肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制

肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制

技术领域：

本发明属于气溶胶疫苗技术领域范畴。涉及肾综合征出血热(HFRS)病原分离培养、适应训化、疫苗载 体材料优化和气溶胶鼻黏膜免疫接种。

背景技术：

肾综合征出血热是由汉坦病毒(HTNV)引起的重大传染性疾病，全世界每年约有20万人患HFRS，我 国是HFRS危害最严重的国家，90％以上的HFRS病例发生在中国，占世界发病率的90％，死亡率3～10％，我 国东北地区是该传染病的自然疫原地，也是监测防治的重点。由于临床上无特异物和控制方法， 接种疫苗仍然是预防HFRS采取的重要措施。HFRS气溶胶疫苗能够改变病毒性疾病一直以传统针剂注射疫 苗为主的现状，特别是每年在世界范围内由于疫苗注射导致的疾病死亡率高达500万人，同时存在接种速 度慢，覆盖率低的缺陷。气雾途径给药可做到起效快、副作用小、成本低、使用方便，预防效果好的特点。 并具备放大生产等优势，可大量快速地提供给疫区和突发公共卫生事件中大规模人使用，社会效益显著， 同时对人民众身体健康和社会稳定能够作出贡献，具有重大的科技战略意义。

目前，我国使用的HFRS疫苗多数为鼠脑或鼠肾细胞生产的注射给药途径的免疫方法，尚存在地域排 斥的缺点(流行株由于地域来源不同，用于异地则免疫保护缺失)。研究表明，气溶胶传播是汉坦病毒从 啮齿动物感染人类的主要途径，因此，通过鼻黏膜给药进行气溶胶免疫是符合原位免疫设计理念的，它可 以在感染起始阶段进行预防，同时还具有安全方便由刺激局部黏膜免疫带动机体系统免疫的优点。本项发 明使用的病毒是刘江秋等1982年冬季从吉林省长白山地区肾综合征出血热病人急性早期全血中分离出的 病毒H8207(I型)和1983年春季在辽西葫芦岛疫区从褐家鼠体内分离出家鼠型病毒Y86013(II型)作 为疫苗毒种。经载体选择与优化，创新了传统HFRS疫苗的给药途径，发明了HFRS气溶胶疫苗和气溶胶疫 苗接种，获得了理想的免疫实验效果。

发明内容：

本发明的目的是研究实验肾综合征出血热病毒气溶胶疫苗。通过如下技术方案实现：

1.HFRS病毒I型H8207和II型Y86013株的分离与鉴定：

源头创新性从肾综合征出血热病人急性早期全血中分离出两株病毒(I型和II型)，对病毒进行了理化 性质、免疫学性状和基因测序等全面系统鉴定。该毒株具有病毒毒力强，免疫原性好，在Vero细胞上适 应性强，H8207株镜下呈片状荧光反应等生物学特性。经序列分析鉴定为新基因亚型，疫苗毒株具有自主 知识产权。经国家药监局和中国药品生物制品检定所鉴定确认，适合作为HFRS气雾疫苗的生产毒种。

2.HFRS毒株在Vero细胞基质培养、适应、驯化、传代和增殖：

Vero传代细胞是WHO推荐的第二代疫苗生产基质，其替代动物组织细胞可以提升疫苗质量。由于HFRS 病毒不易适应于Vero细胞，因此，经过大量的实验改进，最终使HFRS毒株在Vero细胞中反复传代适应， 本发明成功地将毒种适应到Vero细胞上并能够大量增殖，毒力研究，病毒滴度达到7.0～7.8logTCID50/ml。 解决了制备该疫苗的毒种问题。

3.HFRS病毒抗原制备：

HFRS病毒经切向流过滤澄清、灭活、超滤浓缩、建立了Matrex Cellufine Sulfate亲和层析与 Sepharose 4FF凝胶过滤的多柱串联层析纯化方法。无外源性DNA污染，使疫苗更纯净、安全，抗原收率 增加，为解决该疫苗大规模生产，实现疫苗质量可控和免疫效果理想的目标奠定了基础。该技术使疫苗具 有高纯度、高效价和高质量稳定性，降低了生产成本，质量标准达到国内外领先水平。

4.HFRS气溶胶疫苗载体选择优化：

本发明选择具有良好的生物相容性和生物可降解性材料-壳聚糖为肾综合征出血热气溶胶疫苗递呈载 体，尚未见国内外报道。实验中分别以不同分子量(分子量：Mr：173KDa；210KDa；250KDa；390Kda； 脱乙酰程度60～90％，)、不同浓度壳聚糖和不同含量HFRS病毒抗原作变量，鼻黏膜免疫小鼠，筛选最佳量 -效配比关系。通过系列正交实验，结果确定初免剂量为10～20μg//只，一周后同等剂量加强免疫1次。 病毒抗原∶0.25％壳聚糖(250KDa)＝1∶1(v/v)，免疫小鼠血清中和抗体效价达≥1∶20以上，各组小鼠 无异常反应。

4.气溶胶疫苗接种的研制：

本发明研制了HN-2012JZQ型气溶胶疫苗接种。其特点是剂量可控，强度可调，一次性头。具有 使疫苗接种成本低、方便简洁快速、接种质量效果好、易于大规模体免疫接种等优点。

5.肾综合征出血热气溶胶疫苗的免疫原性和免疫反应性

采用气溶胶发射经鼻黏膜途径免疫小鼠，剂量为(10～20μg/100μl/只)，一周后加强免疫1次， 间接ELISA法检测血清抗体，流式细胞仪(FACS)检测3000个脾T淋巴细胞，结果表明：以HFRS病毒抗 原和壳聚糖为载体材料制备的肾综合征出血热气溶胶疫苗，能够激发小鼠体内产生高滴度的中和抗体和增 强细胞免疫水平，本项研究发明的肾综合征出血热气溶胶疫苗及鼻黏膜途径给药的免疫方法能提高实验小 鼠的体液免疫与细胞免疫，具备免疫原性与免疫反应性。

本发明的实用意义：

肾综合征出血热是由汉坦病毒(HTNV)引起的一种自然疫源性疾病，在临床上以发热、出血和肾损害 为基本特征，但发病机制尚未最后阐明，临床缺乏特异有效的措施，因此寻安全有效的疫苗是控制 HFRS流行和发生的关键。国内外有关HFRS病毒疫苗的生产经历了鼠脑-地鼠肾细胞-传代细胞(Vero细 胞和2BS细胞)过程，用原代细胞培养生产疫苗所用的动物均为开放式饲养，外源病毒和微生物无法控制， 疫苗杂蛋白含量高，毒副反应强，抗体阳转率低。使用原代细胞生产周期长，产品成本高。本发明使用Vero 细胞制备的肾综合征出血热气溶胶疫苗，模拟HFRS病毒自然感染途径进行鼻黏膜免疫，使病原体通过黏膜 侵入机体的同时就能中和病原体，在感染的起始阶段进行预防，具有重要的实用价值。