以流通方式从生物药物制剂中去除蛋白质聚集体

以流通方式从生物药物制剂中去除蛋白质聚集体

相关申请

本申请要求2012年3月12日提交的美国临时专利申请No.61/609,533 和2012年6月29日提交的美国临时专利申请No.61/666,578的优先权，将 其全文援引加入本文。

发明领域

本发明涉及以流通(flow-through)方式从包含感兴趣的产物的生物药学 制剂中去除蛋白质聚集体的方法。

发明背景

蛋白质聚集体是需要从包含感兴趣的产物，例如性蛋白质或抗体 分子的生物药学制剂中去除的重要杂质之一。例如，蛋白质聚集体和其他 污染物必须在产品用于诊断、或其它应用之前从包含感兴趣的产物的 生物药学制剂中去除。此外，蛋白质聚集体还常见于从杂交瘤细胞系得到 的抗体制剂，并且需要在抗体制剂用于其目的用途之前去除。在性应 用和用于获得食品药品管理局批准的情况中这是特别重要的。

蛋白质聚集体的去除可能受到挑战，这是由于在生物药学制剂中，经 常在蛋白质聚集体和感兴趣的产物(其通常是单体分子)的物理和化学性质 之间存在相似性。对于从生物药学制剂中去除蛋白质聚集体，现有技术中 已有许多不同方法，其包括例如体积排阻谱、离子交换谱和疏水作用 谱。

已知几种结合-洗脱式谱方法用于蛋白质聚集体与感兴趣的产物的 分离。例如，羟基磷灰石已用于蛋白质、核酸以及抗体的谱分离。在羟 基磷灰石谱中，将柱常规地平衡，然后施用低浓度磷酸盐缓冲液中的样 品，然后以磷酸盐缓冲液的浓度梯度洗脱被吸附的蛋白质(参见例如 Giovannini,Biotechnology and Bioengineering73:522-529(2000))。但是，在 多种情况中，研究人员不能选择性地从羟基磷灰石洗脱抗体，或发现羟基 磷灰石谱不产生足够纯的产品(参见，例如Jungbauer,J.Chromatography  476:257-268(1989);Giovannini,Biotechnology and Bioengineering  73:522-529(2000))。

此外，一种市售的谱树脂，陶瓷羟基磷灰石(CHT)已较成功地以树脂 模式用于蛋白质聚集体的去除(BIORAD CORP，另参见例如美国专利公布 WO/2005/044856)，但其一般是昂贵的，并显示出对蛋白质聚集体的低结合 容量。

已有人描述了一种结合-洗脱式阳离子交换谱方法，其有时在用于聚 集体去除的工业中使用(参见例如美国专利6,620,918)，但是，常发现单体 收率和聚集体去除之间不利的折衷性需克服。在从单克隆性抗体溶液中去 除聚集体的方法的近期综述中，关注一种结合-洗脱式谱方式—“阳离子 交换谱可能是一种分离聚集体和单体的有效方法，但它可能难以发展成 高收率并具有高容量的阶段。”参见例如Aldington等人,J.Chrom.B, 848(2007)64–78。

与现有技术中已知的结合-洗脱式方法和体积排阻谱方法相比，以流 通方式的蛋白质纯化被认为是更令人期待的，这是由于较好的经济性、简 易性、省时和缓冲液的节省。

现有技术中已尝试使用基于疏水作用谱(HIC)介质的流通式聚集体 去除(参见例如美国专利7,427,659)。但基于HIC的制备性分离具有窄应用 性，这是因为通常方法发展困难，操作窗口窄，并且缓冲液所需的盐浓度 高。

弱分配谱(WPC)是另一种谱操作方式，其中产物比结合-洗脱式 谱情况中的结合更弱，但比流通式谱情况中的结合更强(参见例如美国专 利8,067,182)；但WPC也具有一些与其相关的缺点，包括窄操作窗口和与 结合-洗脱式方法相比更低的杂质去除容量。

虽然现有技术中描述的流通式方法中一些已报道用于结合聚集体，但 是相对于感兴趣的产物，结合聚集体的特异性低。此外，现有技术中似乎 没有已知的方法显示出对于结合低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体 和四聚体的高特异性。

发明内容

本发明提供新型且改进的组合物以及将所述组合物用于在生物药学组 合物中将感兴趣的产物，例如性抗体或单体蛋白质与蛋白质聚集体分 离的流通式方法。本文所述的组合物和方法特别可用于感兴趣的单体蛋白 质与一般难以与单体蛋白质分离的低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚 体和四聚体的分离。

本发明至少部分地基于流通方式中的表面与感兴趣的产物(即单体分 子)相比更高的蛋白质聚集体的结合选择性，由此将蛋白质聚集体与感兴趣 的产物分离。通过具有特定密度的阳离子交换结合基团的表面的独特设计， 本发明可实现该目的，由此有助于使比单体分子相比更大量的蛋白质聚集 体结合在表面上。

在本发明的一些实施方案中，提供将样品中的感兴趣的单体蛋白质与 蛋白质聚集体分离的流通式谱方法，其中所述方法包括将样品与固体载 体接触，由此将感兴趣的单体蛋白质与蛋白质聚集体分离，所述固体载体 包含一种或多种与其连接的阳离子结合基团，其密度为约1-约30mM，其 中所述固体载体选择性地结合蛋白质聚集体。

在一些实施方案中，本发明方法中使用的固体载体选自谱树脂、膜、 多孔整体料(monolith)、机织织物和无纺织物。

在一些实施方案中，所述固体载体包括谱树脂或多孔球。

在一些实施方案中，所述固体载体是多孔的聚乙烯醚的高分子微球或 多孔的交联聚甲基丙烯酸酯的聚合物球。

在一些实施方案中，所述谱树脂或多孔球的平均粒径为约50μm， 或约10-约500μm之间、或约20-约140μm之间、或约30-约70μm之间。

在一些实施方案中，固体载体选自平均粒径为10μm-500μm之间或 20-200μm之间或20-90μm之间的谱树脂或多孔球。在一个特定实施方 案中，所述谱树脂或多孔球的平均粒径为约50μm。通常，选择性可随 着粒径降低而改善。本领域技术人员将理解根据特定应用或方法的需求可 调节平均粒径，同时保持一定水平的用于结合蛋白质聚集体的选择性。

在一些实施方案中，所述蛋白质聚集体是低级蛋白质聚集体，例如二 聚体、三聚体和四聚体。

在其他实施方案中，所述蛋白质聚集体是高级蛋白质聚集体，例如五 聚体和更高级聚集体。

在一些实施方案中，本发明方法中使用的阳离子交换基团选自磺酸基 (sulfonic group)、硫酸基(sulfate group)、膦酸基(phosphonic group)、磷酸基 (phosphoric group)和羧酸基(carboxylic group)。

在一些实施方案中，所述单体蛋白质是抗体。在一个特定实施方案中， 所述抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，所述单体蛋白质是重组蛋白 质，例如Fc-融合蛋白质。在另外的其他实施方案中，所述单体蛋白质是非 抗体的分子。

在本发明的一些实施方案中，提供将样品中的感兴趣的单体蛋白质与 蛋白质聚集体分离的流通式谱方法，其中所述方法包括将样品与固体载 体接触，由此将感兴趣的单体蛋白质与蛋白质聚集体分离，所述固体载体 包含一种或多种与其连接的阳离子结合基团，其密度为约1-约30mM，其 中所述固体载体选择性地结合蛋白质聚集体，相对于单体，其选择性大于 约10。

在其他实施方案中，提供降低样品中的蛋白质聚集体浓度的流通式 谱方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含感兴趣的蛋白质和约1-约20% 的蛋白质聚集体的样品；(b)将所述样品与固体载体接触，所述固体载体包 含一种或多种与其连接的阳离子结合基团，其密度为约1-约30mM；和(c) 收集样品的流通流出物，其中所述流出物中的蛋白质聚集体的浓度相对于 (a)中聚集体的浓度降低至少50%，由此降低所述样品中的蛋白质聚集体的 浓度。

在本发明的一些实施方案中，所述流出物中感兴趣的蛋白质浓度为(a) 中的感兴趣的蛋白质浓度的至少80%。

在一些实施方案中，与所述固体载体接触的、包含聚集体的样品的离 子导电性在约0.5-约10mS/cm的范围。

在一些实施方案中，本文所述的用于感兴趣的蛋白质(例如单克隆抗体) 的纯化方法不需要结合-洗脱式阳离子交换谱步骤。由此，该方法消除了 向洗脱溶液添加盐和使用后续稀释步骤的需求。

在一些实施方案中，提供用于感兴趣的蛋白质(例如单克隆抗体)的纯化 方法，其中所述方法不需要提高导电性。由此，所述方法不需要在阳离子 交换步骤之后稀释，其为了在进行后续的流通式阴离子交换步骤之前降低 导电性。

本发明还包括包含阳离子交换基团的聚合物，其中所述聚合物连接在 固体载体上。

在一些实施方案中，所述聚合物包括以下化学结构：

其中R¹是阳离子交换基团；R²是任意的不包含带电荷基团的脂族或芳 族有机残基；R³是在任意的两个或更多个聚合链之间的任意的不带电荷的 脂族或芳族有机连接基(linker)；x、y和z是所述聚合物中各单体的平均摩 尔分数，其中y>x；并且标记m表示相似聚合物链与所述连接基的另一端 连接。

在其他实施方案中，本发明聚合物包括以下化学结构：

其中x、y和z是所述聚合物中的各单体的平均摩尔分数，其中y>x； 并且标记m表示相似聚合物链与所述连接基的另一端连接。

在另一些实施方案中，本发明聚合物包括以下化学结构，其中所述聚 合物通过共价键接枝在固体载体上：

其中R¹是阳离子交换基团；R²是任意的不包含带电荷基团的脂族或芳 族有机残基；并且x和y是所述聚合物中的各单体的平均摩尔分数，其中 y>x。

在一些实施方案中，本发明聚合物包括以下化学结构：

其中x和y是所述聚合物中的各单体的平均摩尔分数，其中y>x，并 且其中所述聚合物通过连接键(linkage)接枝在谱树脂上。

在各种实施方案中，聚合物连接至固体载体。

在本发明的各种实施方案中，对包含感兴趣的产物的流出物进行本文 所述的一种或多种分离方法，其中所述流出物包含低于20%，或低于15%， 或低于10%，或低于2%的蛋白质聚集体。

在本发明的一些实施方案中，本发明的方法和/或组合物可与以下的一 种或多种组合使用：蛋白质A谱、亲和谱、疏水作用谱、固定化金 属亲和谱、体积排阻谱、渗滤、超滤、病毒去除过滤、阴离子交换 谱和/或阳离子交换谱

在一些实施方案中，被本文所述的组合物选择性去除的蛋白质聚集体 是高级分子量的聚集体，即蛋白质五聚体和更高级聚集体。

在一些实施方案中，被本文所述的组合物选择性去除的蛋白质聚集体 包含低级聚集体物质，例如蛋白质二聚体、三聚体和四聚体。

在一些实施方案中，在纯化过程中，在流通式纯化方法步骤中使用包 含本文所述的一种或多种阳离子交换结合基团的固体载体，其中流通式纯 化方法步骤和完整的纯化方法可以连续的方式进行。

在一些实施方案中，在固体载体的上游和下游将本文所述的固体载体 与其他类型的介质连接以流体连通。例如，在一些实施方案中，如上所述 的包含一种或多种阳离子交换结合基团的固体载体在上游与阴离子交换 谱连接，并在固体载体的下游与病毒过滤介质连接。在一个特定的实施方 案中，样品流通过活性炭，然后流通过阴离子交换谱介质，然后流通过 包含一种或多种阳离子交换结合基团的固体载体，然后流通过病毒过滤器。 在一些实施方案中，静态混合器和/或缓冲罐(surge tank)位于阴离子交换介 质和包含一种或多种阳离子交换结合基团的固体载体之间以进行pH变化。

