皮肤增白增亮化合物及其应用

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种皮肤增白增亮化合物及其应用。

影响皮肤的视觉外观、物理性能或生理功能的因素有很多，比如衰老、长 期暴露于不利的环境因素(如紫外线照射)、营养失调等。最显著的改变包括细 纹和皱纹的发展、弹性的降低、坚实度的降低、颜均匀性或调的损失、粗 糙的表面纹理和斑驳的着。随着皮肤老化或经历长期的环境损害而发生的改 变还包括细胞和组织活性的普遍降低、细胞复制速率的降低、皮肤血流的减少、 水分含量降低、累积的结构和功能丧失以及皮肤改造和自身修复能力的下降。

视觉外观上最显著的变化之一是皮肤颜的变化。人皮肤的颜由位于皮 肤基底层的特化细胞黑素细胞所产生的黑素的量和类型决定。黑素是分 布最广泛的天然素之一，其结构复杂是一种颜从褐至黑(真黑素)以 及红至黄(褐黑素)变化的均质多酚样生物聚合物。在人类皮肤中，黑素 被认为充当抗紫外线辐射的保护剂。

黑素的过量产生可以引起不同类型的异常皮肤颜、毛发颜和其他皮 肤病学病症，例如黄褐斑、老年斑和光损伤位点。黑素是通过起始于氨基酸 酪氨酸的一系列氧化反应和聚合步骤产生的。酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是包含铜 的III型酶，其在黑素产生中催化两个初始反应：1)通过单酚酶作用的L-酪 氨酸的邻位羟基化，以及2)通过二酚酶作用的3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA) →o-多巴醌的氧化。后一氧化步骤比前一步骤更快，因此酪氨酸的羟基化被认 为是黑素生物合成中的速率决定步骤。o-多巴醌随后通过一系列酶促和非酶 促聚合反应转化为黑素。诸如多巴素互变异构酶(酪氨酸酶相关蛋白2； TRP-2)和二羟基吲哚羧酸(DICHA)氧化酶(酪氨酸酶相关蛋白1；TRP-1)的其他 酶也包括在黑素的生物合成过程中。由于酪氨酸酶在黑素产生的过程中发 挥关键的作用，所以该酶的抑制剂通常用作皮肤增白剂。

现有技术中已经描述了多种天然存在以及合成的酪氨酸酶抑制剂。大多数 化合物包含酚结构。这些化合物充当金属螯合剂。包含氢醌(2-4％)的药品为 适度有效的，但是氢醌被认为对黑素细胞有细胞毒性，并且对哺乳动物细胞 有潜在的诱变性。许多酪氨酸酶抑制剂为类黄酮或反式均二苯代乙烯的间苯二 酚衍生物或多酚衍生物，例如白藜芦醇或其衍生物。已知这些类型的化合物与 金属离子形成强螯合物。

尽管已经报道多种化合物为有效的酪氨酸酶抑制剂，但是它们中非常少的 表现出皮肤增白剂的性质。此外，已经发现这些试剂中的大多数有毒，或表 现出对人的不良副作用。因此，对于具有有效的酪氨酸酶抑制活性且细胞毒性 低的新天然产物或合成化合物的研究仍在持续。

本发明的第一个目的是提供一种皮肤增白增亮化合物及其应用。

本发明的第二个目的是提供一种上述组合物的制备方法。

本发明的第一方面提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受的盐， 在制备组合物或药物中的用途，

所述组合物或药物用于：

(1)抑制酪氨酸酶活性；和/或

(2)抑制黑素产生；和/或

(3)预防或与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病或症状；和/ 或

(4)皮肤或牙齿的增白；和/或

(5)皮肤或牙齿的增亮；和/或

(6)修复皮肤损伤。

在另一优选例中，所述疾病或症状选自：晒黑，皮肤素沉着，黄褐斑， 白癜风，和黑素瘤。

在另一优选例中，所述皮肤为哺乳动物皮肤，所述哺乳动物优选为人。

在另一优选例中，所述组合物用于制备药物、乳液、护肤露、乳霜、精华 素、面膜、防晒霜、粉底或唇膏，但是本发明的范围不局限于此。

在另一优选例中，本发明提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受 的盐，在制备抑制酪氨酸酶活性的组合物或药物中的用途。

