一种制备索马鲁肽的方法

一种制备索马鲁肽的方法

技术领域：

本发明提供一种合成索马鲁肽的方法，这种合成方法能够实现索马鲁肽的大规模 的化学合成生产以及药物的申报。

技术背景：

GLP-1胰高血糖素样肽，是肠促胰岛素(incretin)的一族，由肠道L细胞分泌，是一 种在餐后分泌的激素、有助于控制血糖，主要代谢反应是，随餐后血糖水平升高而释放并刺 激胰岛素产生、抑制胰高血糖素释放和减缓营养物被吸收进入血液的速率。但是由于GLP-1 在体内迅速被一种酶(DPP-4)所失活和降解，GLP-1无法作为药物直接使用到人体来进行血 糖的控制。

GLP-1类似物也是GLP-1受体激动剂，其活性类似于GLP-1，与GLP-1受体具有高度 亲和性，能够模拟人体内天然的胃肠激素促进胰岛素分泌及调控血糖等。

目前已经上市的GLP-1受体激动剂包括艾塞那肽(Exenatide)、利拉鲁肽 (Liraglutide),利司那肽(Lixisenatide)，阿必鲁肽(Albiglutide)，度拉糖肽 (Dulaglutide)，这些药物一经上市就成为广大糖尿病人的福音，但是这些药物由于过度依 赖注射，在病人的使用上仍然具有较大的局限性。

索马鲁肽(Semaglutide CAS：910463-68-2)是诺和诺德公司研发的每周一次皮下 注射的长效GLP-1类似物，临床三期阶段的研究刚刚结束。从三期临床的结果来看，0.5mg和 1mg的每次注射量能够有效降低HbA1c,并且能够有效的降低体重，除了开发作为一种皮下 注射药物，诺和诺德也正在开发Semaglutide的口服版本OG217SC，这是每日口服一次的片 剂。

从结构上看，Semaglutide是GLP-1(7-37)链上8位Aib取代了Ala，34位Arg取代了 Lys，26位上Lys接上了十八烷二酸脂肪链，谷氨酸和短链的PEG修饰。PEG修饰后不但可以与 白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长效的 目的，其结构如下：

目前多肽药物最有效的化学合成方法是固相合成Fmoc法，也就是从多肽的-COOH 开始，将第一个氨基酸连接到树脂上后，除去氨基酸N端的Fmoc保护基，按照顺序，偶联下一 个氨基酸，脱去N端保护，再偶联，再脱保护的方式直到最后一个N端氨基酸的偶联完成后， 将多肽从树脂上裂解下来同时去除所有的保护基就可以得到一条完整的多肽，这个方法在 序列长度为10-25个的多肽合成中优势非常明显。

对于多肽药物生产企业的研发人员来说，索马鲁肽采用常规的固相合成方法具有 很大的合成挑战性，主要体现在序列His⁷与Lys²⁶之间的大量疏水性氨基酸的存在使得肽链 之间氢键稳固，产生严重的β折叠，肽链与肽链之间的作用力增强，引起树脂缩聚，增加了氨 基酸偶联的难度，降低了偶联的反应活性和效率，使得缩聚之后的每一步都举步维艰，这是 索马鲁肽合成中的主要问题，也使得化学合成索马鲁肽的产业化开发进程变得特别困难。

在面对单次偶联不完全时，研发人员一般采用多次重复偶联的方式保证每一个氨 基酸偶联反应完成，这样生产的第一个后果是大量缺损肽和多片段肽的产生，例如+Ser (17),+Ala(24),+Gly(22),+Gly(10),-His⁷,-Aib⁸,-Gly⁹,-Gly¹⁰,-Gln²³,-Ala²⁴,这些杂质 从结构上来说和产品之间只有一个氨基酸的区别，其化学性质跟产品之间相差甚微，在液 相上甚至重叠在一起，导致在纯化过程中难度大大增加。如果这些杂质被带入最终的产品 中，就需要对这些杂质在药物中的毒性做复杂而详尽的研究，甚至会影响药物的药效一致 性，如果要将杂质除尽，则对最终收率产生巨大的影响，这经常使得纯化人员处于两难的境 地。重复偶联除了引起多肽序列上的氨基酸的增减外，另一个重要的副反应就是容易引入 消旋杂质，特别是在多肽远离树脂的N端，在重复偶联之后，N端的His极其容易发生消旋，这 在索马鲁肽合成的过程中是一个无法回避的问题，Semaglutide(D-His⁷)杂质的存在能够 大大降低产品的质量，对于目前FDA对于化学合成多肽单一消旋杂质≤0.1％的要求，如果 不采取有效的手段避免这一系列问题，Semaglutide大批量化学方法合成以及未来的药物 申报就很难成为现实。

