稳定的DOTAP氯化物晶形

稳定的DOTAP氯化物晶形

本发明涉及对映体纯的DOTAP氯化物和外消旋和对映体纯DOTAP 氯化物的晶形(crystal modification)、其制备方法及其制备药物 组合物的用途。

上下文中的DOTAP氯化物表示N，N，N-三甲基-2，3-双[[(9Z)-1-氧 代-9-十八碳烯基]氧基]-1-丙烷铵氯化物，也称(Z，Z)-N，N，N-三甲基 -2，3-双[(1-氧代-9-十八碳烯基)氧基]-1-丙铵氯化物或1，2-二油酰 氧基-3-三甲基铵丙烷氯化物，及其水合物。

C₄₂H₈₀ClNO₄，               M_w 698.54

CAS编号：132172-61-3和477274-39-8(外消旋物)、197974-73-58 (外消旋物，一水合物)、428506-51-8(2S型)、328250-28-8(2R 型)。

脂质体是合成的多层囊(球状自含膜)，包含两亲性物质，通常 为天然脂质，其中亲水性物质可以包封在水性内层中，并且亲脂性物 质可以掺入到脂质膜内部。

它们特别被用在化妆品和药物中，尤其是皮肤病学科。特别是将 维生素、辅酶、皮肤护理剂和防晒剂进行包埋。脂质体一般是局部应 用的。

不过，脂质体在药物技术中逐渐发挥更多的重要性，因为脂质体 的肠胃外应用能够实现比以自由溶解形式使用的活性化合物更加特异 性的器官分布。

如果掺入DNA、RNA或蛋白质，则得到脂质体复合物(lipoplexes)。

油类的加入和高压均质化器的使用能够迫使脂质体形成所谓的纳 米粒子(纳米粒)。这些粒子的大小与脂质体大致相同，但是在其内 部不具有水相，而代之以油相。它们特别适合于包封亲脂性物质。

微乳是胶态分散的单相系统，其包含水性、脂质样和表面活性剂 组分。它们的粒径为1-500nm，并且行为方式与液体相似。

尤其关于肽类活性化合物、核苷酸、疫苗和其它生物药物，它们 在正常情况下的溶解性较差，增溶效应在上述应用的情况下具有非常 巨大的重要性。

另外，以这种方式能够延缓活性化合物在体内的降解并实现持续 释放效应。

DOTAP氯化物属于阳离子脂质类。与天然存在的磷脂相反，它们 不具有两性离子特征。包含阳离子脂质、无论单独还是组合有磷脂或 其它脂质样化合物的脂质体都具有带正电的表面。这对于具有带负电 地外部表面的细胞、例如内皮细胞产生很高的亲和性。

不过，特别重要的是DOTAP类与其它阳离子脂质体和脂质体复合 物穿透细胞、并由此向细胞内部运输其中所掺入的活性化合物(转染) 的能力。

所有这些性质都使DOTAP氯化物也非常受关注于癌症疗法。这些 性质为应用掺入在阳离子DOTAP脂质体中的常规细胞抑制剂提供可能 性。

从文献中可以充分知晓DOTAP氯化物和其它DOTAP盐的转染性质， 例如乙酸盐、溴化物、磷酸二氢盐、硫酸氢盐、碘化物、甲磺酸盐、 甲基硫酸盐、三氟乙酸盐、硫酸盐或二硫酸盐和三氟甲磺酸盐。

DOTAP磷酸二氢盐和DOTAP甲磺酸盐仅作为外消旋物在文献中被 提及。所有其它上述盐各自作为外消旋物和2S-对映体被提及，另外 提到氯化物和甲基硫酸盐的2R-对映体。

在一些体外研究中，其它的盐、例如DOTAP甲基硫酸盐已经达到 比DOTAP氯化物更好的转染率。

不过在体内使用中，在活体内发生脂质体表面上的阴离子交换， 这意味着这里不出现其它盐的优点。尤其在人类医药用途中，特别是 肠胃外应用，具有生理学上可接收的阴离子的DOTAP盐、例如相应的 氯化物或乙酸盐因此是优选的。

医药、特别是肠胃外应用对于所用活性化合物和助剂的质量和纯 度有最高的要求。因此，主管部门关于这些化合物的制备、制备再现 性和副产物情况有非常严格的规定。在肠胃外用物质的情况下，必须 另外严格避免和控制病原性微生物和内毒素带来的微生物污染。