在另一优选例中，本发明提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受 的盐，在制备抑制黑素产生的组合物或药物中的用途。

在另一优选例中，本发明提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受 的盐，在制备预防或与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病或症状的 组合物或药物中的用途。

在另一优选例中，本发明提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受 的盐，在制备用于皮肤或牙齿增白和/或增亮的组合物或药物中的用途。

在另一优选例中，本发明提供了一种式I所示的化合物或其药学上可接受 的盐，在制备修复皮肤损伤的组合物或药物中的用途。

本发明的第二方面提供了一种组合物，所述组合物包含式I所示的化合物 或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，所述组合物用于，

(1)抑制酪氨酸酶活性；和/或

(2)抑制黑素产生；和/或

(3)预防或与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病或症状；和/ 或

(4)皮肤或牙齿的增白；和/或

(5)皮肤或牙齿的增亮；和/或

(6)修复皮肤损伤。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物、化妆品组合物、牙膏组合 物、食品添加剂、保健品组合物等。

在另一优选例中，所述载体包括水、有机溶剂等。

在另一优选例中，所述化妆品组合物包括：乳液、护肤露、乳霜、精华素、 面膜、防晒霜、粉底或唇膏，但是本发明的范围不局限于此。

本发明的第三方面提供了一种抑制酪氨酸酶活性的方法，所述方法包括步 骤：将酪氨酸酶与本发明式I化合物接触，从而抑制酪氨酸酶活性。

在另一优选例中，所述方法用于非的目的。

本发明的第四方面提供了一种预防及与酪氨酸酶活性有关的疾病和 疾病状况的方法，包括步骤：内部或局部给予有需要的个体有效量的本发 明的式I化合物。

本发明的第五方面提供了一种在有需要的个体中抑制黑素合成的方法， 所述方法包括给予该个体施用有效量的本发明的式I化合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

图1显示了本发明的化合物对酪氨酸酶具有显著地抑制活性；

图2显示了本发明的化合物对黑素产生的抑制效果。

本申请提供了对酪氨酸酶具有优异的抑制活性和非常低的细胞毒性的化 合物。本发明包括该酪氨酸酶抑制剂的药学可接受的盐。本发明还包括包含至 本发明的酪氨酸酶抑制剂和至少一种药学可接受的载体的药物组合物。本发明 的组合物可以以任何合适的药学可接受的剂型来制备。

本发明还提供了在有需要的个体中抑制酪氨酸酶的方法，所述方法包括给 予有效量的包含本发明的酪氨酸酶抑制剂的组合物。

本发明还提供了预防及与酪氨酸酶活性有关的疾病和疾病状况的方 法。本发明的预防和的方法包括内部或局部给予有需要的个体有效量 的本发明的酪氨酸酶抑制剂。

本发明还提供了在有需要的个体中抑制黑素合成的方法。这样的方法包 括给予有效量的包含本发明的化合物的组合物。

本发明还提供了预防和与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病 和疾病状况的方法，所述方法包括内部或局部给予有需要的个体有效量的 本发明的化合物。与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病和疾病状况包括 但不限于由皮肤老化引起的素沉着斑点、黄褐斑、肝病、热灼伤和局部创伤， 由真菌、微生物和病毒感染引起的炎症疾病状况所导致的皮肤素沉着，白癜 风、肿瘤、黑素瘤以及其他哺乳动物皮肤疾病状况。所述方法还可以用于预防 和由于暴露于太阳、紫外线(UV)辐射、化学品、热、风和干燥环境所导致 的皮肤暗和损伤。最终，所述方法可以用于预防和皱纹、松弛的皮肤、 眼睛周围的皱纹和黑眼圈、松弛敏感的皮肤，以及预防和皮炎和其他过敏 反应相关的皮肤疾病状况。