附图说明

图1是使用具有比现有技术中已知的组合物的密度更低的阳离子交换 结合基团的组合物的经增强的聚集体选择性的示意图。

图2A-2F显示了本发明的各种组合物的典型化合物结构。图2A-2D显 示了固定在固体载体上的交联聚合性结构；图2E-2H显示了与固体载体共 价连接的接枝聚合性结构。R¹是阳离子交换基团，例如磺酸基、硫酸基、 磷酸基、膦酸基或羧酸基；R²是任意的不包含带电荷基团的脂族或芳族有 机残基；R³是在任意的两个或更多个聚合链之间的任意的不带电荷的脂族 或芳族有机连接基；x、y和z是所述聚合物中的各单体的平均摩尔分数， 而y>x；标记m表示相似的聚合物链与连接基的另一端连接；R⁴是NH或 O；R⁵是直链或支链的脂族或芳族基团，例如-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、 -C(CH₃)₂-CH₂-、-C₆H₄-；R⁶是直链或支链的脂族或芳族的不带电荷的基团， 其包含与聚合物链的NH、O或S连接基；并且R⁷和R⁸独立地选自包含一 种或多种中性脂族和芳族有机残基的基团，并且可包含杂原子，例如O、N、 S、P、F、Cl等。

图3A是表示通过包括膜7、膜8或市售膜(PallS膜)的三个 不同膜装置的单克隆抗体(MAb I)流出部分(fraction)的体积排阻谱(SEC) 分析结果的图。在x轴上以g/L显示膜上的MAb I总加载量，并且在y轴 上显示相对于初始浓度的MAb I单体(由%收率表示)的相对浓度。

图3B是表示通过包括膜7、膜8或PallS膜的三个不同膜 装置的MAb I流出部分的体积排阻谱(SEC)分析结果的图。在x轴上以 g/L显示膜上的MAb I总加载量，并且在y轴上显示相对于初始浓度的MAb I二聚体(由%收率表示)的相对浓度。如所述观察到的，对于膜7，二聚体 的突破(break-through)明显晚于膜8和PallS膜。

图3C是表示通过包括膜7、膜8或PallS膜的三个不同膜 的装置的MAb I流出部分的体积排阻谱(SEC)分析结果的图。在x轴上以 g/L显示膜上的MAb I总加载量；在y轴上显示相对于初始浓度的MAb I 高分子量(HMW)聚集体收率的相对浓度。如所述观察到的，对于膜7，HMW 突破的出现明显晚于膜8和PallS膜。

图4A是显示如通过SEC测定的(在y轴右侧上显示)，对于膜7(由空 心三角显示)和膜8(由空心方块表示)的抗体混合体(pool)的聚集体突破 (breakthroughs)与MAb加载量的关系的图。还显示了对于膜7(实心三角)和 膜8(实心方块)的抗体混合体中的单体(即感兴趣的产物)收率。

图4B是显示在2个单独轮次(轮次1：由空心圆显示；轮次2：由空心 菱形显示)中，对于膜7的抗体混合体的聚集体突破(在y轴右侧上显示)与 MAb加载量的关系的图。还显示了对于膜7的抗体混合体中的单体收率(轮 次1：由实心圆显示；轮次2：由实心菱形显示)。

图5是显示对于膜7的抗体混合体的聚集体突破(在y轴右侧上显示) 与MAb III加载量(在x轴上以mg/mL显示)的关系图。还显示了对于膜7 的抗体混合体中的单体收率(在y轴左侧上显示)。

图6A是显示pH5.0下的分配系数与用于MAb I单体与膜8(空心方块) 和MAb I聚集体与膜8(空心三角)、MAb I单体与膜7(实心方块)和MAb I聚 集体与膜7(实心三角)结合的NaCl浓度的关系图。

图6B是显示pH5.0下的分配系数与用于MAb II单体与膜8(空心方块) 和MAb II聚集体与膜8(空心三角)、MAb II单体与膜7(实心方块)和MAb II 聚集体与膜7(实心三角)结合的NaCl浓度的关系图。

图7是用于表示分别在pH5.0下的MAb I和MAb II与膜7和膜8的 结合的选择性的图。膜8对于MAb I的选择性由空心方块显示；膜7对于 MAb I的选择性由实心方块显示；膜8对于MAb II的选择性由空心三角显 示；并且膜7对于MAb II的选择性由实心三角显示。

图8显示表示在10和15g/L的聚集体加载量下的单体百分比的等高线 图。

图9显示表示在5、10和15g/L的聚集体加载量下的最佳工作区域的 等高线图。最佳定义为>88%的单体收率，并且聚集体占总蛋白质<2%。灰 区域不符合这些标准。

图10是显示研究流速对于病毒过滤装置的通量的试验结果图。Y轴表 示压降(psi)，并且X轴表示病毒过滤装置的通量(kg/m²)。

图11是采用本文所述的组合物的经连接的流通式纯化方法的示意图。 含活性碳的装置与阴离子交换装置直接连接。来自阴离子交换装置的流出 物通过加入降低pH的酸水溶液的静态混合器，然后通过本发明的阳离子流 通式装置、以及病毒过滤器。

图12是显示对阴离子交换谱介质(ChromaSorb^TM)之后的HCP突破进 行测试的试验结果图。X轴表示HCP浓度(ppm)，并且Y轴表示AEX加载 量(kg/L)。

图13是显示测试MAb聚集体的去除与流通式纯化方法步骤中的病毒 过滤装置的加载量的关系的试验结果图。X轴表示病毒过滤加载量(kg/m²)， 并且Y轴表示病毒过滤之后样品中的MAb聚集体的百分比。

图14是显示验证MAb聚集体的去除与使用本文所述的阳离子交换树 脂(批号#12LPDZ119)的累积蛋白质加载量的关系的试验结果图。X轴表示 累积蛋白质加载量(mg/ml)，左Y轴表示抗体Mab的浓度(mg/ml)，并且右 Y轴表示样品中MAb聚集体的百分比。

图15是显示验证MAb聚集体的去除与使用本文所述的阳离子交换树 脂(批号#12LPDZ128)的累积蛋白质加载量的关系的试验结果图。X轴比表 示累积蛋白质加载量(mg/ml)，左Y轴表示抗体Mab的浓度(mg/ml)，并且 右Y轴表示样品中MAb聚集体的百分比。

图16是显示验证MAb聚集体的去除与使用本文所述的阳离子交换树 脂(批号#12LPDZ129)的累积蛋白质加载量的关系的试验结果图。X轴比表 示累积蛋白质加载量(mg/ml)，左Y轴表示抗体Mab的浓度(mg/ml)，并且 右Y轴表示样品中MAb聚集体的百分比。

图17显示在pH5和3分钟停留时间下具有MAb5的批号#1712的树 脂的谱图。

具体实施方式

已描述了多种现有技术的结合-洗脱式方法和流通式方法以尝试分离 蛋白质聚集体与通常是感兴趣产物的单体蛋白质。

结合-洗脱式方法通常是耗时的，需要较大的工艺发展，并且有时在聚 集体，特别是低级聚集体与单体蛋白质的有效分离，同时保持单体蛋白质 的高收率上是不成功的。现有技术中已描述具有常规多孔树脂和膜的阳离 子交换流通式方法；但是，它们显示出问题，包括用于结合聚集体的介质 的容量低、对于二聚体的选择性低，并且通常感兴趣产物，即单体蛋白质 的收率低(参见例如Liu等人,J.Chrom.A.,1218(2011),6943-6952)。

此外，现有技术中已描述了显示出在固体载体上使用阳离子交换基团 以分离蛋白质的方法。参见例如Wu等人(Effects of stationary phase ligand  density on high-performance ion-exchange chromatography of proteins,J. Chrom.598(1992),7-13)，其讨论了在固体载体上具有高密度的阳离子交换 基团密度以具有两个模型蛋白质的最佳谱拆分。但是，近期特别研究了 阳离子交换基团对于聚集体去除上的效果(参见例如Fogle等人,Effects of  resin ligand density on yield and impurity clearance in preparative cation  exchange chromatography.I.Mechanistic evaluation,J.Chrom.A..1225(2012), 62-69)。据报道，单体的和高分子量的抗体形式的拆分对于结合基团的密度 很不灵敏。

已描述将WPC用于杂质的去除(参见例如Suda等人,Comparison of  agarose and dextran-grafted agarose strong ion exchangers for the separation of  protein aggregates,J.Chrom.A,1216:pp.5256-5264,2009)。在弱分配谱 (WPC)的情况中，分配系数Kp为0.1-20；Kp>20与结合-洗脱式谱相关， 并且Kp<0.1与流通式谱相关。WPC具有至少两个缺点。首先，必须在 流通式和结合-洗脱式谱之间的窄工作范围(0.1<Kp<20)(参见例如美国专 利8,067,182)。在该工作范围中，产物和杂质之间的选择性为了有效分离必 须较大。通常对于离子交换介质，产物和杂质之间的选择性随着Kp增大而 升高，在结合-洗脱条件下具有最高的选择性。第二，杂质的容量低于结合 -洗脱式的情况。由于Kp值较低，所以杂质浓度低于产物浓度的常规工作 条件下的容量也较低。

本发明能够实现相比现有技术中所述的各种方法更优异的蛋白质聚集 体和单体蛋白质的分离。本发明与现有技术中所述的那些方法的重要区别 在于在固体载体上使用低密度的阳离子交换基团、以及对于低级蛋白质聚 集体，例如二聚体、三聚体和四聚体去除的高特异性，低级蛋白质聚集体 通常因它们在尺寸和表面性质上与单体的近似性而较难以去除。

为了使本公开更易于理解，首先定义一些术语。其他定义在详细描述 中阐述。

I.定义

如本文所用，术语“谱”是指在生物药学制剂中将感兴趣的产物(例如 性蛋白质或抗体)与污染物和/或蛋白质聚集体分离的任何种类的技术。

在本文可互换使用的术语“流通方法”、“流通方式”和“流通谱”是指产 物分离技术，其中包含感兴趣产物的生物药学制剂流通过材料。在一些实 施方案中，感兴趣产物流通过材料，并且不期待的物质与材料结合。在一 个特定的实施方案中，所述材料包含一定密度的阳离子交换结合基团(即低 于现有技术的组合物)，并用于分离单体蛋白质与蛋白质聚集体，其中单体 蛋白质流通过所述材料，而蛋白质与材料结合。

术语“亲和谱”是指一种蛋白质分离技术，其中目标分子(例如含感兴 趣的蛋白质或抗体的Fc区域)特定地与对于所述目标分子特异的配体结合。 该配体通常称为生物特异性配体。在一些实施方案中，生物特异性配体(例 如蛋白质A或其功能性变型)与合适的谱基质材料共价连接，并且当溶液 接触谱基质时，可接近溶液中的目标分子。目标分子通常在谱步骤中 保留它对于生物特异性配体的特异的结合亲和性，而混合物中的其他溶质 和/或蛋白质不与配体明显或特异地结合。目标分子与经固定的配体的结合 可使污染性蛋白质和杂质通过谱基质，而目标分子仍然特异性地与固相 材料上的经固定的配体特异性地结合。特异性结合的目标分子然后在合适 的条件下(例如低pH、高pH、高盐、竞争性配体等)以它的活性形式从经固 定的配体去除，并使用洗脱缓冲液通过谱柱，其基本上不含更易于通过 柱的污染性蛋白质和杂质。应理解，任何合适的配体可用于纯化它的各特 异性结合蛋白质，例如抗体。在本发明的一些实施方案中，蛋白质A用作 用于包含目标蛋白质的Fc区域的配体。用于从目标分子(含蛋白质的Fc区 域)的生物特异性配体(例如蛋白质A)洗脱的条件可由本领域技术人员容易 地确定。在一些实施方案中，蛋白质G或蛋白质L或它们的功能性变型可 用作生物特异性配体。在一些实施方案中，采用生物特异性配体，例如蛋 白质A的方法使用5-9的pH范围用于与含Fc区域的蛋白质结合，然后对 生物特异性配体/目标分子缀合物洗涤或再平衡，然后用包含至少一种盐的 pH约为4或低于4的缓冲剂洗脱。