DOTAP氯化物和其它DOTAP盐是极其不稳定的，因此本身难以以 可接受的纯度进行制备以使它们适合用于药物制备。

象所有携带油酸原子团的脂质一样，例如天然磷脂DOPC和DOPE， 所有DOTAP盐对于氧化作用非常敏感。不过，不饱和脂肪酸衍生物的 氧化产物一般具有很高的毒性。

这里需要适合的制备和纯化方法。例如，DOTAP乙酸盐为高沸点 油的形式，因此在工业上以足够的质量获得它是非常困难的。

克服所述不稳定性的常规方法、例如加入抗坏血酸或还原L-谷胱 苷肽形式的抗氧化剂大大限制了DOTAP氯化物的普遍可用性，因为不 能排除与后来被包埋的活性化合物的相互作用。在制备、贮存和使用 期间完全排除氧实际上是不可能的，或者仅在非常巨大的努力下才有 促进作用。

DOTAP氯化物在商业上仅可获得氯仿溶液或无定形固体。

除了它的氧化敏感性以外，无定形DOTAP氯化物在极短时间内、 在正常大气湿度水平下也是极其吸湿和潮解的，得到油腻的薄膜。这 使这种化合物的处理更加困难。

因而，无定形DOTAP氯化物的制造商一般推荐在-20℃保护性气 体下贮存，并且仅保证约6个月的货架寿命。

文献仅披露过制备无定形、外消旋DOTAP氯化物的各种合成途径：

Eibel和Unger在DE4013632A1中概述了DOTAP氯化物的合成， 在氯仿/甲醇/含水HCl溶剂系统中进行DOTAP溴化物的离子交换，继 之借助谱纯化。DOTAP溴化物是预先从1-溴-2，3-二油酰氧基丙烷就 地制得的。

Leventis和Silvius在Biochim.Biophys.Acta，1023(1990) 124-132中报道了DOTAP氯化物的合成，在两相溶剂/NaCl溶液系统中 进行DOTAP碘化物的离子交换。DOTAP碘化物是预先借助甲基 化相应的二甲氨基化合物而制得的。

Nantz等在Biochim.Biophys.Acta，1299(1996)281-283，J. Med.Chem.40(1997)4069-4078中描述了DOTAP氯化物的非水性离 子交换谱合成。蒸发洗脱液，得到所需化合物。

Felgner等在US 5,264,618中借助氯甲烷进行相应二甲氨基化合 物的甲基化，直接得到DOTAP氯化物。他们通过从-20℃乙腈中结晶， 表面上得到了黄的蜡。不过，DOTAP氯化物事实上在室温下是不溶 于乙腈的。再现这种所谓结晶的尝试仅仅通过热溶液冷却所得油性物 质的固化得到无定形材料。作者明显没有实现纯化效果并且不得不借 助谱纯化该物质的事实也证明了这不是结晶的事实。

所以，制备两种对映体DOTAP氯化物的合成途径和其特有性质迄 今都不是已知的。尽管化学文摘已经为两种对映体指定了编号，不过 相应的出版物仅仅描述对于外消旋DOTAP氯化物所进行的工作。

特别是如果这些化合物旨在肠胃外使用，包括用离子交换树脂处 理在内的制备鉴于可能的微生物污染是极其成问题的，因为相应的树 脂是细菌的理想营养介质，即使在它们已被杀死之后，被内毒素污染 的风险仍然存在。

本发明的目的因此是提供高纯度并具有足够的化学和物理稳定性 的DOTAP氯化物盐和水合物。本发明的进一步目的是提供货架寿命长 的这些盐，使它们能够用于制备药物制剂。对于能够在工业规模上进 行的稳定形式的DOTAP氯化物盐和水合物的可再现制备方法仍然存在 巨大的需求。

对映体纯的DOTAP氯化物能够用类似于外消旋物所述方法从对映 体纯的原料制得，也就是

经由(R或S)-1-氯-2，3-二油酰氧基丙烷，

经由(R或S)-1-LG-2，3-二油酰氧基丙烷和离子交换(LG＝离去 基团)或者经由(R或S)-1-二甲氨基-2，3-二油酰氧基丙烷。

进一步可以提到的制备方法是外消旋DOTAP氯化物的外消旋化合 物拆分。

借助实验已经惊人地发现，以简单的方式能够制得外消旋的和对 映体纯的结晶性DOTAP氯化物，其具有较高的化学纯度和优异的稳定 性。以这种方式制得的结晶性产物在室温和保护性气体下具有实际上 无限的稳定性。它们因此适合作为药物形式制备的成分或原料。

本发明因此涉及对映体纯的DOTAP氯化物和稳定的外消旋和对映 体纯DOTAP氯化物的晶形。

稳定的晶形可以是结晶性和部分结晶性形式。它们具有迄今从未 实现过的＞98％纯度，并且在25℃和60％相对大气湿度下且排除空气贮 存12个月后，具有迄今从未实现过的＞98％稳定性，相对于起始值而言 (这一点参见表1)。所述DOTAP氯化物晶形每当量DOTAP氯化物具 有小于1当量的水或结晶溶剂。