在具体的实施方案中，给予有需要的个体的本发明的酪氨酸酶抑制剂的剂 量是有效无毒的量，其通常选自：基于最终制剂的总重量的0.001％至100％； 和/或基于个体体重每千克0.01mg至200mg。本领域技术人员使用常规临床测 试可以确定用于被的特定疾病的最佳剂量。可以通过本领域技术人员已知 的任何方法给予本发明的组合物。给药方式包括但不限于肠(口服)给药、肠胃 外(静脉内、皮下和肌肉内)给药和局部应用。本发明的方法包括向有需要 的患者内部或局部给予有效量的本发明的化合物。在优选的实施方案中， 局部给予所述组合物。

另一实施方案中，可以将本发明的化合物用于食品工业中以抑制水果、蔬 菜、汁和其他食品的褐变和变。

尽管与本文所述的那些类似或相当的方法和材料可以用于本发明的实践 或测试，以下仍描述合适的方法和材料。本文中涉及的所有公开可得的出版物、 专利申请、专利和其他参考文献以整体引用的方式并入本文中。

本发明提供了丹酚酸A或其药学上可接受的盐，在制备组合物或药物中的 用途，所述组合物或药物用于：

(1)抑制酪氨酸酶活性；和/或

(2)抑制黑素产生；和/或

(3)预防或与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病或症状；和/ 或

(4)皮肤或牙齿的增白；和/或

(5)皮肤或牙齿的增亮；和/或

(6)修复皮肤损伤。

本发明提供了作为酪氨酸酶的有效抑制剂的化合物。具体地，本发明提供 了具有以下式I所述结构的酪氨酸酶抑制剂，或其药学可接受的盐，

该合物表现为具有优异的酪氨酸酶抑制活性和低细胞毒性。实施例中验证 了式I化合物对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性，以及对鼠B16-F1黑素瘤细胞所产生 的黑素的抑制。并通过重建的人皮肤模型来评价代表性化合物的皮肤增白性 质。这些化合物或它们的药学可接受的盐表现为用于下文详述的化妆品及医学 应用。

式I所示的化合物的制备方法可以参考文献中国专利申请 CN201310192210.0中所记载的方法。

本文中所用的各种术语涉及本发明的多个方面。为了帮助阐述本发明组分 的描述，提供以下定义。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有 本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。

如本文中所用，术语“酪氨酸酶抑制剂”、“式I所示化合物”、“本发 明(的)化合物”均是指具有式I所示结构的化合物。

如本文中所用的，“约”会被本领域技术人员所理解，并会在其所用的语境 中变化至某种程度。如果在给定的该术语所用的语境中，存在本领域技术人员 并不清楚的该术语的用途，则“约”表示等于该特定术语加上或减去10％。

本文所用的“”包括预防(prevention)、和/或预防(prophylaxis)。当 使用时，是指人类以及其他动物。

“药物或有效剂量或量”是指足以诱导期望的生物学结果的剂量水平。 所述结果可以是迹象、症状或疾病原因的缓解或者期望的生物体系的任何其他 改变。精确的剂量会根据各种因素而变化，所述因素包括但不限于个体年龄和 大小、疾病和的效果。

“宿主”或“患者”或“个体”为期望的活哺乳动物、人类或动物。“宿主”、 “患者”或“个体”通常是指根据本发明的方法实施的受体。应当注意，本文 所述的发明可以用于兽医以及人应用，并且术语“宿主”不应当以限定的方式来 解释。在兽医应用的情况下，剂量范围可以如以下所述，考虑动物的体重来确 定。

本文所用的术语“药学可接受的”表示由联邦或国家管理机构所核准或者 列于国家药典列表或其他一般认可的药典中用于动物，并且更特别地用于人 类。术语“载体”是指与一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，并且 包括但不限于诸如水和油无菌液体。