在本文可互换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”是指任何外源或者 不适宜的分子，包括生物大分子如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白 质、内毒素、脂质及一种或多种添加剂，添加剂可存在于含有感兴趣产物 的样品中，感兴趣产物与一种或多种外源或者不适宜的分子分离。此外， 这种污染物可包括可在分离方法之前进行的步骤中使用的任何试剂。在一 个特定的实施方案中，本文所述的组合物和方法将蛋白质聚集体与含感兴 趣产物的样品选择性地分离。

术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(本文可互换使用)是指具有基础的四- 多肽链结构的蛋白质，该结构由两个重链和两个轻链构成，所述链例如通 过链间的二硫键稳定，该蛋白质具有特异性地结合抗原的能力。术语“单链 免疫球蛋白”或“单链抗体”(本文可互换使用)是指具有二-多肽链结构的蛋 白质，该结构由一个重链和一个轻链构成，所述链例如通过链间的肽连接 基稳定，该蛋白质具有特异性地结合抗原的能力。术语“结构域(domain)” 是指包括肽区环(peptide loops)(例如包括3-4个肽区环)的重链或轻链多肽 的球形区域，球形区域例如通过β-片层(β-pleated sheet)和/或链内的二硫键 稳定。根据在“恒定的”结构域的情况中各类组成的结构域中相对缺少序列 变化、或在“变化的”结构域的情况中各类组成的结构域中的明显变化，在 本文中将结构域进一步称为“恒定的”或“变化的”。抗体或多肽“结构域”通常 在本领域中可互换地被称为抗体或多肽“区域”。抗体轻链的“恒定的”结构 域可互换地被称为“轻链恒定区域”、“轻链恒定结构域”、“CL”区域或“CL” 结构域。抗体重链的“恒定的”结构域可互换地称为“重链恒定区域”、“重链 恒定结构域”、“CH”区域或“CH”结构域。抗体轻链的“变化的”结构域可互 换地称为“轻链可变区域”、“轻链可变结构域”、“VH”区域或“VH”结构域。

免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且以单体或多聚形式 存在，例如以五聚形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚或多聚形式存在 的IgA抗体。术语“片段”是指比完全或完整的抗体或抗体链包含更少的氨 基酸残基的抗体或抗体链的部分。片段可通过对完全或完整抗体或抗体链 的化学或酶化处理而得到。片段还可通过重组方法得到。示例性的片段包 括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。

术语“抗原-结合的片段”是指用于抗原结合(即特异性结合)的结合抗原 或与完整抗体(即与它们来源于的完整抗体)竞争的免疫球蛋白或抗体的多 肽部分。结合片段可通过重组DNA技术、或通过完整的免疫球蛋白的酶法 或化学切割得到。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fc、单链和单链抗体。

如本文所述的术语“生物药学制剂”是指包含感兴趣产物(例如性蛋 白质或抗体，其通常是单体)和不期待的组分，例如蛋白质聚集体(例如感兴 趣产物的低级蛋白质聚集体和高分子量聚集体)的任意组合物。

如本文所使用的，并且除非另有说明，术语“样品”是指任何包含目标 分子的组合物或混合物。样品可来自生物或其它来源。生物来源包括真核 和原核来源，例如植物和动物细胞、组织和器官。样品还可包括稀释剂、 缓冲剂、洗涤剂和发现与目标分子混合的污染性物质、碎片等。样品可以 是“部分纯化的”(即已进行一种或多种纯化步骤，例如过滤步骤)、或可从产 生目标分子的宿主细胞或生物体直接得到(例如，样品可包括收获的细胞培 养流体)。在一些实施方案中，样品是细胞培养料(cell culture feed)。在一些 实施方案中，进行本文所述的流通式纯化方法的样品来自结合-洗脱式谱 步骤，例如蛋白质A亲和谱的洗脱物。

本文可互换使用的术语“蛋白质聚集体”是指至少两个感兴趣产物的分 子，例如性蛋白质或抗体的缔合物。至少两个感兴趣产物的分子的缔 合可通过包括但不限于共价、非共价、二硫化或不可还原的交联的任意方 法产生。

使用体积排阻谱(SEC)检测蛋白质样品中的聚集体浓度，体积排阻 谱(SEC)是现有技术中公知且广为接受的方法(参见例如Gabrielson等人,J. Pharm.Sci.,96,(2007),268–279)。利用UV吸光性在流出物中检测各分子量 物质的相对浓度，同时通过按照柱制造商的说明进行系统校正而确定片段 分子量。

本文可互换使用的术语“二聚体”、“蛋白质二聚体”是指蛋白质聚集体 的低级片段，其主要由包含两个单体分子的聚集体构成，但还可包含一些 量的三聚体和四聚体。该流出部分通常观察为在主单体峰之前不久的SEC 谱图中的第一个可分辨的峰。

本文可互换使用的术语“高分子量聚集体”或“HMW”是指蛋白质聚集 体的高级片段，即五聚体及更高级聚集体。该流出部分通常观察为二聚体 峰之前的SEC谱图中的一种或多种峰。

本文可互换使用的术语“结合基团”或“配体”是指在固体载体(例如多孔 表面)上固定的特异性化合物结构，其可从溶液吸引单体蛋白质或蛋白质聚 集体。蛋白质对于结合基团的吸引可以是任何类型的，包括离子性、极性、 散性、疏水性、亲和性、金属螯合性或范德华力。

在此使用的术语“阳离子交换”是指带负电荷的结合基团。在一个特定 的实施方案中，结合基团是带负电荷的磺化基团(sulfonate group)。

术语“固体载体”通常是指与结合基团连接的任何材料(多孔或非多孔 的)。结合基团与固体载体的连接可通过共价键(例如在接枝的情况中)、或 通过涂布、粘合、吸附和相似机理。本文所述的方法和组合物中使用的固 体载体包括但不限于膜、多孔球、翅状纤维(winged fibers)、整体料和树脂。

本文所使用的术语“密度”是指固体载体上的结合基团或配体的浓度， 其通常表示为每升多孔介质的配体浓度(mol)，广为接受的离子交换配体密 度单位是毫当量/升，或meq/L(等同于μeq/ml)，其相当于给定介质体积中 的可离子交换基团的摩尔量。对于具有一个可离子化部分的带电荷基团， 配体密度(meq/L)将等同于以mmole/L或mM表示的这些基团的密度。

本文所使用的术语“选择性”是指；流动相和固定相之间的两个物质的 分配系数的无量纲比值。分配系数(K_p)是Q/C比值，其中Q和C分别是结 合蛋白质浓度和游离蛋白质浓度。

本文可互换使用的术语“方法步骤”或“单元操作”是指在纯化步骤中使 用一种或多种方法或装置以达到一定结果。可采用的方法步骤或单元操作 的实例包括但不限于净化、结合-洗脱式谱、病毒灭活、流通式纯化和制 剂。应理解各方法步骤或单元操作可采用一个以上的步骤或方法或装置以 达到方法步骤或单元操作的意图结果。例如，在一些实施方案中，净化步 骤和/或流通式纯化步骤可采用一个以上的步骤或方法或装置以达到方法 步骤或单元操作。在一些实施方案中，用以进行方法步骤或单元操作的一 种或多种装置是单用途装置，并可被去除和/或替代而不需更换方法中的任 何其他装置或甚至不需停止方法运行。

本文所述的术语“储器(pool tank)”是指任何容器、储藏器、釜或袋，其 通常在方法步骤之间使用，并具有能够收集来自方法步骤的排出物的全部 体积的尺寸/体积。储器可用于容纳或储存或控制来自方法步骤的排出物的 全部体积的溶液条件。在本发明的各种实施方案中，所述方法不需要使用 一种或多种储器。

在一些实施方案中，本文所述的方法可使用一种或多种缓冲器(surge tanks)。

本文使用的术语“缓冲器”是指在多个方法步骤之前或在一个方法步骤 中(例如当单方法步骤包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或袋子；其中 来自一个步骤的排出物流通过缓冲器至下一步骤。由此，缓冲器不同于储 器之处在于它不意图容纳或收集来自步骤的排出物的全部体积；而相反地 能使来自一个步骤的排出物连续流向下一步骤。在一些实施方案中，本文 所述的两个方法步骤之间、或在方法或系统的方法步骤之间使用的缓冲器 的体积为不大于来自方法步骤的排出物的全部体积的25%。在另一个实施 方案中，缓冲器的体积不大于来自方法步骤的排出物的全部体积的10%。 在一些其他的实施方案中，缓冲器的体积不低于构成纯化目标分子的进料 的生物反应器的细胞培养物的全部体积的35%，或不低于30%，或不低于 25%，或不低于20%，或不低于15%，或不低于10%。

在本文所述的一些实施方案中，在采用本文所述的固体载体的步骤上 游使用缓冲器。

本文所使用的术语“连续方法”是指用于纯化目标分子的方法，其包括 两个或更多个方法步骤(或单元操作)，使得来自一个方法步骤的排出物直接 流入方法中的下一方法步骤中而不间断，并且其中两个或更多个方法步骤 可并流进行至少一部分它们的持续时间。也就是说，在连续方法的情况中， 如本文所述，不需要在下一步骤开始之前完成方法步骤，而是一部分样品 总是在方法步骤中运动。术语“连续方法”还适用于方法步骤中的步骤，在 该情况中，在进行包括多步骤的方法步骤中，样品连续流通过实施方法步 骤所需要的多个步骤。这样的本文所述的方法步骤的一个实例是包括以连 续方式进行的多个步骤的流通式纯化步骤，例如，流通式活性炭，然后是 流动式AEX介质，然后是使用本文所述的固体载体的流通式CEX介质， 然后是流通式病毒过滤。

本文中使用的术语“阴离子交换基质”是指带正电荷，例如具有一种或 多种正电荷的配体，例如与配体连接的季铵基的基质。市售的阴离子交换 树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(GE Healthcare)。本文所述的方法和系统中可使用的其他示例性的材料是 EMD TMAE、EMD TMAE highcap、Q和 EMD DEAE(EMD Millipore)。

本文可互换使用的术语“活性炭”是指已进行处理以增强它的孔结构的 含碳材料。活性炭是具有非常高的表面积的多孔固体。它们可来源于各种 资源，包括煤炭、木材、椰糠和泥煤。使用包括在受控环境下加热的物理 活化、或使用强酸、强碱或氧化剂的化学活化可从这些材料制备活性炭。 活化方法产生具有高表面积的多孔结构，高表面积向活性炭提供用于杂质 去除的高容量。可改变活化方法以控制表面酸度。在本文所述的一些实施 方案中，活性炭被用于流通式纯化步骤中，其通常在结合-洗脱式谱步骤 之后，或进而在结合-洗脱式谱步骤之后的病毒灭活步骤之后。在一些实 施方案中，活性炭被掺入纤维素介质中，例如在柱中或一些其他合适的装 置中。

