系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途

系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途

生物技术发明领域

基因是20世纪90年代发展起来的一种全新的疾病模式，它通过向人的体细胞导入 基因发挥对疾病的作用。目前，全世界已有三百多个基因的临床方案获得批准，数以 千计的患者接收了临床试验。基因的对象也从最初的遗传病、肿瘤逐步扩大到心血管病、感染 性疾病等。随着研究的不断深入与完善，基因必将在21世纪对临床医学产生巨大的推动作用。

将基因导入人体细胞是基因的必经步骤，而基因需要合适的载体来运载。用于基 因的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type 2，AAV-2)是一种复制缺陷性的微小病毒，由于具有对人类不致病、可感染有丝分裂后细胞、其基 因组可定点整合至人19号染体等特点，有望发展成为理想的基因载体，因而在近年来的基因 研究中很受重视。制备携带外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus， rAAV)的常规方法涉及两个质粒，一个是携带外源基因(即基因)表达盒及AAV-2倒转末端重复 序列(inverted terminal repeats，ITR)的载体质粒，其中的ITR是rAAV复制和包装所需的最短的顺式 序列；另一个是含有AAV-2 rep和cap基因的助手质粒，可反式提供rAAV复制和包装所需的蛋白。 将两个质粒一起转染细胞，再用辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)感染，才能包装出含外源基因的 rAAV假病毒颗粒。我们曾发明了一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申 请号98120033.8)，简化了生产步骤并提高了产量。

制备rAAV地第一步需构建携带基因的AAV载体质粒。目前，构建AAV载体质粒的常规 方法需从含有AAV-2全基因组的质粒(如Sub201)入手，卸下其中的rep和cap基因，只保留两端 ITR，再依次装入启动子、基因和poly A信号，步骤繁琐，费时费力，亟待改进。

通过提供一系列通用型的AAV载体质粒及其构建方法、提供用这些通用型载体质粒构建携带 基因的AAV载体质粒方法，简化构建携带基因的AAV载体质粒的步骤。

本发明涉及一系列通用型AAV载体的构建，这些载体包括pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1、 pSNAV-2。其共同特征是每种载体均提供AAV-2两端的ITR、巨细胞病毒(CMV)立早增强子和启 动子、多克隆位点和poly A信号。本发明提供了用上述通用型AAV载体构建携带外源基因的AAV 载体质粒的方法。含有外源基因的AAV载体质粒既可用于产生重组AAV，又可直接作为真核表达 质粒使用。pSNAV-1和pSNAV-2除具有上述共同特征外，还含有新霉素抗性基因表达盒。本发明 利用这一特征，提供了用含有外源基因的pSNAV-1和pSNAV-2质粒建立稳定携带AAV载体的细胞 株的方法。本发明进一步提供了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的rAAV生产方法，即用我们先前发 明的一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号98120033.8)感染AAV载 体细胞株，实现重组AAV的大规模生产。

用于本发明的原始生物材料

pSub 201，为Samulski实验室赠送的含有AAV-2全基因组的质粒；

pUCMA，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子、多克隆位点及polyA的质粒；

tgCMV/HyTK，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的HyTK基因的真核表达质粒；

pAV53，为携带氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点的AAV载体质粒；

pSV2neo，为Promega公司生产的表达新霉素抗性基因的真核表达质粒；

pCMV-lacZ，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的β-半乳糖苷酶基 因的真核表达质粒；

pCD2，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因及SV40 早期启动子控制下的新霉素抗性基因的逆转录病毒载体质粒；

以上质粒的宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)。

系列通用型AAV载体质粒的构建过程及特征

pWAV-1的构建过程及特征

见附图1。将pSub201中AAV-2的rep和cap基因用Xba I切除，只保留质粒骨架及AAV-2 基因组两端的ITR；将pUCMA中CMV立早启动子、多克隆位点及polyA序列用XbaI卸下，装 入上述两个ITR中间，构建成重组AAV载体质粒pWAV-1。