酪氨酸酶抑制剂的“药学可接受的盐”或“盐”为含有离子键的本文所公开的 化合物的产物，其适合于给予个体，并且通常通过使公开的化合物与酸或碱反 应来制备。药学可接受的盐可以包括但不限于酸加成盐，其包括盐酸盐、氢溴 酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳基烷基磺酸 盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐 和酒石酸盐；碱金属阳离子，例如Li、Na、K；碱土金属盐，例如Mg或Ca； 或有机胺盐。

“药物组合物”为适于给予个体的形式的包含公开的化合物的制剂。优选地 将本发明的药物组合物配制为与其期望的给药途径相容。给药途径的实例包括 但不限于口服和肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、吸入、局部、透皮、透粘 膜和直肠给药。

本发明包括包含至少一种本文所述的酪氨酸酶抑制剂的药物组合物。可以 将本发明的组合物配制为包含其他组分的药物组合物，该其他组分例如药学和 /或化妆品可接受的赋形剂、佐剂和/或载体。例如，可以将本发明的组合物配 制在要的宿主可耐受的赋形剂中。赋形剂为用作剂的稀释剂或媒介物 的惰性物质。这样的赋形剂的实例包括但不限于水、缓冲液、盐水、林格氏溶 液(Ringer’ssolution)、葡萄糖溶液、甘露醇、汉克斯溶液(Hank’ssolution)、防 腐剂和其他水性生理学平衡盐溶液。还可以使用非水性媒介物，例如非挥发油， 芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有粘度增强剂的混悬液， 所述粘度增强剂例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。赋形剂还可以含有 少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐 缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、tris缓冲液、组氨酸、柠檬酸盐和甘氨酸或它们的 混合物，而防腐剂的实例包括但不限于EDTA、EDTA二钠、BHA、BHT、维 生素C、维生素E、亚硫酸氢钠、SnCl2、硫柳汞、间-或邻-甲苯酚、福尔马林 和苄醇。标准制剂可以为液体或固体，其可以通过用于给药的混悬液或溶液的 合适液体形式来吸收。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含葡萄糖、人血 清白蛋白、防腐剂等，可以在给药之前向其中添加无菌水或盐水。

在本发明的一实施方案中，组合物还可以包括佐剂或载体。通常，佐剂为通常 增强宿主对特定生物活性剂的生物学应答的物质。合适的佐剂包括但不限于弗 氏佐剂；其他细菌细胞壁组分；基于铝、镁、铜、锌、铁、钙和其他金属离子 的盐；二氧化硅；多核苷酸；类毒素；血清蛋白；病毒外壳蛋白；其他细菌来 源的制备物(preparation)；γ干扰素；嵌段共聚物佐剂，例如Hunter’sTitermax 佐剂(Vaxcel.TM.,Inc.Norcross,Ga.)；Ribi佐剂(来自 RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)；以及皂苷及它们的衍生物， 例如QuilA(来自SuperfosBiosectorA/S,Denmark)。载体通常为增加的宿主 中组合物半衰期的化合物。合适的载体包括但不限于聚合控释制剂、生物 可降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、油、酯和二醇。合适的载体描述于 LippincottWilliams&Wilkins出版的 “Remington:TheScienceandPractice,TwentiethEdition”，其以引用的方式并入本 文。

在一实施方案中，将组合物制备为控释制剂，其缓慢地将本发明的组合物 释放至宿主中。如本文所使用的，控释制剂包含控释媒介物中的本发明的组合 物。合适的控释媒介物为本领域技术人员已知。优选的控释制剂为生物可降解 的(即可生物消化的)。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法给予本发明的组合物。给药方式 包括但不限于肠(口服)给药、肠胃外(静脉内、皮下和肌肉内)给药和局部应用。 本发明的方法包括向有需要的患者内部或局部给予有效量的本发明 的化合物。