术语“静态混合器”是指用于混合两个流体材料，通常是液体的装置。 所述装置通常由容纳在柱(管)外壳中的混合组件(固定组件)构成。整个系统 设计包括用于将两个液流输送入静态混合器中的方法。当料流移动通过混 合器时，固定组件将材料连续共混。完全的混合取决于许多因素，包括流 体性质、管的内直径、混合器组件的数量及它们的设计等。在本文所述的 一些实施方案中，一种或多种静态混合物用于本文所述的方法中，在一个 特定的实施方案中，静态混合器用于实现阴离子交换谱步骤之后和样品 与本文所述的阳离子交换固体载体接触之前所期待的溶液更换。

II.示例性的固体载体

本发明提供具有与固体载体连接的特定的结合基团或配体的密度的固 体载体，其相比于通常地感兴趣产物的蛋白质的单体形式，更有利地结合 蛋白质聚集体。不限于任何理论，任何合适的固体载体可用于本发明的情 况中。例如，固体载体可以是多孔或非多孔的，或者它可以是连续的，例 如以整体料或膜的形式。固体载体还可以是非连续的，例如以颗粒、球或 纤维的形式。在任一种情况(连续或非连续的)中，固体载体的重要特征是它 们具有高比表面积、机械完整性、含水环境中的完整性和提供流体分布以 确保可接近结合基团的能力。

示例性的连续多孔固体载体包括微孔膜，即孔径在约0.05μm-10μm之 间。可用于本发明组合物和方法的多孔膜可分类为性质上对称或非对称的， 其是指遍及膜厚度的孔径均一性，或者对于空心纤维是遍及纤维的微孔壁 的孔径均一性。如本文所述的术语“对称性膜”是指遍及膜的横截面具有基 本均一的孔径的膜。如本文所述的术语“非对称性膜”是指平均孔径在膜横 截面上不恒定的膜。在一些实施方案中，在非对称性膜的情况中，孔径可 随着整个膜横截面的位置而均匀或不连续地变化。在一些实施方案中，非 对称性的膜可具有一个外表面上的孔径对相反外表面上的孔径的比值，该 比值基本上大于1。

从各种材料制得的各种微孔膜可用于本文所述的组合物和方法。这些 材料的实例包括多糖、合成性和半合成性聚合物、金属、金属氧化物、陶 瓷、玻璃及它们的组合。

可用以制造可用于本文所述的组合物和方法的微孔膜的示例性聚合物 包括但不限于取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、 聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基亲水性聚 合物、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳族聚 砜、聚四氟乙烯(PTFE)、全氟热塑性聚合物、聚烯烃、芳族聚酰胺、脂族 聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯 及它们的组合。

示例性的市售微孔膜是购自EMD Millipore Corp.(Billerica,MA)的 和Millipore购自Pall Corp.(Port Washington,NY)的 (Port Washington,NY)；和购自Sartorius Stedim Biotech S.A.(Aubagne  Cedex,法国)的和

其他示例性的连续性固体载体是整体料，例如购自BIA Separations(Villach,奥地利)的整体材料。

示例性的非连续性的固体载体包括多孔谱球。如本领域技术人员将 容易知晓的，谱球可从各种各样的聚合性和无机材料，例如多糖、丙烯 酸酯、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、乙烯基醚、孔径受控的玻璃、陶瓷等制 造。

示例性的市售谱球是EMD Millipore Corp.的CPG；GE Healthcare  Life Sciences AB的Tosoh Bioscience的和 Life Technologies.的

其它示例性的固体载体是机织和无纺的纤维材料，例如纤维垫和毡、 以及装填入合适的外壳，例如谱柱的纤维、抛弃型塑料外壳等的纤维。 示例性的固体载体还包括翅状纤维。

III.示例性的结合基团

各种各样的结合基团或配体可与固体载体连接，并用于如上所述的蛋 白质聚集体从样品有效分离。通常，结合基团应能够在溶液中吸引并结合 蛋白质聚集体。蛋白质与结合基团的吸引可是任何类型的，包括离子性(阳 离子交换基团)、极性、散性、疏水性、亲和性、金属螯合性或范德华力 性的。

示例性的离子性结合基团包括但不限于硫酸基、磺酸基、磷酸基、膦 酸基、羧酸基；伯胺、仲胺、叔胺和季铵；杂环胺，例如吡啶、嘧啶、吡 啶鎓、哌嗪等。

极性基团包括各种各样的包含极性化合物键，例如C-O、C=O、C-N、 C=N、C≡N、N-H、O-H、C-F、C-Cl、C-Br、C-S、S-H、S-O、S=O、 C-P、P-O、P=O、P-H的化学实体。示例性的极性基团是羰基、羧基、醇、 硫醇、酰胺、卤素、胺、酯、醚、硫酯等。

疏水性结合基团能够具有疏水作用。示例性的疏水性基团是烷基、环 烷基、卤烷基、氟烷基、芳基等。

亲和性结合基团是均提供与目标蛋白质的高特异性相互作用的几种结 合官能团的排列。示例性的亲和性结合基团包括蛋白质A和蛋白质G及它 们的结构域和变体。

在一些实施方案中，优选的结合基团是离子基团。在一个特定的实施 方案中，结合基团是带负电荷的磺化基团。通常，带负电荷的磺化基团具 有几个优点。例如，它们在溶液中显示出对结合带正电荷的蛋白质的宽应 用性；其化学成本低，并且直接按照许多容易得到的合成制备方法；结合 基团和蛋白质之间的相互作用是公知的(参见例如Stein等人,J.Chrom.B, 848(2007)151–158)，并且其相互作用通过改变溶液条件可容易地控制，并 且该相互作用可独立于其他相互作用。

IV.结合基团与固体载体连接和控制固体载体上的结合基团密度的方法

在本文所述的组合物和方法中，合适的结合基团与固体载体连接，其 中控制固体载体上的结合基团的密度，以便提供相对于感兴趣产物更佳的 结合蛋白质聚集体的能力。

本文所述的组合物和方法基于以下出人意料且不可预见的发现：以流 通方式，固体载体上较低密度的结合基团更有效地去除蛋白质聚集体，尽 管现有技术中似乎暗示期待具有高密度的连接基团。本文所述的组合物和 方法在流通方式中去除低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体和四聚体 上是特别有效的，与高级聚集体，例如五聚体及更高级聚集体相比，低级 蛋白质聚集体通常较难以与单体形式的蛋白质分离。

本领域已知的各种方法和本文所述的方法可用于将连接基团与本文所 述方法中使用的固体载体连接。通常，成功连接的标准包括达到理想的结 合基团密度和结合基团的低脱离速率(即结合基团的低浸取率(leaching))。结 合基团可与固体载体直接连接，或可加入聚合性分子中，其进而可与固体 载体结合。可选地，结合基团可加入涂覆在固体载体上的交联涂层中，而 在涂层和固体载体之间不形成或形成化学键。

本领域中已知一些方法用于连接结合基团与固体载体(参见例如， Ulbricht,M.,Advanced Functional Polymer Membranes,Polymer,47,2006, 2217-2262)。这些方法包括但不限于通过合适的偶联化学，使用结合基团对 固体载体直接改性；吸附和连接聚合性分子。后者可通过接枝“至”(当聚合 物在与表面反应之前预制备)和接枝“自”(当使用表面基团开始聚合反应)而 实现。

如本文所述，在固体载体表面上控制结合基团密度的能力对于实现的 蛋白质聚集体和感兴趣分子的成功分离是十分重要的。使用本领域技术人 员已知的方法可方便地测得多孔介质或M的结合基团的密度(以mol/L表 示)。例如，磺酸基的密度可使用锂离子交换分析测定。在该分析中，磺酸 基的氢完全被锂离子交换，用水洗涤，锂离子随后洗出于浓酸溶液中，并 且使用离子谱检测酸洗液的锂浓度。

在蛋白质谱中，较高密度的配体(结合基团)通常是期待的，这是由于 它提供较高的结合容量(参见例如Fogle等人,J.Chrom.A,1225(2012) 62–69)。对于大多数市售的阳离子交换(CEX)树脂的典型配体密度为至少 100毫当量/L、或对于单价配体为100mM。例如，在产品文献中列举均购 自GE Healthcare的SP Sepharose Fast Flow和CM Sepharose Fast Flow分别 具有180-250mM和90-130mM的阳离子交换基团浓度。

现有技术中存在可用于控制固体载体上的结合基团密度的各种方法。 当结合基团直接连接在固体载体上时，通过反应时长、催化剂类型和浓度、 试剂浓度、温度和压力可控制密度。当需要固体载体的表面预处理(活化)， 例如通过部分氧化或水解时，预处理程度也控制将与该预处理表面连接的 结合基团的密度。

当结合基团加入吸附、附着、接枝或涂布在固体载体上的聚合性结构 时，结合基团的密度可通过聚合性结构的组成进行控制。产生结合基团的 密度受控制的聚合性结构的一种方法是共聚反应，即两种或更多种不同单 体类型聚合成单一的聚合性结构。结合基团可以是用以产生聚合性结构的 一种单体类型中的部分，可加入其他中性单体以降低结合基团的密度。

按照单体的反应性选择产生包含结合基团的聚合物中使用的单体。各 种单体类型的反应性和对于聚合物组合物的效果已被深入研究并公开(参 见例如，Polymer Handbook,第三版,John Wiley&Sons,1989,p.II)。预测 聚合物组成及其结构的公知的单体参数是单体的反应性比值(参见例如 Odian,J.,Principles of Polymerization,第4版,John Wiley&Sons,2004,p. 466)。

结合基团与固体载体连接的一个优选方法是将结合基团加入涂布在固 体载体上的交联涂层中的原位聚合反应。该方法公开于美国专利4,944,879 和4,618,533、以及已公开的美国专利公布US2009/208784中。该方法方便 且经济。通过将带电荷的丙烯酸单体，例如2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸 (AMPS)与合适的交联剂，例如N,N’-亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAM)共聚可产 生带电荷的涂层。美国专利公布US2009208784(将其全部援引加入本文)公 开了使用AMPS和MBAM的混合物改性的微孔膜，其可用于去除高分子 量蛋白质聚集体，并用于提高纳米多孔病毒过滤器的容量。但是，上述专 利公开没有讨论如本文所述地控制配体密度以实现蛋白质聚集体，并且特 别是低级蛋白质聚集体，例如二聚体、三聚体、四聚体等的选择性去除。

可用于降低带电荷的结合配体密度的中性单体可选自丙烯酸、甲基丙 烯酸和丙烯酰胺的单体大类，例如丙烯酰胺、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟乙 酯和甲基丙烯酸羟乙酯。一个优选的单体是二甲基丙烯酰胺(DMAM)。 AMPS和DMAM单体的反应性比值(r₁=0.162，r₂=1.108)(参见例如Polymer  Handbook,第3版,John Wiley and Sons,1989,p.II/156)预示包括这些单体 的聚合物将具有被单独的AMPS单元间隔的聚(DMAM)短嵌段的趋势，由 此降低结合基团的密度。选择反应溶液中DMAM和AMPS的比值由此是 实现密度受控制的结合基团的重要方法。

涂布在固体载体上的包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于图 2A。为了涂布聚合物，通常将其交联成其他聚合物。在图2A中，显示了 聚合性结构，其中R¹是包含阳离子交换基团，例如磺酸基、硫酸基、磷酸 基、膦酸基或羧酸基的脂族或芳族有机残基；R²是任意的不包含带电荷基 团的脂族或芳族有机残基；并且R³是任意的两个或更多个聚合链之间的任 意不带电荷的脂族或芳族有机连接基。