缩聚除了会引起副反应之外，还有一个重要的问题就是树脂的替代度受到很大的 限制，越是缩聚严重的多肽，合成的过程中所选用的树脂的替代度就必须越低，这样才能尽 可能保证氨基酸偶联的完成，低替代度的树脂也就意味着单批生产量就会大大降低，成本 成倍增加，这就非常不利于索马鲁肽药物的产业化。

从多肽的结构来看，要解决多肽合成中的缩聚问题，就必须要打破长肽合成中的 肽链之间的氢键缔和，目前在多肽研发过程中解决树脂缩聚的最常用的方法为插入Fmoc- (Hmb)Gly-OH及其二肽或者Fmoc-(Dmb)Gly-OH及其二肽，另一种常见的方法就是在合成多 肽的过程中插入Pseudoproline的伪二肽来解决多肽缩聚的问题，这些氨基酸或者二肽的 工作原理是其结构N上的H被取代后，能够保证其后的一段肽链合成中打破了肽序列中的氢 键缔和，起到解决多肽缩聚的作用。但是这些方法的使用在实际过程中会带来一些新的问 题，例如这些氨基酸和二肽的合成困难，例如在将这些序列插入多肽时由于其本身位阻较 大，增加了其本身偶联的难度，带来了新的杂质。

发明内容：

本专利的发明方法能够有效打破索马鲁肽合成过程中的β折叠的二级结构，避免 了多肽合成过程中的缩聚问题，保证每个氨基酸能够一次性偶联完成，降低了产品的合成 难度，避免了多种杂质的生成，保证了药物多肽索马鲁肽原料药的产品质量，增加了产品的 收率，提高了单批生产索马鲁肽的规模，该方法能够使得索马鲁肽的大批量的生产成为现 实。

本发明方法在His⁷与Lys²⁶之间采用两个手段联合打破整条肽链之间由于氢键缔 和引起的β折叠，第一个手段是在Lys²⁶的位置将侧链偶联好，位阻大的侧链能够很好的将肽 链在一定范围内保持在松散的状态，方便其后一段序列内氨基酸的偶联，第二个手段就是 在(Gly¹⁰-Thr¹¹)，(Phe¹²-Thr¹³)，(Thr¹³-Ser¹⁴)，(Val¹⁶-Ser¹⁷)，(Ser¹⁷-Ser¹⁸)五个位置中的 一个用O-异酰化二肽取代，完全消除其前后一段的肽链之间的氢键缔和，在第一个手段之 后承接打破多肽聚合的作用，保证索马鲁肽整条序列的高效偶联反应。

本发明提供的方法包括采用以下几个步骤：

(1)获得结构式I所示结构的化合物。

(2)取树脂活化后，逐步偶联Gly³⁷,Arg³⁶,Gly³⁵,Arg³⁴,Val³³,Leu³²,Trp³¹,Ala³⁰, Ile²⁹,Phe²⁸,Glu²⁷后形成第一肽树脂。

(3)取第一树脂，偶联Lys²⁶及其侧链，脱去Lys²⁶主链氨基保护基，得到第二肽树 脂。

(4)取第二肽树脂，偶联相应的氨基酸或者O-异酰化二肽后脱除氨基保护基构成 第三肽树脂。

(5)将第三肽树脂经过裂解得到酯化索马鲁肽。

(6)将酯化索马鲁肽进行O→N转移反应，就可以得到粗品索马鲁肽，经过纯化得到 纯品索马鲁肽。

作为优选，步骤(2)中采用Wang树脂或者2-CTC树脂。

作为优选，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中采用偶联试剂为以下组合中的一种：DIC/ HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt/DIPEA、HATU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA，溶剂选用DMF、 NMP、MDC、DMSO中的一种，作为最优选，肽树脂/AA/DIC/HOBt的最优比例是肽1:(2-6):(3- 8):(3-8)。