在一实施方案中，通过本领域技术人员已知的用于局部给予组合物的 任何合适方法来局部地给予本发明的剂，所述剂包括但不限于软膏、 凝胶、洗剂或乳膏基质；或作为牙膏、漱口剂或者包衣于牙线材料上或作为乳 剂、作为贴剂、敷料或面膜(mask)、不粘附的纱布、绷带、药签或擦拭布来局 部地给予本发明的剂。

根据给药方法，可以以各种单位剂型给予组合物。对于递送的特定方 式，可以将本发明的组合物配制于本发明的赋形剂中。可以将本发明的治 疗试剂给予任何宿主，优选哺乳动物，并且更优选人。给药的特定方式取决于 要的疾病状况。

在一实施方案中，合适的软膏包含期望浓度的本发明的化合物，其为有效 无毒的量，该量通常选自基于局部制剂总重量的0.001％至100％；65％至 100％(优选75％至96％)的白软石蜡；0％至15％的液体石蜡；以及0％至7％(优 选3％至7％)的羊毛脂或其衍生物或合成等同物。在另一实施方案中，乳膏可以 包含聚乙烯液体石蜡基质。

在一实施方案中，合适的乳膏包含与期望浓度的上文所提供的本发明的至 少一种化合物一起的乳化体系。乳化体系优选地包含2％至10％的聚氧乙烯醇 (例如以商品名CetomacrogolTM1000提供的混合物)、10％至25％的硬脂醇、20％ 至60％的液体石蜡和10％至65％的水；以及一种或多种防腐剂，例如0.1％至 1％的N,N”-亚甲基双[N’-[3-(羟甲基)-2,5-二氧-4-咪唑烷基]脲](以 ImidureaUSNF的名称提供)、0.1％至1％的4-羟基苯甲酸烷基酯(例如由 NipaLaboratories提供的商品名为Nipastat的混合物)、0.01％至0.1％的4-羟基 苯甲酸丁酯钠(由NipaLaboratories提供，商品名为Nipabutylsodium)和0.1％至 2％的苯氧基乙醇。

在一实施方案中，合适的凝胶包含半固体体系，其中液相限制于具有高度 交联的三维聚合基质中。液相可以包含水；以及期望量的本发明的化合物；0％ 至20％的诸如甘油、聚乙二醇或丙二醇的水-可混合的添加剂；和0.1％至10％、 优选0.5％至2％的增稠剂，其可以为选自包括但不限于黄蓍胶、果胶、角叉菜、 琼脂和藻酸的组的天然产物，或者选自包括但不限于甲基纤维素和聚羧乙烯(卡 巴普)的组的合成或半合成化合物；外加一种或多种防腐剂，其选自包括但不限 于例如0.1％至2％的4-羟基苯甲酸甲酯(羟苯甲酸甲酯)或苯氧基乙醇-各异 (differential)的组。另一合适的基质包含期望量的本发明的化合物；以及70％至 90％的聚乙二醇(例如根据美国国家处方集(U.S.NationalFormulary)(USNF)制备 的含有40％聚乙二醇3350和60％聚乙二醇400的聚乙二醇乳膏)、5％至20％的 水、0.02％至0.25％的抗氧化剂(例如，丁基化的羟基甲苯)和0.005％至0.1％的 螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))。

以上所用的术语软石蜡包括乳膏或软膏基质白软石蜡和黄软石蜡。术 语羊毛脂包括天然羊毛脂和纯化的羊毛脂。羊毛脂的衍生物特别地包括经化学 修饰以改变它们的物理或化学性质的羊毛脂；并且羊毛脂的合成等同物特别地 包括合成或半合成化合物和混合物，其是已知的并在制药和化妆品领域中用作 羊毛脂的替代选择，并且可以例如称为羊毛脂替代物。