在图2A所示的聚合性结构中，y>x，其表示中性基团(由“R²”表示)以 多于带电荷基团(由“R¹”表示)的量存在。在此，x、y和z是所述聚合物中的 各单体的平均摩尔分数，并独立地在约0.001-0.999的范围。标记m仅表示 相似聚合物链连接在交联剂的另一端。

在一些实施方案中，包含连接基团的聚合物是嵌段共聚物，其表示它 包括一种类型单体的长链或嵌段(例如包含中性或带电荷的结合基团)，然后 是另一种类型单体的长链或嵌段(例如若第一嵌段是中性的，则其是带电荷 的，并且第一嵌段是带电荷的，则其是中性的)。

在其他实施方案中，包含结合基团的聚合物包含无规排序的单体。

在另外的其他实施方案中，包含结合基团的聚合物是交替共聚物，其 中各单体总在一侧与两个不同类的单体相邻。

在一些实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于图 2B，其中R⁴是NH或O；R⁵是直链或支链的脂族或芳族基团，例如-CH₂-、 -C₂H₄-、-C₃H₆-、-C(CH₃)₂-CH₂-、-C₆H₄-；并且R⁶是包含与聚合链的NH、 O或S连接基的直链或支链的脂族或芳族的不带电荷的基团。

在其他实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于图 2C。R⁷和R⁸独立地选自一种或多种中性的脂族和芳族有机残基，并且可包 含杂原子，例如O、N、S、P、S、P、F、Cl等。

在另外的其他实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构 示于图2D。

另一与固体载体接枝的包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于 图2E。固体载体以长方形表示。在图2E中显示聚合性结构，其中R¹是包 含阳离子交换基团，例如磺酸基、硫酸基、磷酸基、膦酸基或羧酸基的任 意的脂族或芳族有机残基；R²是任意的不包含带电荷基团的脂族或芳族有 机残基。在图2A中所示的聚合性结构中，y>x，其表示中性基团(由“R²” 表示)以多于带电荷基团(由“R¹”表示)的量存在。

在一些实施方案中，包含结合基团的接枝聚合物是嵌段共聚物，其表 示它包括一种类型单体的长链或嵌段(例如包含中性或带电荷的结合基团)， 然后是另一种类型单体的长链或嵌段(例如若第一嵌段是中性的，则其是带 电荷的，并且第一嵌段是带电荷的，则其是中性的)。

在其他实施方案中，包含结合基团的聚合物包含无规排序的单体。

在其他实施方案中，包含结合基团的聚合物是交替共聚物，其中各单 体总在一侧与两个不同类的单体相邻。

在一些实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于图 2F，其中R⁴是NH或O；R⁵是直链或支链的脂族或芳族基团，例如-CH₂-、 -C₂H₄-、-C₃H₆-、-C(CH₃)₂-CH₂-、-C₆H₄-；并且R⁶是包含与聚合链的NH、 O或S连接基的直链或支链的脂族或芳族的不带电荷的基团。

在其他实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构示于图 2G。R⁷和R⁸独立地选自包含一种或多种中性的脂族和芳族有机残基的基 团，并且可包含杂原子，例如O、N、S、P、S、P、F、Cl等。

在另外的其他实施方案中，包含结合基团的聚合物的代表性化学结构 示于图2H。

图2B-2D和2F-2H中的磺酸基可以是所示的质子化形式以及包含合适 的反离子，例如钠离子、钾离子、铵离子等的盐形式。

IV.加入本文所述组合物的装置

在一些实施方案中，将本文所述的具有与固体载体连接的结合基团的 固体载体加入装置中。固体载体，例如微孔膜的合适装置包括滤芯(filtration  cartridges)、胶囊状件(capsules)和荚状件(pods)。示例性的装置还包括美国 公布US20100288690 A1和US20080257814 A1(援引加入本文)中公开的堆 叠的平板滤芯。在这些装置的情况中，固体载体永久性地与聚合性外壳粘 结，并且装置具有液体进口、出口和放空口，并且进一步使保留的液体体 积最小化。其他示例性装置包括折叠式滤芯和旋转缠绕式滤芯。另外的其 他实例是谱柱。谱柱可从各种合适的材料，例如玻璃、金属、陶瓷和 塑料制备。这些柱可由终端用户用固体载体装填，或还可由制造商预装填， 并以装填状态送至终端用户。

V.使用本文所述的组合物和装置的方法

包含具有与固体载体连接的结合基团(例如阳离子交换结合基团)的固 体载体的装置可用于以流通方式去除蛋白质聚集体。在用于制备级的分离 应用之前，对于合适的溶液条件，例如pH和导电性可开发并验证所述方法， 并且需确定装置上的蛋白质加载量范围。用于方法开发和验证的方法是本 领域中公知，并常规实践的。它们通常涉及本文的实施例中所述的试验设 计(DoE)。

通常在使用前用合适的缓冲液冲洗、消毒并平衡所述装置。将蛋白质 溶液调整至期待的导电性和pH，并且随后在恒压或恒流下泵入通过装置。 收集流出物，并分析蛋白质收率和聚集体浓度。

在一些实施方案中，本文所述的用于聚集体去除的装置与如美国专利 7,118,675(将其全部援引加入本文)教导的病毒过滤装置直接连接，该病毒过 滤装置设计用于确保病毒颗粒基于粒径去除。

使用本文所述的组合物和装置的流通式聚集体去除步骤可位于例如抗 体纯化方法中的蛋白质纯化方法的任意处。表1描述了加入流通式聚集体 去除(以粗体突出)作为一种或多种中间步骤蛋白质纯化方法的实例。应理解 可使用这些方法的许多变型。

本文所述的“蛋白质捕集”步骤是指蛋白质纯化方法中的步骤，其感兴 趣的蛋白质与净化或未净化的细胞培养流体样品的分离，其通过至少以下 的两个步骤进行：i)对细胞培养物流体进行选自以下一种或多种的步骤：在 谱树脂、膜、整体料、机织或无纺介质上吸附感兴趣的蛋白质；沉淀、 絮凝、结晶、结合可溶性小分子或聚合性配体，由此得到包含感兴趣的蛋 白质如抗体的蛋白质相；和(ii)通过将蛋白质洗脱或溶解入合适的缓冲溶液 中而重新构成感兴趣的蛋白质。

结合/洗脱式纯化是一种任选的方法步骤，其构成如下：将感兴趣的蛋 白质与合适的谱介质结合，任选地洗涤经结合的蛋白质，并将其用合适 的缓冲溶液洗脱。

流通式AEX精制(polishing)是一种任选的方法步骤，其构成如下：将 感兴趣的蛋白质溶液流通过合适的AEX谱介质而不显著地使感兴趣的 蛋白质与介质结合。

活性炭流通是一种任选的方法步骤，如共同未决的临时专利申请 61/575,349(援引加入本文)所描述的，其设计为去除各种方法相关的杂质。

病毒过滤由将蛋白质溶液流通经多孔膜构成，多孔膜可以平板或空心 纤维的形式，其以高LRV度截留病毒颗粒，同时基本使所有的感兴趣蛋白 质通过。

表1

应理解在上表1中，抗体捕集以及结合/洗脱式纯化步骤可以以下任意 的三种方式运行：(1)间歇方式，其中用目标蛋白质加载捕集介质，停止加 载，洗涤并洗脱介质，并收集混合体；(2)半连续方式，其中连续进行加载， 并且洗脱是间断的，例如在采用2个、3个或更多个柱的连续多柱谱步骤 的情况中；和(3)全连续方式，其中连续进行加载和洗脱。

使用本文所述的流通式阳离子交换固体载体的最佳流速可有时对固体 载体的聚集体去除具有影响，并且当固体载体位于病毒过滤器的上游时， 它也可影响病毒过滤器的性能。最佳流速可在使用感兴趣的蛋白质溶液的 简单的试验设置中容易地确定。典型的流速在约0.05-10CV/min之间的范 围。

表1中所示的一些示例性方法。特别是方法E、方法H和方法I不包 括结合-洗脱式阳离子交换谱步骤，但使用本文所述的方法仍确保聚集体 的去除。省略结合-洗脱式阳离子交换谱步骤为下游的纯化方法提供多项 显著的优点，即节省方法时间、方法开发简便、省去清洗和清洗验证等。 另一较大优点是省去高电导率洗脱，使得所进行的全部下游方法不添加盐， 其后不进行后续稀释。

本发明通过如下实施例进一步说明，其不应理解为限制性的。本申请 中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图均援引加入本文。

实施例

实施例1.阳离子交换(CEX)表面改性的膜的制备

在该试验中，使用各种密度的连接基团制备一系列CEX表面改性的膜， 在该情况中连接基是带负电荷的磺酸残基。阳离子交换基团的密度通过用 于表面改性的反应性溶液的配制进行控制。为了达到较低的密度，以不同 的量添加不带电荷的反应性单体N,N-二甲基丙烯酰胺。

制备一系列水溶液，其包含0-4.8重量%的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸 (AMPS)、0-4.8重量%的N,N-二甲基丙烯酰胺和0.8重量%的N,N’-亚甲基 双丙烯酰胺。将孔径为0.65um且厚度为0.125mm的亲水性超高分子量聚 乙烯膜切成14cm×14cm的方片，并将各片浸入一种所述溶液中经过30秒 以确保完全润湿。去除(nip off)过量溶液，并将膜在惰性气氛下暴露于2 MRad的电子束辐射下。然后将膜用去离子水清洗并在空气中干燥。

表2列出了所制备的各种CEX表面改性的膜。使用锂离子交换确定对 于膜8(不添加DMAM)的阴离子基团密度为0.13mmol/g，并且对于膜7(1:1 的AMPS:DMAM(重量比))为0.08mmol/g，其分别等同于34和21mM的配 体密度。

实施例2.使用静态容量测试法分析聚集体的结合选择性

在该试验中，测试实施例1中制备的具有不同密度的结合基团的CEX 膜对于结合蛋白质单体和蛋白质聚集体的选择性。

在pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中制备包含约15%聚集体的部分纯化 的单克隆抗体(被称为MAb I)的2g/L的溶液。在乙酸盐缓冲液中预沉浸14 mm的膜圆片，然后转移入0.5mL的抗体溶液。将溶液小瓶轻轻地振摇15 小时，并且通过体积排阻谱分析溶液中剩余的分子量类型。结果示于表2。

虽然MAb的通常低的收率表明在该试验中膜在以下的容量下加载，但 是其中一种膜7证实了实际上完全去除了二聚体和高分子量(HMW)聚集 体。这表明可达到强聚集体结合选择性。

表2

n/d–未检测

实施例3.对于部分纯化的单克隆抗体(MAbI)以流通方式的聚集体去除

在代表性试验中，验证了本发明的膜成功地以流通方式用于从包含单 克隆抗体的样品中去除蛋白质聚集体。

将来自实施例1的5个膜7的层密封入放空的聚丙烯装置中，其具有 3.1cm²的前部膜过滤面积和0.2mL的膜体积。该类型装置以下被称为“微 型”装置。将4.5g/L的经纯化的MAb I透析入pH5.0、50mM的乙酸盐缓 冲液中。将称为部分纯化的MAb I的所得材料在pH5、50mM的乙酸盐中 稀释成1g/L Mab I的浓度，其具有5%的聚集体，具有～3.0mS/cm的电导 率。然后将该材料(约80-100mL)以～1CV/min通过0.2mL的包含实施例1 的膜7或膜8的装置、或0.18mL的包含Pall S膜(市售自Thermo  Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)的Acrodisk装置中。在通过MAb之前， 用18mΩ的水润湿膜装置，并用50倍柱体积(CV)的50mM的乙酸钠(pH5.0) 平衡。收集MAb溶液的流通物用于使用分析性体积排阻谱(SEC)进行分 析。结果示于图3A-3C。清楚地是，实施例1中产生的具有比膜8更低密 度的AMPS结合基团的膜7提供更好的对于结合聚集体的选择性。