外消旋DOTAP氯化物晶形例如存在三种不同的晶形(I型、II型 和III型)，在粉末X-射线衍射测量中表现适中尖锐的峰带(这一点 参见图1至图3和表2)。

各种晶形的选定2θ值为12.6、19.5、20.2、21.5和25.2(I型)； 或者3.3、4.9、19.3、20.0和23.5(II型)；或者2.8、5.8、20.0、 21.2和25.1(III型)。

同样以结晶形式制得对映体纯的DOTAP氯化物。晶形的选定2θ值 为12.8、19.4、19.8、20.2和21.5(IV型，这一点参见图4)。

对映体是旋光活性的。因而，(2S)-DOTAP氯化物的旋光度为 -2.12°，(2R)-DOTAP氯化物的旋光度为+2.12°([α]_D20℃，1％二氯甲 烷溶液)。

本发明此外涉及制备DOTAP氯化物晶形的方法，其特征在于从质 子惰性介质中结晶DOTAP氯化物。用于这种目的的质子惰性介质可以 是质子惰性溶剂或其混合物。

质子惰性介质也可以包含少量质子溶剂，例如水。在例外情况下， 在适合的条件下也可以存在25重量％的质子溶剂。这里，DOTAP氯化 物的结晶可以直接从反应溶液进行，无需在先纯化。同样，借助无定 形、部分结晶性或结晶性材料的重结晶，可以制得结晶性DOTAP氯化 物。

适合的质子惰性溶剂特别是

醚类，例如四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二烷、二乙醚、二丙醚、 二异丙醚和甲基叔丁基醚，

酮类，例如丙酮、2-丁酮、甲基异丁基酮、甲基异丙基酮，

腈类，例如乙腈，和

酯类，例如甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异 丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯和1，3-二氧 杂环戊烷-2-酮。

这些溶剂在每种情况下可以使用纯净形式或混合物形式，也就是 说有可能以混合物形式使用同一组的各种质子惰性溶剂，也有可能以 彼此混合物形式采用不同类型的质子惰性溶剂。上文已经指出，在所 用质子惰性溶剂或溶剂混合物中可以存在质子溶剂添加剂。

这种类型的质子溶剂添加剂通常可以由下列溶剂组成：

醇类，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、2- 丁醇、叔丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙二醇、甲氧基乙醇、乙氧基乙醇， 或

水。

质子溶剂添加剂继而可以是纯溶剂或这些质子溶剂的混合物的添 加剂。

DOTAP氯化物晶形的结晶一般是如下具体实现的，缓慢冷却所制 备的溶液至低于30℃的温度。晶体的形成是自发进行的或者通过接种 相应的DOTAP氯化物晶形。

各种DOTAP氯化物晶形可以彼此转化。转化可以如下实现，在升 高的温度下热处理所分离的晶形，或者在结晶条件下延长搅拌它们的 悬浮液。

使用无定形或部分结晶性DOTAP氯化物作为重结晶原料，由所述 方法得到本质上结晶性的DOTAP氯化物，其具有迄今从未实现的纯度 以及迄今从未实现的稳定性。

本发明也涉及结晶性DOTAP氯化物制备药剂的用途，因为结晶性 DOTAP氯化物在规定条件下以固体形式具有优异的稳定性，并且具有 恒定的和非常良好的质量达实际上无限的时间。

另外，对映体纯的DOTAP氯化物具有不同于外消旋物的物理性质， 特别是与手性化合物、例如磷脂或胆固醇的组合。

对映体纯的DOTAP氯化物所发现的新颖性质、无论单独还是组合 有适合的磷脂、胆固醇及其衍生物都可以有利地用于提供新颖的脂质 体级别，与常规形式相比，一方面更紧密地包装脂质，另一方面具有 更均匀的结构。因而，从纯对映体制备的脂质体与包含外消旋DOTAP 氯化物的脂质体相比，表现高出5℃的主相变温度(principal phase transition temperature)。这是包装密度的量度。包含DOTAP氯化 物对映体的脂质体因此也减少掺入其中的化合物的泄漏。

这样的结果是填充有药学活性化合物的脂质体将随着人或动物体 内代谢作用而以延迟方式释放活性化合物。特别是敏感性活性化合物 因而能够有利地以更加特异性的方式被运输至需要药剂发挥作用的所 需部位或器官。

