一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼鳞胶原蛋白肽及制备方法

一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼鳞胶原蛋白肽及 制备方法

技术领域

本发明属于水产食品加工领域，具体涉及鱼鳞为原料生产的具有促进益生菌生长和抗氧化功能的蛋白肽，以及蛋白肽的生产方法。

背景技术

益生菌是一类对人体健康具有重大意义的微生物。常见有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、嗜热链球菌属等乳酸菌。益生菌具有促进机体吸收营养物质，提高机体免疫力，提高机体抗氧化水平，抑制肠道炎症等功能，对人体健康具有重要作用，如何高效促进益生菌的生长成为一个需解决的问题。目前有许多研究报道功能性低聚糖可以选择性地促进乳酸菌的增殖，常见的功能性低聚糖有大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。近些年来，随着对人类健康研究的深入和物质分离纯化、鉴定技术的进步，介于氨基酸单体与大分子蛋白质之间的多肽的生理功能日益赢得科学界关注。依据肽的原料来源，外源性生物活性肽可分为动物源、植物源、微生物源活性肽等。生物活性肽的众多来源中，水生生物凭借资源丰富、生理结构与生理过程与陆生生物差别较大的特点，成为外源性生物活性肽资源的宝库。目前水生生物活性肽，发现了一系列具有抗氧化、降血压、降血糖、抗肿瘤等生理功能的活性肽。但关于蛋白肽与低聚糖结合对益生菌生长的作用还没有相关的发明专利和研究报道。

本发明针对目前我国鱼鳞蛋白资源没有得到充分的利用，根据鱼鳞蛋白的特性，以鱼鳞为原料，通过对鱼鳞超高压、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，糖基化改性技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列 (Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu) 的具有促进益生菌生长和抗氧化功能的鱼鳞蛋白糖肽，建立一套具有特定功能的鱼鳞蛋白糖肽的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以鱼鳞为原料制备具有促进益生菌生长和抗氧化的糖基化鱼鳞蛋白肽。该蛋白肽具有较好的促进益生菌生长和抗氧化作用。

本发明另一目的是提供上述鱼鳞蛋白糖肽的制备方法。

实现本发明的技术方案如下：

本发明以鱼鳞为原料，经过大量的实验，开发了一种具有较好促进益生菌生长和抗氧化的鱼鳞蛋白糖肽及制备方法。该蛋白肽按照如下方法制备：

(1)选用脱灰的罗非鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,然后加入 3.0～7.0倍鱼鳞重量的水，通过110-125℃处理60-120分钟，得到鱼鳞浆液，利用振动筛分离，得到鱼鳞蛋白液。

(2)将(1)得到的鱼鳞蛋白液，温度调整到60-70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为90-120kH)处理20-30分钟，再利用高静水压力 (300-400Mpa)处理10-30分钟，改变鱼鳞蛋白的组织结构。

(3)调节鱼鳞蛋白液中蛋白含量为10-12％，按照鱼鳞蛋白液中蛋白重量0.5～1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量 0.4-0.8％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组成)，它们之间的质量比为(1～2：1：0.5)，在50～60℃条件下进行酶解反应 0.5～2.0h；第二步为蛋白重量0.1-0.3％的风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.2～1.0h；在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；

(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000 道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相谱进行 1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取 16-18分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、 Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu的肽的含量为50～55％。

(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚异麦芽糖(肽：低聚异麦芽糖的质量比为5-6：1)在90-100℃反应30-60min,通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白糖肽粉。

本发明具有的优点:(1)本发明利用鱼鳞和低聚异麦芽糖开发的糖基化鱼鳞蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性。 (2)开发的蛋白肽具有较好的促进益生菌生长和抗氧化作用。(3)本发明利用特定频率超声波结合超高压技术处理的鱼蛋白液，明显改善鱼鳞蛋白对酶的敏感性，酶解液中蛋白质含量为10％以上，降低酶的使用量。(4)开发的产品在温和条件下，经过适度酶解获得的鱼鳞蛋白肽与低聚异麦芽糖在较温和的条件下进行反应，不加任何添加剂。(5)本发明开发的产品具有良好的风味和泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。(6)本发明开发的产品具有较明确的肽的组成，其中Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu的肽的含量为50％以上。

具体实施方式

实施例1具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼蛋白糖肽及制备方法

(1)选用脱灰的罗非鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,然后加入 3.0倍鱼鳞重量的水，通过125℃处理60分钟，得到鱼鳞浆液，利用振动筛分离，得到鱼鳞蛋白液。

(2)将(1)得到的鱼鳞蛋白液，温度调整到60℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kH)处理20分钟，再利用高静水压力(300Mpa)处理10 分钟，改变鱼鳞蛋白的组织结构。

(3)调节鱼鳞蛋白液中蛋白含量为10％，按照鱼鳞蛋白液中蛋白重量0.5％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.4％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组成)，它们之间的质量比为(1：1：0.5)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；第二步为蛋白重量0.1％的风味蛋白酶，在60℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温 10分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；