可以使用的羊毛脂的一种合适的合成等同物为以商品名SoftisanTM提供的 称为Softisan649的材料。由DynamitNobelAktiengesellschaft提供的Sofisan649 为天然植物脂肪酸、异硬脂酸和己二酸的甘油酯；H.Hermsdorf在 Fette,Seifen,Anstrichmittel,IssueNo.84,No.3(1982),pp.3-6中讨论了它们的性质。 上述作为合适的软膏或乳膏基质成分的其他物质和它们的性质在诸如药典的 标准参考文献的工作中进行了讨论。西土马哥1000为式 CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH，其中m可以为15或17，并且n可以为20至24。 丁基化的羟基甲苯为2,6-二-叔丁基-对甲酚。Nipastat为4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟 基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸丁酯的混合物。

可以通过常规制药技术来制备本发明的组合物。因此，上述组合物例如可 以在优选60-70℃的升高温度下通过共同混合软石蜡；液体石蜡，若存在；以 及羊毛脂或其衍生物或合成等同物来方便地制备。随后可以将混合物冷却至室 温，并在添加莫匹罗星的水合结晶钙盐以及皮质类固醇和任何其他成分后，搅 拌以确保充分分散。

无论给药的方式，根据宿主的大致体重来计算具体剂量。确定涉及每种上 述制剂的的合适剂量所需的计算的进一步改进由本领域技术人员常规地 做出，并且在他们进行的常规任务的范围内而没有不合适的实验，特别是根据 本文所公开的剂量信息和测定。这些剂量可以通过使用用于与合适的剂量应答 数据联用来确定剂量的已建立的测定来确定。

可以利用已知的合成方法或经由已知合成方法的改进来容易地合成本发 明的酪氨酸酶抑制剂。如本领域技术人员容易地认识的，下述方法允许合成具 有多个取代基的化合物。本发明包括合成本文所述的化合物的方法。示例性合 成方法在以下实施例1-5中描述。

本发明包括通过使用一种或多种公开的化合物来预防或(例如缓解一 种或多种症状)医学疾病状况的方法。预防或方法包括向有需要的患者给予 有效量的本发明的酪氨酸酶抑制剂。本发明的组合物还可以用于预防性治 疗。

本发明提供了通过抑制酪氨酸酶活性或黑素的过量产生以改善所患病 症从而个体的方法。这样的方法包括给予个体有效量的本文所述的酪 氨酸酶抑制剂。

本文所用的“”描述了为了战胜疾病、疾病状况或病症的目的，对患者 的处理和照料，并且包括给予本发明的化合物以预防症状或并发症的发生，缓 解症状或并发症，或消除疾病、疾病状况或病症。更具体地，“”包括反转、 缓解、减少、抑制或停止疾病(病症)状态、疾病进展或其他异常疾病状况的至 少一种不良症状或影响。持续直至症状和/或病理学改善。

更具体地，本发明还提供了在有需要的个体中抑制黑素合成的方法。这 样的方法包括给予有效量的包含本发明的化合物的组合物。

本发明还提供了预防和与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病 和疾病状况的方法，所述方法包括内部或局部给予有需要的个体有效量的 本发明的化合物化合物。与黑素的过量产生或分布不均有关的疾病和疾病状 况包括但不限于由皮肤老化引起的素沉着斑点、黄褐斑、肝病、热灼伤和局 部创伤，由真菌、微生物和病毒感染引起的炎症疾病状况所导致的皮肤素沉 着，白癜风、癌、黑素瘤以及其他哺乳动物皮肤疾病状况。

所述方法还可以用于预防和由于暴露于太阳、紫外线(UV)辐射、化学 品、热、风和干燥环境所导致的皮肤暗和损伤。最终，所述方法可以用于预 防和皱纹、松弛的皮肤、眼睛周围的皱纹和黑眼圈，松弛敏感的皮肤，以 及预防和皮炎和其他过敏反应相关的皮肤疾病状况。