作为优选，在第一肽树脂的形成过程中,27-37的氨基酸分别采用Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc- Trp(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH。

作为优选，Lys²⁶及侧链的偶联有两种方法，方法一是在第一肽树脂上偶联R’-Lys (Fmoc)-OH(R’＝ivDde，Dde,Mtt，Mmt，Alloc等氨基保护基)，然后脱除侧链保护基Fmoc，依 次偶联Fmoc-AEEA-OH,Fmoc-AEEA-OH,Fmoc-Glu-OtBu,HOOC-(CH₂)₁₆-COOtBu，脱除Lys²⁶主链 氨基上的保护基R’后，得到第二肽树脂。方法二是直接选用Fmoc-Lys(COOtBu-(CH₂)₁₆- isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-OH偶联，偶联完成后脱除Fmoc就得到第二肽树脂。

作为优选，序列中7-25位的氨基酸，O-异酰化二肽之外的氨基酸选用Fmoc-Ala- OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp (OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH。

作为优选，序列中所使用到的O-异酰化二肽为Boc-Thr(Fmoc-Gly)-OH,Boc-Thr (Fmoc-Phe)-OH,Boc-Ser(Fmoc-Val)-OH,Boc-Ser(Fmoc-Thr(tBu))-OH,Boc-Ser(Fmoc-Ser (tBu))-OH中的一种，其中最优选Boc-Thr(Fmoc-Gly)-OH。

作为优选，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中的偶联反应温度为10-50℃,最优选温度 为20-30℃。

作为优选，裂解液选用TFA/苯甲硫醚/甲硫醚/EDT的混合溶液，其溶液比例为(85- 92.5)％/(3-7.5)％/(2-4)％/(1-3)％，最优选比例为90:5:3:2

作为优选，裂解温度选择15-50℃，裂解时间为1-4小时，最优选2.5小时。

作为优选，酯键向酰胺键转移选用PBS缓冲溶液(pH7-9.5)、碳酸钠、碳酸氢钠、氢 氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵。

作为优选，脱除Fmoc选用18-25％的/DMF溶液，最优选20％的/DMF溶液。

本文中用到的一些缩写具有以下含义：

具体实施方式：

本发明中，所有的原料、试剂及仪器都是市面购得或者本领域常用。

下面通过具体实例，对本发明之前的内容作一些具体的阐述

实施例一 Fmoc-Gly³⁷-Wang树脂的合成

称取替代度为0.82mmol/g的Wang树脂150g，加入到固相反应容器中，用DMF洗涤三 次后，加入DMF溶胀30分钟，将36.6g Fmoc-Gly-OH、19.6g HOBt和72.0mL的DIC在低温下活 化15分钟加入，鼓氮气反应5分钟后，加入1.9gDMAP，反应2个小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗 涤3次，用480mL的1：1/吡啶溶液封端3小时后，用DMF洗涤树脂5遍后，DCM洗涤2遍，加 入甲醇收缩树脂，干燥，得到Fmoc-Gly-OH Wang树脂172.8g，用紫外分光光度计法检测其替 代度为0.39mmol/g。

实施例二 第一肽树脂的合成

称取替代度为0.39mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂45g加入固相反应容器，用DMF洗 涤三次后加入DMF溶胀30分钟后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次，用 DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(34.1g,52.65mmol),HOBt (7.15g,52.65mmol)和DIC(6.7g,52.65mmol)在低温的DMF中活化15分钟后，加入到树脂中， 室温下反应2个小时后，用茚三酮方法检测树脂呈现无，表示反应完成，用DMF洗涤4次后， 用DCM洗涤两次。