该载体含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、嵌 合内含子、多克隆位点和polyA信号。CMV立早增强子和启动子、嵌合内含子部分共约1.1kb。嵌 合内含子由人β珠蛋白基因第一个内含子的5’剪切供者位点和免疫球蛋白基因重链可变区的3’剪 切受者位点构成，将其放置于待插入基因的上游，作用是使mRNA前体在此处剪切成为成熟mRNA， 并防止利用插入基因内部可能的5’剪切供者位点进行剪切。该载体的多克隆位点包括Nhe I、Xho I、Pst I和BamH I，便于外源基因插入。质粒的骨架为pEMBL，含有在大肠杆菌中进行复制所需的 复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。由于rAAV的最大包装限度为约5kb，而两个ITR、CMV立 早增强子和启动子、嵌合内含子、多克隆位点和polyA信号共约1.7kb，因此，所能容纳的外源基因 长度小于3.3kb。 pWAV-2的构建过程及特征

见附图2。将pCMVHyTK质粒用Nhe I和Hind III双切卸下HyTK基因，回收余下的2.9kb 的片段，用Klenow大片段DNA聚合酶和dNTP将粘端补平后自连，构成重组质粒pCMVPA。用Xho I和BamH I双切pCMVPA，回收950bp的CMV和polyA片段；将pAV53质粒用Xho I和BamH I双 切，卸下氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点，只保留质粒骨架及AAV-2基因组两端的ITR， 与上述CMV和polyA片段相连接，成为pWAV-2。

pWAV-2也含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、 多克隆位点和payA信号。质粒的骨架上含有在大肠杆菌中进行复制所需的复制起点序列和氨苄青 霉素抗性基因。多克隆位点包括Kpn I、EcoR I、Sal I。所能容纳的外源基因长度小于3.6kb。

pSNAV-I的构建过程及特征

见附图3。首先采用酶切、补平、再连接的方式，经两步克隆去除pSV2neo上的EcoR I和Bgl II 位点，成为pSV2neoΔEΔB；将pCMV-lacZ中CMV启动子控制下的LacZ表达盒用Xho I和BamH I 切出并回收，连接入pAV53质粒用Xho I和BamH I双切后的ITR中间，构成携带LacZ表达盒的AAV 载体质粒pAV-LacZ，pAV-LacZ用Bgl II酶切，回收ITR-CMV-LacZ-ITR片段，连接入 pSV2neoΔEΔB的BamH I位点，构成携带LacZ表达盒的又-AAV载体质粒pSNAV-lacZ；用Xho I 和BamH I双切pSNAV-lacZ，去除其中的LacZ表达盒，代之以pCMVPA用Xho I和BamH I双切得到 的CMV和polyA片段，构建成pSNAV-1。

pSNAV-1含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、 多克隆位点和polyA信号。在ITR外侧具有SV40启动子控制下的新霉素抗性基因表达盒。质粒的 骨架上含有在大肠杆菌中进行复制所需的复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。多克隆位点包括Kpn I、EcoR I、Sal I、Bgl II。所能容纳的外源基因长度小于3.6kb。 pSNAV-2构建过程及特征

见附图4。用Nhe I酶切pCD2，卸下其中的CD-SV40-neo^r部分，正向插入pWAV-1的Nhe I位 点，构建成pWCDN。将pWCDN用BamH I酶切卸下SV40-neo^r部分，装入pWAV-2的BamH I位点， 构建成正向的pSNAV-2。

在pSNAV-2上，两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、多克隆位点、polyA信号、 SV40早期启动子、新霉素抗性基因和polyA信号。质粒的骨架上含有在大肠杆菌中进行复制所需的 复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。多克隆位点包括Kpn I、EcoR I和Sal I，所能容纳的外源基 因长度小于1.9kb。

