绒山羊PDK1基因cDNA编码区核苷酸序列

技术领域  本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码PDK1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码PDK1蛋白质的cDNA编码区698bp的核苷酸序列和与它的第2位～第697位核苷酸序列对应的氨基酸序列。

背景技术  细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1/PDPK1)，是一个63KDa的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。作为细胞中很多重要信号通路的中心枢纽，广泛存在于人的很多组织中。起初，PDK1作为Akt1(PKB)的上游活化激酶而被发现。1997年，Alessi等从兔子的骨骼肌中分离纯化了一种蛋白激酶，可以磷酸化PKB的Thr308位点，PKB的活性增加30倍以上。然后他们在一些磷酸肌醇(PIs)存在的条件下检测该激酶的活性，发现这种活化以一种依赖PIP3或PIP2的方式完成，PDK1也就因此而得名。PKB的充分激活依赖磷酸化Thr308和Ser473氨基酸残基。一般认为PDK1只可将Thr308位点磷酸化，而活化另一位点Ser473的上游激酶目前尚无定论。

PDK1在激活AGC激酶家族成员中起着重要作用，除PKB外，PDK1还可能活化PKC的很多亚型，S6K(p70 ribosomal S6 kinases)，RSK(p90 ribosomal S6 kinases)，SGKs(serum-and glucocorticoid-inducedkinases)和PKA(protein kinaseA)等。被PDK1激活的AGC激酶成员具有共同的结构特征，即均含有两个保守的区域，激酶活性区内的T-loop区(activation-loop)和羧基端的疏水性的H-motif区域(hydrophobicmotif)。前者保守序列为T(F/L)CGT。后者保守序列为FXXF(S/T)(Y/F)，其中X为任意氨基酸。只有这两个保守区域同时磷酸化，激酶活性才被充分激活。PDK1中类似AGC家族的磷酸化位点Ser241可通过分子间二聚后的交叉自磷酸化促使PDK1活化，这也许可以解释为什幺哺乳动物细胞中PDK1多为组成性活化。另外，Src作为PDK1的上游激酶可磷酸化Tyr373/376和Tyr9两个位点。而Tyr9的磷酸化不仅与Src有关，还会受到ROS(reactive oxygen species)的影响。

PDK1活化AGC家族成员的机制不尽相同，可大致分为四组。第一组为脂依赖的底物，包括PKB和某些PKC亚型。PKB与细胞膜上的PIP3结合从而实现从胞浆移位至胞膜，并同时完成其构型的转变，以便处于近膜区的PDK1磷酸化其T-loop上的Thr308位点；在T-loop活化完成的同时，由PDK2(ritor-mTOR)完成对PKB HM的磷酸化，并在其催化结构域(catalytic domain)内通过α螺旋形成HM结合位点；最后，已发生磷酸化的HM结合到此位点，促使PKB活化完全。而某些PKC亚型则是通过与佛波醇、甘油二酯、磷脂酰丝氨酸、卵磷脂或PIP3相互作用，转化为PDK1的底物，从而完成T-loop活化，并且正是这种活化导致了PKC自身HM发生自磷酸化。第二组为磷酸化依赖的底物，包括S6K和SGK。与第一组不同，这种底物的HM先发生磷酸化，然后促使PDK1通过其PIF(PDK1-interacting fragment)结合区与该底物发生相互作用，进而磷酸化底物的T-loop；第三组为Rho依赖的底物，包括 PRK1(PKC-related kinase)和PRK2。这种底物先通过N端结合Rho的结构域与Rho-GTP发生相互作用，然后导致构型改变，促使PDK1磷酸化其T-loop残基。第四组为T-loop残基组成性活化的底物，包括PKA和RSK。

迄今，关于PDK1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在小鼠、大鼠、牛、人和猪等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见绒山羊细胞中PDK1的研究报道，也未见有绒山羊PDK1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

在各种情况下，有重要的原因研究和开发与绒山羊PDK1蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚绒山羊的PDK1基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组PDK1蛋白制备的抗体可以检测PDK1基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

发明内容  本发明人已经努力从绒山羊的不同组织细胞中分离PDK1基因。作为结果，本发明人从绒山羊体外培养的胎儿成纤维细胞分离了PDK1基因的cDNA编码区698bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它的第2位～第697位核苷酸序列推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的小鼠、大鼠、人、牛和猪的PDK1基因的核苷酸序列，到保守区，然后设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增绒山羊PDK1基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了绒山羊PDK1基因的cDNA编码区698bp片段，序列分析表明与与人的PDK1基因(gb|BC012103.1|)有88％的相似性，(622/699)，推导出的由此序列的第2位～第697位核苷酸序列编码的氨基酸序列与人的相比有14个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为“gPDK1”。

所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的PDK1的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克隆绒山羊PDK1基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码绒山羊PDK1蛋白的基因的cDNA的编码区698bp的核苷酸序列和由此序列的第2位～第697位核苷酸序列推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。