重复上述脱除Fmoc和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照索马鲁肽上的序列，依次 完成Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu (OtBu)-OH的偶联，得到第一肽树脂，其序列为Glu²⁷(OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)- Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷-Wang树脂。

实施例三 以Mtt-Lys(Fmoc)-OH为原料合成第二肽树脂

称取Mtt-Lys(Fmoc)-OH(43.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g, 70.2mmol),在低温下活化15分钟后，加入到第一肽树脂中，反应2小时后，用茚三酮检测树 脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半 小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称取Fmoc-AEEA-OH (27.0g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol),在低温下活化15分钟后， 加入到肽树脂中，反应2小时后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍， 用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后， 茚三酮检测树脂呈现蓝。称取Fmoc-AEEA-OH(20.25g,52.6mmol),DIC(6.7g,52.6mmol), HOBt(7.1g,52.6mmol),在低温下活化15分钟后，加入到肽树脂中，反应2小时后，用茚三酮 检测树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液， 反应半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称取Fmoc-Glu- OtBu(22.4g,52.6mmol),DIC(6.7g,52.6mmol),HOBt(7.1g,52.6mmol),在低温下活化15分 钟后，加入到肽树脂中，反应2小时后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂 4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次 后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称取HOOC(CH₂)₁₆COOtBu(22.3g,52.6mmol),DIC(6.7g, 52.6mmol),HOBt(7.1g,52.6mmol),在低温下活化15分钟后，加入到肽树脂中，反应2小时 后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成。向树脂中加入1.5％的TFA/DMF溶液，在室温下反 应半小时后，用茚三酮检测树脂呈蓝，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后就 可以得到第二肽树脂，其序列为Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷ (OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷- Wang树脂。

实施例四 以Alloc-Lys(Fmoc)-OH为原料合成第二肽树脂

称取Alloc-Lys(Fmoc)-OH(31.8g,70.2mmol),HBTU(26.6g,70.2mmol),DIPEA (9.1g,70.2mmol),加入到第一肽树脂中，室温反应0.5小时后，用茚三酮检测树脂为无， 反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用 DMF洗涤5次，用DCM洗涤1次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称取Fmoc-AEEA-OH(20.25g, 52.6mmol),HBTU(19.9g,52.6mmol),DIPEA(6.8g,52.6mmol),加入到肽树脂中，反应0.5小 时后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％ DMF溶液，反应半小时，用DMF洗涤5次，用DCM洗涤1次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称 取Fmoc-AEEA-OH(20.25g,52.6mmol),HBTU(19.9g,52.6mmol),DIPEA(6.8g,52.6mmol),加 入到肽树脂中，反应0.5小时后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂5遍， 用DCM洗涤1遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后， 茚三酮检测树脂呈现蓝。称取Fmoc-Glu-OtBu(22.4g,52.6mmol),HBTU(19.9g, 52.6mmol),DIPEA(6.8g,52.6mmol),加入到上述肽树脂中，反应0.5小时后，用茚三酮检测 树脂为无，反应完成，用DMF洗涤树脂4遍，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应 半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝。称取HOOC(CH₂)₁₆COOtBu(22.3g,52.6mmol),HBTU(19.9g,52.6mmol),DIPEA(6.8g,52.6mmol),加入到肽树 脂中，反应1小时后，用茚三酮检测树脂为无，反应完成。向树脂中加入5％的Pd(PPh₃)₄， 50％的苯硅烷，在室温下反应半小时后，用茚三酮检测树脂呈蓝，加入铜清除剂，反应10 分钟后，用DMF洗涤8次，用DCM洗涤4遍后就可以得到第二肽树脂，其序列为Lys²⁶(COOtBu- (CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷(OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²- Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷-Wang树脂。

实施例五 用Fmoc-Lys(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-OH合成第二 肽树脂

将Fmoc-Lys(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)(42.5g,35.1mmol)，DIC (6.7g,52.6mmol),HOBt(7.1g,52.6mmol)在低温活化后，加入到第一肽树脂中，在室温下反 应5个小时后，用茚三酮检测树脂呈现透明无，用DMF洗涤5次，用DCM洗涤2遍后，加入20％ DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝， 得到第二肽树脂，其序列为Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷ (OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷- Wang树脂。