除了它们预防和皮肤如上所述的疾病和疾病状况的用途，本文所述的 组合物提供了有效的组合物，其获得了以下的益处：具有改善的肤、增 强的弹性、减少和延迟的老化、增强的年轻的外观和结构，以及增强的柔韧性、 硬度、光滑度和适应性的光滑及年轻的皮肤外观。

仍然在另一实施方案中，本发明的化合物衍生物可以用于食品工业以抑制 水果、蔬菜、汁和其他食品中的褐变和变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

以下实施例中所用的材料均可从市售渠道获得，其中，双孢蘑菇 (Agaricusbisporus)酪氨酸酶购自Sigma-Aldrich公司(T3824-50KU)；鼠黑素 瘤细胞B16-F1购自ATCC(CRL-6323)；人新生儿真皮成纤维细胞购自妙通(上 海)生物科技有限公司(2310)。采用中国专利申请CN201310192210.0中所 记载的方法制备式I所示的化合物。

实施例1测定酪氨酸酶抑制活性

将含有不同待测化合物浓度的60μL样品与100μL的含有1mML-酪氨酸的 磷酸缓冲液(pH6.8)混合。然后，加入40μL双孢蘑菇酪氨酸酶(100U/mL),37 ℃孵育25分钟。

通过450nm处的光吸收来监测有产物(多巴素)的积累，计算酪氨酸 酶抑制率(多巴素抑制率)。不添加待测化合物的对照组中，酪氨酸酶抑制 率为0。

结果

每组测试一式三份进行，实验结果如图1所示，图1中显示了本发明的化 合物对酪氨酸酶具有显著地抑制活性，IC50值约为8mM。

实施例2黑素生成抑制效果实验

在100μl的细胞生长培养基中，以2×105细胞/孔将B16-F1细胞接种至透 明底的96孔平板上。

细胞培养条件：DMEM/高葡萄糖，补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、10％透 析的胎牛血清、1％非必需氨基酸、50单位/mL的青霉素和50μg/mL的链霉素； 37℃，95％空气和5％CO2。

第二天向细胞培养液中加入待测化合物，待测化合物的终浓度分别为 1μM、10μM、100μM和1000μM，然后加入100nM的α-MSH，将细胞在37℃ 下保持24小时。培养完成后，加入120μL的1NNaOH在65℃下溶解黑素 1h。然后再405nm吸光度下检测黑素的含量。

结果

每组测试一式三份进行，实验结果如图2所示，在α-MSH的刺激下，B16-F1 细胞的黑素产量显著提高，而同时加入α-MSH和本发明化合物的实验组中， 黑素的产量明显降低，图2中显示了本发明的化合物对黑素产生的抑制效 果，其中对照组中没有添加α-MSH和待测化合物。在100μM的本发明化合物 存在的情况下，与仅添加了α-MSH的实验组相比，黑素产量降低了约40％。

实施例3皮肤增白效果实验

利用重建皮肤模型(购自MatTek公司，MelanodermTM)研究待测化合物 的皮肤增白效果。

在涂敷胶原蛋白的膜的表面共培养来自深皮肤供体的正常人表皮角质 形成细胞和正常人黑素细胞以形成多层、高度分化的皮肤组织。将该组织保 持在37℃的CO2培养箱中。将重建皮肤的顶部表面暴露于空气中，而底部表面 仍然与含有皮肤分化因子(EPI-100-NNM-113)的5mL维持培养基接触。

将测试化合物配制于80％的丙二醇水溶液中：将10mg每种测试化合物溶 于1mL丙二醇，0.2μm滤器除菌，并在无菌水/丙二醇中稀释至最终浓度为0.1％ (w/v)、0.2％(w/v)和0.4％(w/v)。将所有样品中丙二醇的浓度保持在80％。 对照组分别为：无菌水、80％丙二醇和水中的1％曲酸。

将测试化合物应用于培养组织的表面：10μl的待测化合物、10μl的80％丙 二醇(媒介物对照)、25μl的无菌水(阴性对照)和25μl的1％曲酸(阳性对照)。每 隔一天施用一次，持续15天，所有样品一式两份测试。