表3汇总了在约20%的聚集体突破下测得的三个膜的聚集体结合容量。 如所证实的，膜7显示出比市售膜，例如Pall S膜和膜8几乎高 3倍的聚集体结合容量。

表3.约20%的二聚体突破下的装置加载量和容量

实施例4.对于部分纯化的单克隆抗体(Mab II)在流通方式中的聚集体去除

在另一试验中，验证了本发明的膜成功地以流通方式用于从包含另一 单克隆抗体的样品中去除蛋白质聚集体。

使用1M Tris碱将蛋白质A的经纯化MAb II调节至pH5.0，并使用5 M NaCl溶液调节至3.4mS/cm的电导率。被称为部分纯化的MAb II的所 得材料的浓度为6g/L，具有2.4%的聚集体。然后将该材料(约18mL)通过 0.2mL的包含实施例1的膜7或膜8的装置。在通过MAb之前，用18mΩ 的水润湿膜装置，并用50倍柱体积(CV)的50mM的乙酸钠(pH5.0)平衡。 收集MAb溶液的流通物用于使用分析性体积排阻谱(SEC)进行分析。前 两个流出部分各为～4.5mL，而剩下的10个流出部分各为0.85mL。在MAb 处理之后，使用20CV的50mM乙酸钠溶液(pH5.0)洗涤该膜。使用50mM 的乙酸钠(pH5.0)+1M NaCl以30CV洗脱结合的蛋白质。膜上加载的MAb II的总量为531mg/ml。根据流通物中的单体量与通过膜的总单体的量计算 MAb的单体收率。

如图4A所示，在膜7的突破混合体中发现非常少的聚集体(混合体中 <0.1%)，其至多为～13g/L的聚集体-加载量，而对于膜8，观察到甚至在收 集的第一流出部分中也观察到聚集体突破，这表明膜7优异的聚集体容量。 对于膜8的突破混合体中的聚集体量为0.8%。在13g/L的聚集体加载量下， 单体收率对于膜8和膜7分别为93和86。尽管收率略低，但是对于膜7 没有发现聚集体突破。聚集体的延后突破是较高的聚集体结合容量的表示。 这些突破曲线可用以指导制备级聚集体去除的方法或装置的设计。例如， 包括膜7的装置可加载至少500g/L以达到<0.1%聚集体的混合体纯度。通 常，为了提高单体收率和降低方法相关的总成本，较高的加载量是非常期 待的。此外，通过增大加载量直至发现聚集体突破，或通过改进溶液条件 可达到较高的收率。流通数据清楚地证实了膜7对于聚集体去除的优异性 能。

图4B显示了使用两种不同批次的膜7，对于两个不同轮次的突破混合 体中的单体收率和聚集体含量。相比轮次1的530mg/ml，轮次2加载700 mg/mL。溶液条件(pH和电导率)在两个轮次中都相似，而MAb浓度不同(轮 次1:6g/L；轮次2:4.4g/L)。混合体中聚集体的量在两个轮次中都相似， 而收率上有些差异(但是，可预期收率差异可能归因于用于检测MAb浓度 的分析技术的一般变异性)。出人意料地是，甚至在700g/mL的MAb加载 量下，混合体中的聚集体量也仅为0.25%(轮次2；图4B)，其表明对于聚集 体的结合容量>15g/L。

实施例5.对于包含高pH-依赖性的聚集体的部分纯化的单克隆抗体(MabIII)以流通方式去除聚集体

在另一试验中，验证了本发明的膜成功地用于以流通方式从包含另一 单克隆抗体MAbIII的样品中去除蛋白质聚集体。

在电导率为3.5mS/cm的pH5、50mM的乙酸盐缓冲液中将部分纯化 的单克隆IgG进料(MAb III)的溶液制成6g/L。MAb III已预先休克至高 pH(11)以产生3.7%的总聚集体(通过SEC-HPLC检测)。使用5个膜7的层 预模制过滤面积为3.1cm2，并且体积为0.2mL的微型过滤装置。在通过 MAb之前，用18mΩ的水润湿该膜，并用50倍柱体积(CV)的50mM乙酸 钠(pH5.0)平衡。MAb溶液的流通在2.5CV/min下进行MAb溶液的流通， 并使用分析型体积排阻谱(SEC)收集流出部分用于分析。在膜上加载的 MAb III的总量为930mg/ml。根据流通物中的单体量与通过膜的总单体的 量计算单体收率。

如图5所示，与对于MAb I和II的实施例3和4相似地，膜7显示出 对于MAb III聚集体的高选择性和高结合容量(>10mg/mL)。

实施例6:蛋白质单体和蛋白质聚集体的纯化

在该试验中，使用制备型SEC制备纯抗体单体和聚集体以用于膜7的 进一步表征。

使用Sephacryl S-300HR(GE Healthcare)树脂从混合物纯化单体和聚集 体。以4.5–6g/L将4.5mL的部分纯化的MAb通过330mL的柱子。在 MAb进样前，用1倍柱体积(CV)的PBS平衡柱子。收集两个洗脱流出部分： 聚集体和单体流出部分。使用3000MW截留的Amicon UF膜将聚集体流 出部分浓缩10倍，并使用分析型SEC分析。在这些流出部分中，聚集体 含量>70%，浓度为～0.5g/L。

实施例7:空间质量作用(SMA)模型参数：特征电荷(ν)和SMA平衡常数(K_SMA)的确定

设计以下试验以阐明对于本发明的膜观察到的聚集体结合选择性的机 理。使用空间质量作用(SMA)模型(参见例如Brooks,C.A.和Cramer,S.M., Steric mass-action ion exchange:Displacement profiles and induced salt  gradients.AIChE Journal,38:pp.1969–1978,1992)测试聚集体与表面(v)的 相互作用的数量、以及单体与聚集体的亲和常数(K_SMA)以反映单体和聚集 体对表面的亲和性。

SMA模型已成功地用于解释一些非线性离子交换作用的复杂性。通过 考虑因直接的蛋白质-配体相互作用而“失去”(即或者不可结合)的位点和 因蛋白质的位阻而在空间上“失去”的位点，该模型考察蛋白质分子不可 利用的位点。因空间位阻的位点“失去”的量假设与结合的蛋白质浓度成 正比。对于单组分系统的SMA公式如下给出：

其中Q和C分别是结合蛋白质浓度和游离蛋白质浓度。K是SMA平衡缔 结常数；ν是特征电荷量；σ是空间因子；C_盐是游离盐浓度；Q_盐是可离子 交换的结合盐浓度；并且Λ是树脂的总离子容量。特征电荷量是通过离子 作用被蛋白质占据的改性固体载体上的平均位点数，而空间因子是在与吸 附剂结合时被蛋白质空间位阻的位点数量。

对于吸附等温线的线性区域(当Q非常小时)，Λ>>(σ+ν)Q，并且以上 公式可近似为：

术语Q/C定义为分配系数(K_p)，并且分配系数的比值定义为选择性(S)。 确定分配系数的一个可选方法是通过计算线性区域中的吸附等温线的斜率 (例如美国专利8,067,182中所描述的)。

在一个试验中，用水润湿0.2mL的膜微型装置(包括膜7或8)，并用 20CV(4mL)的50mM的乙酸钠(pH5.0)(缓冲液A)平衡。将100μl的纯化 单体或聚集体(按照实施例中所述的纯化方法)以0.5g/L进样。使用20CV 的缓冲液A和缓冲液A+500mM NaCl的梯度液洗脱结合的蛋白质。根据 蛋白质洗脱的盐浓度(电导率)的范围选择用于等度运行的盐浓度。通过在膜 上加载100μl的蛋白质进行等度运行。运行缓冲液是缓冲液A+盐(如上所 述使用根据蛋白质洗脱范围的不同盐浓度)。使用UV280或UV230信号监 测洗脱谱图，并注意蛋白质峰的保留体积。使用Pedersen等人(Pedersen  等人,Whey proteins as a model system for chromatographic separation of proteins,J.Chromatogr.B,790:pp.161-173,2003)所述的等度洗脱方法测定 SMA参数。

表4汇总了膜8和膜7对于MAb I的SMA参数。表4汇总了对于MAb II的SMA参数。假设离子容量对于膜8和膜7分别为34和21mM而确定 K_SMA。使用78%的膜孔隙率。

表4.对于MAb I的S_MA参数

表5.对于MAb II的S_MA参数

对于两个MAb，发现单体和聚集体的特征电荷量上的差异高于膜7， 这表示聚集体比单体更大的作用数量。此外，膜7的亲和性(如从K_SMA可 见)高于膜8。

如图6A和6B所示，在膜8和膜7的情况中发现聚集体的分配系数(亲 和性的度量)高于单体所发现的，由此表示对聚集体比对单体更强的结合 性。还发现相对于膜8，在膜7的情况中效果更明显，证实了前者对于聚集 体去除上更佳的性能。

如图7所示，对于两个不同的MAb(MAb I和MAB II)，在pH5.0下， 在所有的盐浓度下，膜7具有比膜8更高的选择性(S=聚集体的Kp对单 体的Kp的比值)。明显地，对于两个膜，选择性随着盐浓度的下降而增大。 并且，出人意料地是膜7的选择性的增大比膜8高得多，这表明甚至在较 低密度的结合基团下也可实现较高的选择性。此外，如图7所示，甚至在 较低的盐浓度(或高选择性)下实现了最大性能益处(较高的单体收率和较高 的聚集体去除性)。

实施例8:膜7的工作窗口的确定

在一个代表性的试验中验证了使用试验设计方法(DoE)可实现实际方 法的窗口，即溶液pH、离子导电率和本发明膜上的蛋白质加载量。试验设 计方法(DoE)是广为接受的工程工具，其用于确定可靠的工作条件(参见例 如Anderson,M.J.and Whitcomb,P.J.2010Design of Experiments. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology.1-22)。

对于膜7以间歇方式进行使用具有3因素的DoE方法的星点面效应 (central composite surface response)以确定它的工作窗口。研究的参数是： pH、电导率和聚集体加载量。使用13μl的膜将各条件(表5)下的各量的部 分纯化的MAb I(0.5–2.1mL)温育20小时。然后分析上清液的聚集体，并 使用分析型SEC分析收率。

表6.3因素的轮次和结果，星点面效应、试验设计方法

标号 pH 电导率(mS/cm) 聚集体加载量(g/L) 单体% 收率%

1 4   5 100 78.4

2 6 3 5 100 85.9

3 4 10 5 100 77.7

4 6 10 5 95.6 100

5 4 3 15 98.1 92.8

6 6 3 15 98.0 95.3

7 4 10 15 98.1 92.6

8 6 10 15 96.0 100

9 4 6.5 10 98.7 86.5

10 6 6.5 10 95.9 99.2

11 5 3 10 100 86.5

12 5 10 10 96.7 98.1

13 5 6.5 5 100 77.8

14 5 6.5 15 97.8 92.6

15 5 6.5 10 98.5 88.9

16 5 6.5 10 98.4 88.9

17 5 6.5 10 98.5 88.9

18 5 6.5 10 98.6 88.9

19 5 6.5 10 98.0 88.9

20 5 6.5 10 98.0 88.9

该DoE研究突出了在确定对于收率和聚集体去除的膜性能上的三个关 键的工作参数-加载量、pH和电导率，并给出了简单步骤来确定期待的工 作窗口。结果图示于图8和9中。