实施例六 用Boc-Ser(Fmoc-Ser(tBu))-OH合成第三肽树脂a

将Fmoc-Ala-OH(21.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol) 在DMF中低温活化后，加入到第二肽树脂中，室温反应两个小时后，茚三酮检测树脂无透 明，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次， 用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝，按照索马鲁肽的序列顺序，分别偶联Fmoc- Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr (tBu)-OH后将Boc-Ser(Fmoc-Ser(tBu))-OH(20.0g,35.1mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt (9.5g,70.2mmol)在低温下的DMF中活化后加入到树脂中，在室温下搅拌4.5小时后，茚三酮 方法检测反应已经完成，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2次后继续偶联Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp (OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH后得到第三肽树脂a，其 序列为Boc-Ser¹⁸(Boc-His⁷(Trt)-Aib⁸-Glu⁹(OtBu)-Gly¹⁰-Thr¹¹(tBu)-Phe¹²-Thr¹³(tBu)- Ser¹⁴(tBu)-Asp¹⁵(OtBu)-Val¹⁶-Ser¹⁷(tBu))-Tyr¹⁹(tBu)-Leu²⁰-Glu²¹(OtBu)-Gly²²-Gln²³ (Trt)-Ala²⁴-Ala²⁵-Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷(OtBu)-Phe²⁸- Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷-Wang树脂

实施例七 用Boc-Ser(Fmoc-Val)-OH合成第三肽树脂b

将Fmoc-Ala-OH(21.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol) 在DMF中低温活化后，加入到第二肽树脂中，室温反应两个小时后，茚三酮检测树脂无透 明，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次， 用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝，按照索马鲁肽的序列顺序，分别偶联Fmoc- Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH后将Boc-Ser(Fmoc-Val)-OH(18.5g,35.1mmol), DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol)在低温下的DMF中活化后加入到树脂中，在室 温下搅拌4.5小时后，茚三酮方法检测反应已经完成，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2次后继续 偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr (tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH后得到第三 肽树脂b，其序列为Boc-Ser¹⁷(Boc-His⁷(Trt)-Aib⁸-Glu⁹(OtBu)-Gly¹⁰-Thr¹¹(tBu)-Phe¹²- Thr¹³(tBu)-Ser¹⁴(tBu)-Asp¹⁵(OtBu)-Val¹⁶)-Ser¹⁸(tBu)-Tyr¹⁹(tBu)-Leu²⁰-Glu²¹(OtBu)- Gly²²-Gln²³(Trt)-Ala²⁴-Ala²⁵-Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷ (OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷- Wang树脂

实施例八 用Boc-Ser(Fmoc-Thr(tBu))-OH合成第三肽树脂c

将Fmoc-Ala-OH(21.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol) 在DMF中低温活化后，加入到第二肽树脂中，室温反应两个小时后，茚三酮检测树脂无透 明，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次， 用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝，按照索马鲁肽的序列顺序，分别偶联Fmoc- Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp (OtBu)-OH后将Boc-Ser(Fmoc-Thr(tBu))-OH(20.5g,35.1mmol),DIC(8.9g, 70.2mmol), HOBt(9.5g,70.2mmol)在低温下的DMF中活化后加入到树脂中，在室温下搅拌4.5小时后，茚 三酮方法检测反应已经完成，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2次后继续偶联Fmoc-Phe-OH,Fmoc- Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH后得到第 三肽树脂c，其序列为Boc-Ser¹⁴(Boc-His⁷(Trt)-Aib⁸-Glu⁹(OtBu)-Gly¹⁰-Thr¹¹(tBu)-Phe¹²- Thr¹³(tBu))-Ser¹⁴(tBu)-Asp¹⁵(OtBu)-Val¹⁶-Ser¹⁷(tBu)-Ser¹⁸(tBu)-Tyr¹⁹(tBu)-Leu²⁰- Glu²¹(OtBu)-Gly²²-Gln²³(Trt)-Ala²⁴-Ala²⁵-Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA- AEEA)-Glu²⁷(OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶ (Pbf)-Gly³⁷-Wang树脂