本发明提出的以上4种通用型AAV载体质粒均保存于大肠杆菌(Escherichia coli)MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)中，在含50-100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃传代 培养。含有pWAV-1质粒的菌种命名为DH5α/pWAV-1(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号：CGMCC NO.0415.1)，含有pWAV-2质粒的菌种命名为DH5a/pWAV-2(中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.0415.2)，含有pSNAV-1质粒的菌种 命名为DH5α/pSNAV-1(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO. 0415.3)，含有pSNAV-2质粒的菌种命名为DH5α/pSNAV-2(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号：CGMCC NO.0415.4)。

系列通用型AAV载体质粒的用途

构建携带外源基因的重组AAV载体质粒

根据外源基因的大小及两端的酶切位点，选择pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2来装载。 具体做法是用与多克隆位点相应的限制性内切酶切割通用型AAV载体质粒，与相应酶切过的外源 基因连接(用T4连接酶)，转化感受态大肠杆菌。筛选重组子，构成携带外源基因的重组AAV载 体质粒。 制备携带外源基因的重组AAV

根据外源基因的大小及两端的酶切位点，选择pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2来装 载。装载了外源基因的pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2与含有AAV-2 rep和cap基因的 助手质粒一起用脂质体(或磷酸钙，或电穿孔)转染细胞，用辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)感染，可包 装出含外源基因的rAAV假病毒颗粒。或者用我们发明的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号 98120033.8)感染经装载了外源基因的pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2转染的细胞，亦可 包装出含外源基因的rAAV假病毒颗粒。

用脂质体或磷酸钙将装载了外源基因的pSNAV-1或pSNAV-2转染细胞，由于pSNAV-1和 pSNAV-2均含有新霉素抗性基因表达盒，因此用G418压力筛选，选择出的G418抗性细胞即为重组 AAV载体细胞株。用我们发明的全功能辅助病毒感染该细胞株，可包装出含外源基因的rAAV假病毒 颗粒。

在真核细胞中表达外源基因

根据外源基因的大小及两端的酶切位点，选择pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2来装 载。用脂质体(或磷酸钙，或电穿孔)将装载了外源基因的pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1或pSNAV-2 转染哺乳动物细胞，可使外源基因短暂表达。用脂质体(或磷酸钙，或电穿孔)将装载了外源基因的 pSNAV-1或pSNAV-2转染哺乳动物细胞后，用G418压力筛选，选择出的G418抗性细胞可使外源基 因获得稳定表达。

实施例

以下实施例对系列通用型AAV载体质粒的用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内 容。

实施例1质粒DNA的制备

参照Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2^nd ed.(Sambrook J.et al，1996)用碱裂解法大量制 备质粒DNA，用聚乙二醇沉淀法纯化。

实施例2用pWAV-1装载大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因

用Nhe I酶切pCD2，卸下其中2.8kb的CD-SV40-neo^r部分，电泳分离，玻璃奶回收、纯化；用Nhe I酶切pWAV-1使之线性化：将CD-SV40-ueo^r与线性化的pWAV-1连接，连接液转化大肠杆菌 (Escherichia coli)MAX EFFICIENCY DH5α。酶切鉴定重组子，筛选出携带大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD) 基因的AAV载体质粒pWCDN。

实施例3用pSNAV-1装载绿荧光蛋白(GFP)基因

将pGreen Lantern-1(购自GIBCO BRL)上含有的GFP基因用Not I卸下，装入pCDNA2.1(购 自INVITROGEH)的Not I位点，构建成重组质粒pcDNA2.1/GFP(+/-)。将GFP转录方向与T7启动 子方向相反的重组质粒命名为pcDNA2.1/GFP(-)。用EcoR I和Xho I双酶切pcDNA2.1/GFP(-)， 回收GFP片段，插入pSNAV-1的EcoR I和Sal I位点中，构建成携带GFP基因的AAV载体质粒 pSNAV-1-GFP。该质粒依次包括以下元件：ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-ITR-SV40启动子-neo- polyA-amp^R-E.coli ori.。