实施例9.在使用包含热诱导聚集体的进料流的抗体纯化过程中，使用本发明膜保护下游病毒过滤器

该实施例证实了包含本文所述的一种或多种阳离子交换结合基团的膜 可成功地用以提高纯化方法中的下游病毒过滤器的通量。

通常，先前已报导了在病毒过滤之前可使用表面改性的膜来预处理抗 体进料(参见例如美国专利7,118,675和PCT公布WO 2010098867，将其援 引加入本文)。由于病毒过滤的高成本，增大过滤器通量对于蛋白质产物的 最终成分具有直接影响。一些市售产品已被销售来特别提高病毒过滤器的 通量，包括购自EMD Millipore Corporation的那些，例如Prefilter 和Pro Shield。但是，如上证实的，相对于现有技术中所述或目 前市售的那些，本发明的膜在保护下游的病毒过滤器上优异得多。

按照以下步骤，使用SeraCare Life Sciences(Milford,MA)的IgG、人丙 种球蛋白5%溶液(编号#HS-475-1L)、在8.1或16.0mS/cm的pH5的50 mM乙酸盐(使用NaCl)中制备0.1g/L的热休克多克隆IgG进料用于测试病 毒过滤器的保护。在170rpm下搅拌1升的0.1g/L溶液(在8.1或16.0 mS/cm)，同时在设定为65°C的恒温水浴中加热1小时(达到该温度后)。将 溶液移离热源，搅拌并使其冷却至室温3小时，然后在4°C下冷藏过夜。 第二天将热休克的多克隆IgG温热至室温。在合适的经无菌过滤的pH和 导电率的缓冲液(8.1或16.0mS/cm)中制备新制的0.1g/L多克隆IgG。

使用9体积%的热休克多克隆IgG休克溶液和新制的0.1g/L多克隆IgG 溶液制备用于通量测试的最终溶液。使用10M HCl、NaOH或4M NaCl 进行最后的pH和电导率调节。使用3个膜层预模制过滤面积为3.1cm²的 微型过滤装置，并按1：1的面积比与Pro装置(EMD Millipore  Corp.,Billerica,MA)串联。将两个装置预润湿，并仅使用缓冲液(pH5、50 mM的乙酸盐，8.1或16.0mS/cm)放空以去除空气。在30psi的恒压下，经 过15分钟时间测定初始流量(mL缓冲液/min通量)以确定初始恒定的流量 值。在30psi下将进料切换为热休克的多克隆IgG进料，并测定体积通量， 并对时间作图，直至流量降低至仅初始缓冲液的25%。热休克多克隆IgG 的总通量在V75下测试(L/m²)，并转换为kg多克隆IgG/m²膜。如从表6 可发现的，膜7提供比膜8更佳的对病毒去除过滤器的保护(更大的体积通 量)。

表7

实施例10.使用本发明膜保护使用单克隆单体进料流的下游病毒过滤器

在电导率为8.5mS/cm的pH5、50mM的乙酸盐缓冲液中将部分纯化 的单克隆IgG进料(MAb III)的溶液制成6g/L。在高pH(11)下将MAb III预 先休克以产生4%的总聚集体(通过SEC-HPLC检测)。使用3个膜层预模制 过滤面积为3.1cm2的微型过滤装置，并按1：1的面积比与Pro 装置(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)串联。仅使用经无菌过滤的 缓冲液(pH5、50mM乙酸盐、8.5mS/cm)预润湿两个装置并放空以去除空 气。在产生30psi的恒定背压的恒定流速下另外将病毒膜预调节10分钟。 然后通过串联装置在200L/(m²-h)的恒流下进料MAb III溶液，并测定背压 与时间的关系。在测得的背压达到30psi的终点处测定总体积通量。将30psi 截断部分的L/m²通量转换为kg MAb/m²膜。

如下表8中可发现的，膜7提供比膜8更佳的对病毒去除过滤器的保 护(更大的体积通量)。

表8

实施例11.停留时间对与膜7流体连接的病毒过滤器的性能的影响

在该代表性试验中，研究停留时间对病毒过滤的性能的影响，其中病 毒过滤器位于流通式纯化方法中的膜7的下游。发现以较低流速通过包括 膜7和病毒过滤步骤的装置产生较高的病毒过滤器的通量。

将包括膜7(膜面积为3.1cm2，并且膜体积为0.12mL)的三层装置与膜 面积为3.1cm2的病毒过滤装置串联。将在20mM乙酸钠的pH5.0缓冲液 中的约3mg/mL的多克隆人类IgG(Seracare)通过这两个连接的装置。在两 个不同的流速(100和200LMH)下进行试验。在阳离子交换谱装置和病毒 过滤装置之间设置0.22μm无菌过滤器。

将压力传感器用于测试以不同流速经过组装件的压力。通常，约50psi 的压力表示病毒过滤膜污染或堵塞。如图10所示，当试验在较低流速(即 100LMH)下进行时，相对于以较高的流速(即200LMH)处理样品，更多的 样品体积可经过病毒过滤膜(即较高的通量)。这可能归因于阳离子交换谱 装置中样品较长的停留时间，其可产生对于高分子量IgG聚集体的结合上 的改进，由此避免病毒过滤器过早堵塞。

实施例12.将多个流通式杂质去除步骤连接成一体

在该代表性试验中，验证将多个杂质去除步骤连接成一个简单的操作， 同时符合纯度和收率目标的可行性。这是通过将单个装置，也就是活性炭、 阴离子交换谱装置(例如ChromaSorb^TM)、在线静态混合器和/或用于pH 变化的缓冲罐、本文所述的用于聚集体去除的阳离子交换流通式装置和病 毒去除装置(例如Pro)连接而进行。

以下描述设置、平衡和步骤。

流通式纯化组列(train)由5个主要的单元操作构成：活性炭(前侧具有 任选的厚度过滤器)、阴离子交换谱装置(例如ChromaSorb)、在线静态混 合物和/或用于在线pH调节的缓冲器、用于聚集体去除的阳离子流通式装 置和病毒过滤装置(例如Pro)。

图11说明了连接这些单元操作的次序。

可另外包括需要的泵、压力、电导率和UV传感器。

在不同的工作站单独润湿所有装置，然后组装。根据制造商规程润湿 和预处理所述装置。简言之，用100L/m2的水，然后用5体积的平衡缓冲 液1(EB1;用1M Tris-base,pH11调节至pH7.5的蛋白质A洗脱缓冲液) 冲洗深度过滤器(A1HC级)。将2.5mL的活性炭装填入如申请日为2011年 8月19日的共同待定的美国临时专利申请61/575,349(援引加入本文)所述的 2.5cm的Omnifit柱，以产生0.55kg/L的MAb加载量。用10CV的水冲 洗该柱，然后用EB1平衡，直至pH稳定至pH7.5。将两个ChromaSorb装 置(0.2和0.12mL)串联以得到4.3kg/L的抗体加载量。用水以12.5CV/min 润湿所述装置至少10min，然后用5DV EB1润湿。将具有12个组件的可 抛弃的螺旋静态混合器(Koflo Corporation,Cary,IL)用以进行在线pH调节。 将两个1.2mL的包括膜7的装置并联以去除聚集体，由此它们可加载约570 mg/mL的抗体。

用10DV的水，然后用5DV的平衡缓冲液2(EB2；用1M乙酸调节 至pH5.0的EB1)润湿装置。用5DV(装置体积)的EB2+1M NaCl进一步 处理装置，然后用5DV EB2平衡。用在30psi下加压的水润湿3.1cm2 Pro装置至少10min。然后每分钟监测流速，直至流速在连续3 分钟保持恒定。在润湿和平衡所有装置之后，将它们如上图所示地连接， 将EB1流过整个系统，直至所有压力读数和pH读数稳定。平衡之后，将 进料(调节至pH7.5的蛋白质A洗脱液)流过流通式组列。在该轮次中，在 缓冲器之前和在Pro之后收集样品以监测IgG浓度和杂质水平 (HCP、DNA、浸取的PrA和聚集体)。在进行进料之后，用3倍固定体积 的EB1冲洗系统以回收装置和管道中的蛋白质。

用于经连接的流动式方法的进料是MAb IV的蛋白质A洗脱液，其在 间歇式蛋白质A方法中制备。在该MAb中的聚集体的天然含量不超过1%， 所以开发特殊的步骤来提高聚集体含量。用NaOH水溶液，在温和搅拌下 将溶液pH提高至11并保持1小时。然后用HCl水溶液在温和搅拌下将pH 缓慢地降低至pH5。pH循环重复4次以上。聚集体的最终浓度为约5%， 如通过SEC测定的，其主要由MAb IV的二聚体和三聚体构成。然后将进 料透析入Tris-HCl缓冲液中(pH7.5、电导率约3mS/cm)。

用于该轮次的MAb进料为102mL的13.5mg/mL MAb IV，流速为0.6 mL/min。

在ChromaSorb之后与装置加载量相关的HCP突破量低于10ppm的上 限值(图12)。通过CEX装置将聚集体从5%降低至1.1%(图13)。该连接方 法的MAb IV收率为92%。Pro装置上的通量>3.7kg/m2。

实施例13-19验证了使用阳离子交换树脂或翅状纤维作为固体载体而 非膜，在流通式模式下用于去除聚集体的组合物的制备可行性。

实施例13.用AMPS/DMAM接枝聚合物改性的聚合性强阳离子交换(CEX)树脂的制备

在该代表性试验中，制备具有不同密度的连接基团(其是负电荷的磺酸 残基)的接枝的AMPS/DMAM共聚物表面(强CEX)的一系列阳离子交换 (CEX)树脂。通过用于表面改性的反应性溶液的组成来控制强阳离子交换基 团的配体密度和组成。为了改变强阳离子交换基团的密度，在各摩尔比下 加入带电荷和不带电荷的反应性单体、AMPS和DMAM。

以830mL的设定体积标记具有机械搅拌器和滴液漏斗的1000mL的 三颈烧瓶。在该烧瓶中，将8.25g的氢氧化钠溶于429.34g的去离子水中。 将溶液冷却至0°C，并数次缓慢加入13.68g的AMPS，同时搅拌。其后， 加入26.22g DMAM。通过加入65%的硝酸和/或1M的氢氧化钠将溶液的 pH值调节至6.0-7.0。将400mL的平均粒径为50μm的沉积法聚合性基础 球树脂加入溶液中，同时温和搅拌(120rpm)。通过加入去离子水将反应混 合物的总体积调节至830mL(根据标记)。通过加入65%的硝酸再次将混合 物的pH值调节至6.0-7.0。温和搅拌混合物(120rpm)，并加热至40°C。在 剧烈搅拌(220rpm)下快速加入15g去离子水中的6.75g的硝酸铈(IV)铵和 2.96g65%的硝酸的溶液。然后在120rpm下、在40°C下搅拌反应混合物3 小时。

其后，将反应混合物倒入玻璃熔料(孔隙率P3)中，并通过抽吸移除上 清液。用以下溶液依次洗涤剩余的树脂：3x400mL去离子水；10x400mL 1M硫酸+0.2M抗坏血酸；3x100mL去离子水；10x400mL热去离子水 (60°C)；2x400mL去离子水；2x400mL 1M氢氧化钠；2x100mL去离子 水；在第二洗涤步骤中，用去离子水，用25%盐酸将pH调节至6.5-7.0；2 x400mL70%乙醇/30%去离子水；2x100mL去离子水；和2x100mL20% 乙醇/80%去离子水+150mM NaCl。