实施例九 用Boc-Thr(Fmoc-Phe)-OH合成第三肽树脂d

将Fmoc-Ala-OH(21.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol) 在DMF中低温活化后，加入到第二肽树脂中，室温反应两个小时后，茚三酮检测树脂无透 明，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次， 用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝，按照索马鲁肽的序列顺序，分别偶联Fmoc- Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp (OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OHH后将Boc-Thr(Fmoc-Phe)-OH(20.6g,35.1mmol),DIC(8.9g, 70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol)在低温下的DMF中活化后加入到树脂中，在室温下搅拌 4.5小时后，茚三酮方法检测反应已经完成，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2次后继续偶联Fmoc- Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH后得到第 三肽树脂d，其序列为Boc-Thr¹³(Boc-His⁷(Trt)-Aib⁸-Glu⁹(OtBu)-Gly¹⁰-Thr¹¹(tBu)- Phe¹²)-Ser¹⁴(tBu)-Asp¹⁵(OtBu)-Val¹⁶-Ser¹⁷(tBu)-Ser¹⁸(tBu)-Tyr¹⁹(tBu)-Leu²⁰-Glu²¹ (OtBu)-Gly²²-Gln²³(Trt)-Ala²⁴-Ala²⁵-Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)- Glu²⁷(OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)- Gly³⁷-Wang树脂

实施例十 用Boc-Thr(Fmoc-Gly)-OH合成第三肽树脂e

将Fmoc-Ala-OH(21.9g,70.2mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol) 在DMF中低温活化后，加入到第二肽树脂中，室温反应两个小时后，茚三酮检测树脂无透 明，用DMF洗涤4次，用DCM洗涤2遍后，加入20％DMF溶液，反应半小时后，用DMF洗涤3次， 用DCM洗涤3次后，茚三酮检测树脂呈现蓝，按照索马鲁肽的序列顺序，分别偶联Fmoc- Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH后将Boc-Thr(Fmoc-Gly)- OH(17.5g,35.1mmol),DIC(8.9g,70.2mmol),HOBt(9.5g,70.2mmol)在低温下的DMF中活化 后加入到树脂中，在室温下搅拌4.5小时后，茚三酮方法检测反应已经完成，用DMF洗涤4次， 用DCM洗涤2次后继续偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(Trt)-OH后得到第三 肽树脂e，其序列为Boc-Thr¹¹(Boc-His⁷(Trt)-Aib⁸-Glu⁹(OtBu)-Gly¹⁰)-Phe¹²-Thr¹³(tBu)- Ser¹⁴(tBu)-Asp¹⁵(OtBu)-Val¹⁶-Ser¹⁷(tBu)-Ser¹⁸(tBu)-Tyr¹⁹(tBu)-Leu²⁰-Glu²¹(OtBu)- Gly²²-Gln²³(Trt)-Ala²⁴-Ala²⁵-Lys²⁶(COOtBu-(CH₂)₁₆-isoGlu(OtBu)-AEEA-AEEA)-Glu²⁷ (OtBu)-Phe²⁸-Ile²⁹-Ala³⁰-Trp³¹(Boc)-Leu³²-Val³³-Arg³⁴(Pbf)-Gly³⁵-Arg³⁶(Pbf)-Gly³⁷- Wang树脂

实施例十一 第三肽树脂的裂解

将实施例六所得到的第三肽树脂a取35g加入到反应釜中，TFA：苯甲硫醚：苯甲醚： EDT＝90:5:2:3的体积比配成的裂解液350mL加入到树脂中，室温反应2.5小时后，反应结 束，过滤除去树脂，将滤液收集，将滤液倒入到10倍体积的冷乙醚中析出沉淀，离心，用冷的 乙醚溶液洗涤沉淀，沉淀真空干燥8小时后，得到14.6g酯化索马鲁肽粗品a,收率86.4％。