(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000 道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相谱进行 1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取 16-18分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、 Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu的肽的含量为50.7％。

(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚异麦芽糖(肽：低聚异麦芽糖的质量比为5：1)在90℃反应60min,通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白糖肽粉。

实施例2具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼蛋白糖肽及制备方法

(1)选用脱灰的罗非鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,然后加入 7.0倍鱼鳞重量的水，通过110℃处理60分钟，得到鱼鳞浆液，利用振动筛分离，得到鱼鳞蛋白液。

(2)将(1)得到的鱼鳞蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为90kH)处理30分钟，再利用高静水压力(350Mpa)处理30 分钟，改变鱼鳞蛋白的组织结构。

(3)调节鱼鳞蛋白液中蛋白含量为12％，按照鱼鳞蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.8％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组成)，它们之间的质量比为(2：1：0.5)，在60℃条件下进行酶解反应0.5h；第二步为蛋白重量0.2％的风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.2h；在90℃下保温10分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；

(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000 道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相谱进行 1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取 16-18分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、 Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu的肽的含量为50.5％。

(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚异麦芽糖(肽：低聚异麦芽糖的质量比为5.5：1)在100℃反应30min,通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白糖肽粉。

实施例3具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼蛋白糖肽及制备方法

(1)选用脱灰的罗非鱼鱼鳞，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,然后加入 5.0倍鱼鳞重量的水，通过115℃处理90分钟，得到鱼鳞浆液，利用振动筛分离，得到鱼鳞蛋白液。

(2)将(1)得到的鱼鳞蛋白液，温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kH)处理25分钟，再利用高静水压力(350Mpa)处理20 分钟，改变鱼鳞蛋白的组织结构。

(3)调节鱼鳞蛋白液中蛋白含量为11％，按照鱼鳞蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步为蛋白重量0.7％的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶组成)，它们之间的质量比为(2：1：0.5)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；第二步为蛋白重量0.1％的风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温 10分钟，冷却至室温，通过板框过滤分离，收集分离液；

(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为6000 道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于6000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

(5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相谱进行 1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，取16-18分收集的肽溶液；通过LC-MS/MS对鱼鳞胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Phe-Lys-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Ser、 Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Glu-Glu-Leu的肽的含量为50.9％。

(6)将步骤(5)得到的肽溶液与低聚异麦芽糖(肽：低聚异麦芽糖的质量比为6：1)在95℃反应45min,通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼鳞蛋白糖肽粉。

实验例1本发明糖基化鱼蛋白肽促进益生菌生长能力的测定试验试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的糖基化鱼蛋白肽；样品4、5、6分别为为实施例1步骤(3)、(4)、(5)经过冷冻干燥后制备的产品。

促进益生菌生长测定按照如下方法进行：

将活化好的益生菌菌种(嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌LGG)以液体培养基体积1％的量接种于对应的液体培养基(对照组为纯培养基，实验1组、2组、3组、 4组、5组、6组为分别在相应的培养基中添加5％的样品1、2、3、4、5、6)，然后将接种菌液后的培养基在厌氧条件下37℃培养，培养至6、12、18、24h时分别取200μL菌液于96孔板中，用酶标仪测定菌液在600nm处的吸光度，测定 OD600值。取0.5mL培养24h的菌液4.5mL于无菌生理盐水中进行梯度稀释，取合适稀释梯度的100μL菌悬液于固体培养基中进行涂布，将涂布好的平板放置于厌氧条件下37℃培养36h，取出计算菌落总数。

表1本发明鱼鳞蛋白糖肽的对嗜酸乳杆菌生长试验结果

表2本发明鱼肉蛋白糖肽的促鼠李糖乳杆菌LGG生长试验结果

实验例2本发明糖基化鱼蛋白肽抗氧化活性的测定试验

试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3步骤(6)制备的糖基化鱼蛋白肽；样品4、5、6分别为为实施例1步骤(3)、(4)、(5)经过冷冻干燥后制备的产品；样品7、8为合成的纯肽产品。

抗氧化活性的测定按照如下方法进行：

(1)清除DPPH自由基能力：取0.2mg/mL的样品1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴 30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。

DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100

(2)还原力测定：取0.2mg/mL的样品1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6) 2.5mL和1％(质量分数)的铁溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热 20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5 mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。

结果(见表3)本发明的糖基化鱼蛋白肽具有较好的抗氧化能力，在0.2mg/mL 的条件下，其清除DPPH自由基能力达到88％以上，还原力达到0.85以上，是一种较好的抗氧化物质。

表3本发明糖基化鱼蛋白肽的抗氧化活性试验结果

从表1、表2、表3可以看出，鱼鳞蛋白肽和鱼鳞蛋白糖肽可以有效促进益生菌的生长，开发的鱼鳞蛋白糖肽与各类蛋白肽和对照组相比对益生菌的促生长作用有显著的提升；本发明开发的鱼蛋白糖肽有显著的促进益生菌的生长外，还有显著的抗氧化作用。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范。