DOTAP氯化物对映体也表现因细胞系而异的转染性质，特别是组 合有手性脂质，例如磷脂、胆固醇及其衍生物。

就这些新颖脂质体的制备而言，本领域技术人员有可能特别选择 如此提供的一种形式或一定混合比例的DOTAP氯化物，目的是制备具 有某些新颖性质的脂质体。

因此，本发明进一步涉及使用所要求保护的DOTAP氯化物形式所 得药物组合物。这种类型的药物组合物可以包含(2R，S)-、(2S)-和 (2R)-DOTAP氯化物的晶形以及其它药物活性化合物和已知常用于药 物制备的助剂，以及一种或多种溶剂。

这些药物组合物例如可以是脂质体、脂质体复合物、微乳和纳米 粒子的形式，例如包括来自肽、核苷酸、疫苗或细胞抑制剂的活性化 合物。

本文的说明能够使本领域技术人员以广泛的方式应用本发明。另 外，下列实施例起到更好地理解发明和阐述可能的发明变化的作用。 这些实施例因此决不应当被视为限制性的。

在下列实施例中提及的所有温度均以摄氏度表示。除非另有规定， 含量数据以重量％给出。

阐述本发明的实施例

实施例1

稳定性

为了测定结晶性DOTAP氯化物的稳定性，将这些物质和对比样品 一起贮存在25℃和60％相对湿度下，并排除空气。定期测量DOTAP氯 化物的剩余含量，并与初始值比较。

借助HPLC测定DOTAP氯化物的纯度和含量。就I型而言，得到下 列数值：

稳定性测定可以在任意所需时间重复，表1所示数值是可再现的。

表1：

  (R，S)-DOTAP   氯化物结晶性I型     暴露时间，以月计     0     1     2     3     6     12   面积％     100％     100.0％     100.0％     100.0％     100.0％     100.0％   重量％     98.6％     97.0％     97.9％     97.2％     98.2％     98.7％

实施例2

粉末X-射线图

就结晶性DOTAP氯化物的结构性质(晶形)的表征而言，记录这 些物质的粉末X-射线图(衍射光谱)。

结晶性DOTAP氯化物的光谱具有适中尖锐的峰带，具有相对良好 的脂质分辨。光谱反映了高结晶性含量。在极化显微镜下没有无定形 级分可见。

光谱的实例如图1(I型)、图2(II型)、图3(III型)和图 4(IV型)所示。

为了对比，商业上可获得的无定形样品的光谱如图5(无定形) 所示。

表2列举了外消旋和对映体纯的DOTAP氯化物的各种晶形的选定 2θ值：

表2：

    类型     选定2θ值     I型     II型     III型     外消旋     12.6，19.5，20.2，21.5和25.2     3.3，4.9，19.3，20.0和23.5     2.8，5.8，20.0，21.2和25.1     IV型     对映体纯     12.8，19.4，19.8，20.2和21.5

实施例3

主相变温度

在水中对多层脂质体进行示差扫描量热(DSC)测量。借助薄膜法从 计算量的外消旋或对映体纯DOTAP氯化物制备脂质体。这里的脂质浓 度在每种情况下均为0.1g/ml。然后向可密封的铝坩锅引入适量这些 分散体，利用204Phoenix量热计(Netzsch，Selb，Germany)测量。 在每种情况下，进行三个连续的加热/冷却循环，从-50℃到+20℃， 1℃/min。

就所有三种DOTAP氯化物变体而言，发现相变温度低于0℃。就 冷却循环而言，在每种情况下为-23℃至-24℃。外消旋与对映体纯 DOTAP氯化物之间的差异在每种情况下在加热循环中很明显。 (2R)-DOTAP氯化物和(2S)-DOTAP氯化物都在-12.5℃左右表现吸热相 变，而外消旋物的相变在-17.5℃(参见图6)。

实施例4

对于COS-7细胞的转染性质

将外消旋和对映体纯DOTAP氯化物以及外消旋DOTAP甲基硫酸盐 各自用等量胆固醇分散在转染介质中，用超声波处理。混合脂质体和 GFP质粒溶液，温育15分钟，每6孔的量为2μg质粒/8μg脂质。

温育5小时后，在37℃/5％CO₂下抽吸除去上清液，加入2ml新 鲜介质，混合物温育另外20小时。处理后，FACS分析显示所有脂质 体复合物均有效转染。各个脂质混合物的转染率之间的显著性差异是 明显的：

(R)-DOTAP氯化物/胆固醇复合物：32.4％

(S)-DOTAP氯化物/胆固醇复合物：11.0％

(R，S)-DOTAP氯化物/胆固醇复合物：25.9％

(R，S)-DOTAP甲基硫酸盐/胆固醇复合物：20.2％。