结果

在重建皮肤模型中进一步研究测试化合物的皮肤增白效果。该模型由正常 的人源表皮角质形成细胞和黑素细胞组成，将它们共培养以形成多层、高度 分化的人表皮。在该研究中，由高度素沉着的供体获得黑素细胞。

将不同浓度的测试化合物、80％的丙二醇(媒介物对照)、水(阴性对照)或1％ 的曲酸(阳性对照)重复地局部应用于重建皮肤的表面，持续15天。结果发现使 用0.2％浓度的本发明化合物即可表现出对皮肤黑素细胞显著的增白效果，而 没有引起细胞形态任何可检测的变化。实验开始后，0.2％浓度实验组在第5天 可观察到明显的对皮肤模型的增白的效果，0.4％浓度实验组在第3天即可观察 到对皮肤模型的增白的效果。

实施例4防止紫外线损伤实验

细胞培养

细胞使用市售的人新生儿真皮成纤维细胞。所述细胞以2×105个/mL接种 于培养皿中，在培养基D-MEM(1g/L葡萄糖)中添加10％胎牛血清(培养基I) 进行培养。培养条件为，37℃、5％CO2及饱和水蒸气条件下培养24小时。

然后，将培养基更换为BSO培养基(培养基II)，添加有0.001％的作为谷 胱甘肽的生物合成抑制剂的BSO(L-buthionine-(S，R)-sulfoximine)，在37℃、5 ％CO2及饱和水蒸气条件下培养24小时。所述BSO培养基如下配制：将乙醇 中溶解有0.1％BSO的保存用原液在所述普通培养基中稀释100倍。

在照射紫外线24小时前，更换为添加有100μL的本发明化合物溶液的BSO 培养基(培养基II)。将不添加化合物的作为阴性对照。

将氯化铁按照0.002％(重量)的浓度溶解至蒸馏水中，用含有钙离子、 镁离子的磷酸缓冲液PBS(+)稀释200倍后，作为培养基III，预先加热至37℃ 备用。

在照射UV-A前将培养基置换为培养基III。在除去培养皿盖的状态下，从 培养皿的上方大约30cm处，以10J/cm2照射320nm至400nm的紫外线。阳性 对照不照射紫外线，取阳性对照组的活细胞率为100％。

然后，按照最终浓度为10％的方式向培养基中添加阿尔玛蓝 (alamarBlue)，3小时后，按照AhmedS.A.等(J.Immunol.Method.170， 211-224(1994))的方法、及制造商的说明书以激发波长544nm、荧光波长590nm 测定上清的荧光强度并计算活细胞率(％)。

表2防止紫外线损伤实验

样品 活细胞率(％)

阳性对照 100

阴性对照 38

A 54

B 68

C 70

D 73

E 76

实验组A-F中，测试体系中待测化合物的终浓度分别为4mM、8mM、16 mM、32mM、64mM。

由以上的结果可知，本发明化合物能显著增强细胞对紫外线的耐受水平， 能够增加活细胞率，减轻细胞死亡。与阴性对照组相比，在8mM浓度下即能 提高30％的活细胞率。

实施例5化妆品组合物的制备

按下表所示的成分配制化妆品组合物，表中各组分为重量份数。首先按照 下表中的配比分别配制组分I、II和III，然后将组分I、II和III搅拌混合即得 化妆品组合物。此化妆品组合物呈白半透明粘稠液体状，质地轻薄水润，气 味清新。使用时无油腻感，延展性佳，吸收迅速，使用后肌肤清爽水润透亮。

长期使用后可明显改善面部细纹、黯哑、素沉积、皮肤松弛、毛孔粗大、 黑头等现象，面部皮肤白皙、水嫩、细腻、紧致、光滑，肤均一透亮。此化 妆品组合物经稳定性试验后外观质地及肤感无变化，稳定性良好。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员 无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领 域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的 实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。