将实施例七所得到的第三肽树脂b加入到反应釜中，TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝ 90:5:2:3的体积比配成的裂解液加入到树脂中，室温反应2.5小时后，反应结束，过滤除去 树脂，将滤液收集，将滤液倒入到10倍体积的冷乙醚中析出沉淀，离心，用冷的乙醚溶液洗 涤沉淀，沉淀真空干燥8小时后，得到14.9酯化索马鲁肽粗品b，收率88.2％。

将实施例八所得到的第三肽树脂c加入到反应釜中，TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝ 90:5:2:3的体积比配成的裂解液加入到树脂中，室温反应2.5小时后，反应结束，过滤除去 树脂，将滤液收集，将滤液倒入到10倍体积的冷乙醚中析出沉淀，离心，用冷的乙醚溶液洗 涤沉淀，沉淀真空干燥8小时后，得到14.5g酯化索马鲁肽粗品c，收率85.8％。

将实施例九所得到的第三肽树脂d加入到反应釜中，TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝ 90:5:2:3的体积比配成的裂解液加入到树脂中，室温反应2.5小时后，反应结束，过滤除去 树脂，将滤液收集，将滤液倒入到10倍体积的冷乙醚中析出沉淀，离心，用冷的乙醚溶液洗 涤沉淀，沉淀真空干燥8小时后，得到13.7g酯化索马鲁肽粗品c,收率81.1％。

将实施例十所得到的第三肽树脂e加入到反应釜中，TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝ 90:5:2:3的体积比配成的裂解液加入到树脂中，室温反应2.5小时后，反应结束，过滤除去 树脂，将滤液收集，将滤液倒入到10倍体积的冷乙醚中析出沉淀，离心，用冷的乙醚溶液洗 涤沉淀，沉淀真空干燥8小时后，得到16.2g酯化索马鲁肽粗品c,收率95.9％。

实施例十二 酯化索马鲁肽的转移反应

将实施例十一中得到的14.6g酯化索马鲁肽a加入到pH＝8.0的PBS缓冲液中，过滤 除去不溶物，在室温下搅拌90分钟后，HPLC检测显示O→N的转移反应已经完成，所有的酯化 索马鲁肽都已经转化为索马鲁肽。

将实施例十一中得到的14.9g酯化索马鲁肽b加入到pH＝8.0的PBS缓冲液中，过滤 除去不溶物，在室温下搅拌90分钟后，HPLC检测显示O→N的转移反应已经完成，所有的酯化 索马鲁肽都已经转化为索马鲁肽。

将实施例十一中得到的14.5g酯化索马鲁肽c加入到pH＝8.0的PBS缓冲液中，过滤 除去不溶物，在室温下搅拌90分钟后，HPLC检测显示O→N的转移反应已经完成，所有的酯化 索马鲁肽都已经转化为索马鲁肽。

将实施例十一中得到的13.7g酯化索马鲁肽d加入到pH＝8.0的PBS缓冲液中，过滤 除去不溶物，在室温下搅拌90分钟后，HPLC检测显示O→N的转移反应已经完成，所有的酯化 索马鲁肽都已经转化为索马鲁肽。

将实施例十一中得到的16.2酯化索马鲁肽e加入到pH＝8.0的PBS缓冲液中，过滤 除去不溶物，在室温下搅拌90分钟后，HPLC检测显示O→N的转移反应已经完成，所有的酯化 索马鲁肽都已经转化为索马鲁肽。

实施例十三 索马鲁肽的纯化

将索马鲁肽的PBS溶液上样到Waters 2545RP制备液相上，谱柱为50x250mm反向 C18柱，柱温35度，波长220nm，A流动相0.05％HCl溶液，B流动相90％的乙腈水溶液，用A流动 相冲洗掉1个柱体积后，提高B流动相的比例，收集>95％纯度的组分，将该组分重新上到纯 化柱上，A流动相为醋酸铵体系，B流动相为90％的乙腈水溶液，收集大于98％的组分冻干， 通过不同的酯化索马鲁肽得到的收率如下表。

纯产品量(g) 收率

酯化索马鲁肽a 5.28 31.2％

酯化索马鲁肽b 6.21 36.7％

酯化索马鲁肽c 4.65 27.5％

酯化索马鲁肽d 5.05 29.9％

酯化索马鲁肽e 6.27 37.1％