在完成以上的洗涤步骤之后，将树脂储存作为20%乙醇、80%去离子 水和150mM NaCl的溶液中的1:1(v/v)的悬浮液。

表9列出了按照该实施例制备的具有不同的AMPS和DMAM的摩尔 比的、合成性的、含磺酸的强CEX树脂。

表9:按照该实施例制备的合成性CEX树脂

实施例14.使用由AMPS/DMAM接枝共聚物改性的聚合性强阳离子交换(CEX)树脂从单克隆抗体进料去除聚集体

将批号#12LPDZ119、12LPDZ128和12LPDZ129的树脂样品装填入内 径为6.6mm的谱柱中至3cm的床高，产生约1mL装填树脂床。 安装AKTA Explorer 100(谱系统)，并用适于检查用于流通式谱的这些 柱子(表10)的缓冲液平衡。将包含树脂样品12LPDZ119、12LPDZ128和 12LPDZ129的谱柱安装在具有平衡缓冲液的谱系统上。进料是使用 Ultra Plus亲和谱介质纯化的IgG1(MAbB)，并且使用2M Tris Base调节至pH5.0。蛋白质A混合物的最终MAbB浓度为13.8mg/mL， 其包含2.05%的聚集体产物，并且电导率为约3.5mS/cm。将树脂加载3分 钟的停留时间，并且加载密度至414mg/mL。

表10：对于批号#12LPDZ119、12LPDZ128和12LPDZ12的树脂样品进行 谱试验的方法

将流通物收集为2mL流出部分，并在NanoDrop2000光谱仪上检测总 蛋白质浓度，并通过体积排阻高效液相谱(SE-HPLC)对聚集体定量。使用 Tosoh Bioscience TSKGel G3000SWXL,7.8mm x30cm,5μm(编号#08541) 柱，0.2M磷酸钠(pH7.2)的平衡缓冲液进行聚集体定量测试。结果显示在 高浓度下，在流通流出部分中收集的mAbB单体蛋白质比聚集产物的累积 蛋白质加载量相对低得多。

对于批号#12LPDZ119，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下回收 368.1mg或约88.9%的蛋白质，流通流出部分中的聚集体含量从2.05%降低 至0.39%，并且清除混合体(Strip pool)包含21.2%的聚集体，这暗示树脂选 择性地保留聚集体的能力。

对于批号#12LPDZ128，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下回收 357.9mg或约86.4%的蛋白质，流通流出部分中的聚集体含量从2.05%降低 至0.14%，并且清除混合体包含13.4%的聚集体，这暗示树脂选择性地保留 聚集体的能力。

对于批号#12LPDZ129，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下回收 359.9mg或约86.9%的蛋白质，流通流出部分中的聚集体含量从2.05%降低 至0.52%，并且清除混合体包含16.8%的聚集体，这暗示树脂选择性地保留 聚集体的能力。

图14显示了对于批号#12LPDZ119的mAbB单体和聚集体的突破；图 15显示了对于批号#12LPDZ128的mAbB单体和聚集体的突破；并且图 15显示了对于批号#12LPDZ129的mAbB单体和聚集体的突破。

如图14所证实的，使用批号#12LPDZ119的树脂，在110mg/mL的累 积蛋白质加载量下，流通流出部分中收集的MabB浓度达到它的初始加载 浓度的>90%。但是，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下，聚集体含量 仅为初始加载浓度的0.56%或27.8%。这暗示了该树脂选择性地保留聚集物 质达到高蛋白质加载量，同时使蛋白质单体(MAb)能够以其总初始质量的 88.9%回收。

如图15所证实的，使用批号#12LPDZ128的树脂，在138mg/mL的累 积蛋白质加载量下，流通流出部分中收集的mAbB浓度达到它的初始加载 浓度的>90%。但是，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下，聚集体含量 仅为初始加载浓度的0.42%或20.9%。这暗示了该树脂选择性地保留聚集物 质达到高蛋白质加载量，同时使蛋白质单体(MAb)能够以其总初始质量的 86.4%回收。

如图16所证实的，使用批号#12LPDZ129的树脂，通过110mg/mL 的累积蛋白质加载量，流通流出部分中收集的mAbB浓度达到它的初始加 载浓度的>90%。但是，在414mg/mL的累积蛋白质加载量下，聚集体含 量仅为初始加载浓度的0.99%或49.2%。这暗示了该树脂选择性地保留聚集 物质达到高蛋白质加载量，同时使蛋白质单体(MAb)能够以其总初始质量 的86.9%回收。

实施例15.由AMPS/DMAM接枝共聚物改性的聚合性强阳离子交换(CEX)树脂的制备

在250mL的玻璃罐中加入64ml的Toyopearl HW75-F谱树脂的湿 饼。然后向包含树脂的罐中加入115g的5M氢氧化钠、18.75g的硫酸钠和 4mL的烯丙基缩水甘油醚(AGE)。然后将罐子放入杂交仪(hybridizer)中在 50°C下过夜，并在中速下旋转。第二天，在烧结的玻璃过滤器组装件(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)中滤干树脂，并用甲醇洗涤湿饼，然后 用去离子水清洗。在玻璃小瓶中，加入10mL的AGE活性树脂的湿饼。向 玻璃小瓶中加入0.2g过硫酸铵、0.3g AMPS、1.2g DMAM和48g去离子水， 并将小瓶加热至60°C，持续16小时。第二天，在烧结的玻璃过滤器组装 件(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)中滤干树脂，并用甲醇和去离 子水洗涤湿饼，并将树脂标记为批号#1712。

实施例16.使用由AMPS/DMAM的接枝共聚物改性的聚合性强阳离子交换(CEX)树脂在不同的停留时间下从单克隆抗体进料去除聚集体

将从实施例14得到的批号#1712的树脂装填入内径为6.6mm的 谱柱中至3cm的床高，产生约1mL经装填的树脂床。安装AKTA Explorer100(谱系统)，并用适于检查用于流通式谱的这些柱子(与实施 例14相似)的缓冲液平衡。包含所述树脂样品的谱柱安装在具有平衡缓 冲液的谱系统上。进料是使用Ultra Plus亲和谱介质纯化的 IgG1(mAb5)，并且使用2M Tris Base调节至pH5.0。蛋白质A混合体的最 终浓度稀释为4mg/mL，其包含5.5%的聚集体产物，并且电导率为约3.2 mS/cm。将树脂加载1、3或6分钟的停留时间，并且加载密度至144mg/mL。 包含95.6%聚集体的3分钟停留时间的清除峰流出部分表明对于聚集物质 的高选择性水平。其结果示于下表11中。

表11显示了在6、3或1分钟停留时间下，在pH5.0下，对于使用 MAb5的批号#1712的单体和聚集体的保留性。如表11所示，平均地，单 体物质可以接近进料浓度的浓度收集，对于所有测试的停留时间，其比聚 集物质相对更早，其暗示选择性对于流速相对不敏感。

表11

图17显示了在pH5下和3分钟停留时间下使用MAb5的批号#1712 的谱图。如图17所示，在流通物中收集大部分产物，并且这通过蛋白质 UV示踪的相对快的突破表明。清除峰的大小通常根据条件和加载的总质量 变化，但与仅具有5.5%聚集体的加载材料相比，聚集体物质相对地富集 为95.6%，

实施例17.使用蛋白质A亲和谱，然后使用谱树脂的单克隆抗体的纯化

在本文所述的代表性试验中，使用蛋白质A亲和谱，然后使用本发 明的谱树脂纯化单克隆抗体。该试验的结果证实了不可预期的发现，即 以流通方式运行时，所述方法不需要提高电导率或使用稀释。

在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞培养物中表达IgG1(MAb5)。通过两 阶段深度过滤，然后通过无菌过滤净化细胞培养物。包含0.5mg/mL mAb5 的经净化的细胞培养物首先用Ultra Plus亲和谱介质(蛋白质A) 纯化。所使用的蛋白质A谱洗脱缓冲液是100mM的乙酸。使用2M Tris  base将蛋白质A洗脱混合物调节至pH5.0，并且所得溶液的电导率为约3.5 mS/cm。按照本文所述的方法在流通方式下运行批号#1712的树脂3分钟 的停留时间，并且收集流通流出部分，并保留小等份用于检测。

将流通流出部分混合，调节至pH7.5，并使用加载至5kg/L的耐盐性 阴离子交换膜吸附剂的ChromaSorb或加载至150mg/mL的阴离子交换树 脂Fractogel TMAE以流通方式运行。对流出部分测定蛋白质浓度、聚集体 含量、过滤的蛋白质A和中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)。结果示于下表12。

表12

通常，谱纯化方法包括作为阴离子交换谱之前的步骤的传统的结 合-洗脱式阳离子交换谱，并进一步需要稀释步骤或缓冲液交换步骤以将 电导率降低至适于阴离子交换流通式谱的水平。但是，如表12所示，使 用本发明的阳离子交换介质的本文所述的方法不需要提高电导率以运行， 并因此在纯化步骤之前不需要稀释步骤或缓冲液交换步骤。

实施例18.使用由AMPS/DMAM接枝共聚物改性的强阳离子交换(CEX)的翅状纤维的制备

在该代表性试验中，将阳离子翅状纤维用作固体载体。

在1L玻璃罐中，将20g的干性尼龙多页或翅状的纤维与400g的4M 氢氧化钠、24g的硫酸钠和160mL的烯丙基缩水甘油醚(AGE)混合。然后 将然后将罐子放入杂交仪(hybridizer)中在50°C下过夜，并在中速下旋转。 第二天，在烧结的玻璃过滤器组装件中过滤纤维，并用甲醇洗涤湿饼，然 后用Milli-Q水清洗。一天后，用水洗涤，然后用甲醇洗涤，然后再用水洗 涤纤维，抽吸成干饼，并在真空烘箱中在50°C下干燥1天。将所得样品标 记为样品#1635。在三个单独的玻璃小瓶中，称重2g样品#1635的AGE活 化纤维的干饼，并加入玻璃小瓶中用于通过接枝的额外改性。以表13中的 所示的量向玻璃小瓶中加入过硫酸铵、AMPS、DMAM和去离子水，并将 小瓶加热至60°C，持续16小时，并连续旋转。其后一天，在烧结的玻璃 过滤组装件中过滤纤维样品，并用去离子水溶液洗涤湿饼。将包含纤维的 小瓶标记为批号#1635-1、1635-2和1635-5。然后滴定批号#1635-5的小离 子容量，发现其为约28μmol/mL。然后假设样品#1635-1和#1635-2也具有 小于28μmol/mL的小离子容量。

表13

成分 #1635-1 #1635-2 #1635-5

纤维(g) 2.0 2.0 2.0

过硫酸铵(g) 0.18 0.18 0.18

AMPS(g) 0.48 0.60 0.72

DMAM(g) 0.48 0.60 0.72

水(g) 28.86 28.62 28.38

实施例19:使用由AMPS/DMAM接枝共聚物改性的强阳离子交换(CEX)的翅状纤维从单克隆抗体进料去除聚集体

将从实施例17得到的批号#1635-1、#1635-2、#1635-5的改性翅状纤 维装填入内径为6.6mm的谱柱中至3cm的床高，产生约1mL 经装填的树脂床。安装AKTA Explorer100(谱系统)，并用适于检查用于 流通式谱的这些柱子(与实施例13相似)的缓冲液平衡。将包含翅状纤维 样品的谱柱安装在具有平衡缓冲液的谱系统上。进料是使用蛋白质A 亲和谱纯化的IgG1(mAb5)进料，并且使用2M Tris Base调节至pH5.0。 蛋白质A混合物的最终浓度为4mg/mL，其包含5.5%的聚集体或HMW产 物。将使用批号#1635-1和批号#1635-2的纤维装填的柱子加载至64mg/mL 的加载量，并将使用批号#1635-3的纤维装填的柱子加载至80mg/mL的加 载量。其结果示于下表14中。

表14

*N/A=不适用

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