附图的简要说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中：

图1显示了人PDK1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号gb|BC012103.1)。

图2显示了698bp的绒山羊PDK1基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和由此序列的第2位～第697位核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3是显示从绒山羊胎儿成纤维细胞分离的总RNA的RT-PCR的结果(698bp的cDNA gPDK1)的电泳图。

图4是显示以质粒pMD19-T-gPDK1为模板，以P1、P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。

图5是显示将质粒pMD19-T-gPDK1进行酶切鉴定的电泳图。

图6显示了绒山羊PDK1基因cDNA的编码区核苷酸序列与人(gb|BC012103.1|)的PDK1基因cDNA的序列的比较。

具体实施方式  为了从绒山羊胎儿成纤维细胞中分离PDK1基因，本发明人首先按照提取细胞总RNA的标准要求收集体外培养的内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia  Cashmere Goat，Capra hircus)的胎儿成纤维细胞。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞的总RNA，然后以该总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gPDK1。

为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gPDK1，将其转化E coli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gPDK1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37℃培养16小时后选取白的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白菌落为获得的重组菌落。

重组菌落和重组质粒pMD19-T-gPDK1的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行EcoR I单酶切和EcoR I/Sal I双酶切鉴定。经过了PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒pMD19-T-gPDK1。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-gPDK1的Ecoli DH5α液体培养的样品送宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了698bp的山羊PDK1基因cDNA编码区的核苷酸序列。

显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出绒山羊的PDK1基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的绒山羊PDK1基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测PDK1基因的组织表达特异性，也可进一步实现绒山羊PDK1基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的PDK1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的PDK1基因的表达情况等等。

在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。

实施例1：绒山羊PDK1基因的cDNA编码区698bp片段的克隆

为了克隆来自绒山羊胎儿成纤维细胞的PDK1基因包含698bp编码区的cDNA，根据图1公开的核苷酸序列(gb|BC012103.1|)，首先制备允许扩增698bp的cDNA的PCR引物，即上游引物P1：5′CACAGATTTTGGAACAGC 3′；下游引物P2：5′TTTCTACAAACTGGTGCC 3′。

为了利用RT-PCR方法克隆PDK1基因的cDNA，从绒山羊胎儿成纤维细胞分离总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的AMV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。

以上面得到的cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系如表1，反应循环如表2。

PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染液中染20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了698bp的特异性目的片段(参见：图3)。

为了将获得的698bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19-T克隆载体上，首先将 电泳分离的698bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段，紫外测定浓度后按照pMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-gPDK1，将其转化Ecoli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-gPDK1转化了的EcoliDH5α细胞涂在含有氨苄青霉素和X-gal的选择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37℃培养16小时后选取白的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白的重组菌落。

表1  PDK1基因PCR反应体系            表2  PDK1基因PCR反应循环

进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定。对阳性的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行1％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以P1、P2为引物，反应体系如表1，反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染液中染20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了698bp的特异性目的片段(参见：图4)。酶切鉴定采用TaKaRa EcoR I单酶切和EcoR I/Sal I双酶切，作为结果，质粒的单双酶切得到了与预期结果大小相符的片段(参见：图5)。

经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌落样品1ml送往宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了绒山羊PDK1基因的cDNA编码区698bp片段的克隆。

实施例2：绒山羊PDK1基因的cDNA的核苷酸序列

图2显示了实施例1中获得的698bp的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，和由此序列的第2位～第697位核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在图2中，显示的序列是PDK1基因的核苷酸序列，它包括了cDNA编码区的698bp的核苷酸序列和由此序列的第2位～第697位核苷酸序列编码形成的推断的分子量为26.1KDa的成熟蛋白质的232个氨基酸。

图6显示了绒山羊PDK1基因cDNA的核苷酸序列与人的PDK1基因(gb|BC012103.1)cDNA的核苷酸序列的比较。表明：1)绒山羊PDK1基因cDNA的核苷酸序 列与人的PDK1基因cDNA的核苷酸序列有88％的同源性。由绒山羊的这段核苷酸序列的第2位～第697位核苷酸序列推导出的氨基酸序列与人的PDK1蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(gb|BC012103.1)有14个氨基酸的差别，同源性94％。

正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆绒山羊PDK1基因cDNA编码区的引物和编码绒山羊的PDK1蛋白质的包括698bp的cDNA的核苷酸序列和由它的第2位～第697位核苷酸序列推断的氨基酸序列。此cDNA包括的696bp的核苷酸序列，它编码含有232个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的PDK1蛋白，进而可用于抗体生产，检测绒山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的PDK1基因的表达情况等等。

1.绒山羊PDK1cDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所述。

2.由cDNA编码区的核苷酸序列的第2位～第697位核苷酸序列推断出的绒山羊PDK1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。