并融合，用M.J.Warburton，S.A.Ferns和P.S.Rudland， Experimental Cell Research，137，378-380(1980)的方法测量它们合成胶原的速度，加 入实施例1从牛奶中提取的抗皮肤衰老多肽1mg/ml，可以使胶原的分泌提高12倍，从54CPM 增加到663CPM，同时使分泌的合成胶原与细胞中所含胶原的比例提高近两倍，从54∶53(1∶1) 增加到633∶321(2∶1)。

                               实施例4

                抗皮肤衰老多肽及组合物对角质形成细胞生长的影响

将人角质形成细胞(HatKat)生长在角质形成细胞生长培养基(TCS Cellworks Ltd)直至 20％融合，在同样培养基内加入0.5％的胎牛血清作为对照组，和在加入0.5％胎牛血清同 时加入1mg/ml的实施例1制备的多肽作为试验组，结果试验组角质细胞生长数为对照组三 倍以上。