实施例4用pSNAV-2装载绿荧光蛋白(GFP)基因

用Kpn I和Xho I双酶切pcDNA2.1/GFP(-)，回收GFP片段，插入pSNAV-1的KpnI和SalI位 点中，构建成pSNAV-2/GFP。该质粒依次包括以下元件：ITR-CMV-GFP-SV40 polyA-SV40启动子 -neo-polyA-ITR-amp^R-E.coli ori.。

实施例5携带绿荧光蛋白(GFP)基因的重组AAV载体细胞株的建立

按照GIBCO BRL产品说明书，用10μL Lipofectamine(GIBCO BRL)分别将1.5μg pSNAV-1-GFP 和pSNAV-2-GFP转染6孔培养板中50％铺满的BHK-21细胞。24小时后换液，使细胞在含有400μg/mL G418的1640培养液(含10％胎牛血清)中生长。约10-15天后，获得的抗性细胞即为携带绿 荧光蛋白(GFP)基因的重组AAV载体细胞。

实施例6用质粒共转染法制备重组AAV-GFP

按照GIBCO BRL产品说明书，用20μL Lipofectamine(GIBCO BRL)将1.5μg pSNAV-1-GFP(或 pSNAV-2-GFP)与3μg pAAV/Ad混合转染6-cm培养板皿中80％铺满的BHK-21细胞。5小时换液， 用5型腺病毒感染(MOI为2)之。至48-72小时细胞完全病变后反复冻融4次裂解细胞以释放细胞 中的重组AAV-GFP，低速离心去除细胞碎片，取上清置56℃ 30分钟灭活辅助病毒，置-20℃保 存备用。

实施例7用全功能辅助病毒感染AAV-GFP载体细胞株制备重组AAV-GFP

用0.1 MOI的全功能辅助病毒感染实施例5建立的携带绿荧光蛋白(GFP)基因的重组AAV 载体细胞。24-48小时后细胞发生完全病变，将细胞和其培养液一起反复冻融4次，1000r/min离 心5分钟，上清中即含有大量的rAAV-GFP病毒。用这种方法可方便地产生有感染性的rAAV-GFP 毒粒，并可实现rAAV的批量生产。

实施例8重组AAV-GFP转导培养细胞

取rAAV-GFP病毒上清1ml加入培养的BHK细胞(80％铺满)，24-48小时后在荧光显微镜 下(激发波长490nm)观察，可见到大量的绿细胞。表明产生的rAAV具有感染性，并能将外源 基因导入细胞中表达。

实施例9 GFP在细胞中的短暂表达

用20μL Lipofectamine(GIBCO BRL)将1.5μg pSNAV-1-GFP(或pSNAV-2-GFP)转染6-cm培养 板皿中80％铺满的BHK-21细胞。至24小时将细胞置于荧光显微镜下(激发波长490nm)观察， 可见很多绿细胞。表明pSNAV-1-GFP(或pSNAV-2-GFP)可在真核细胞中表达绿荧光蛋白， pSNAV-1和pSNAV-2均可作为真核表达载体使用。

实施例10 GFP基因在细胞中的稳定表达

按照GIBCOBRL产品说明书，用10μL Lipofectamine(GIBCO BRL)分别将1.5μgpSNAV-1-GFP 和pSNAV-2-GFP转染6孔培养板中50％铺满的BHK-21细胞。24小时后换液，使细胞在含有400μg/mL G418的1640培养液(含10％胎牛血清)中生长。约10-15天后，在荧光显微镜下(激发波长490nm) 可见获得的抗性细胞发出绿，即表达绿荧光蛋白。绿荧光蛋白随着细胞传代续表达，说明 pSNAV-1和pSNAV-2均可作为介导外源基因稳定表达的真核表达载体使用。