C07K14/415 C12N15/82
1.早熟禾亚科(Pooideae)的第5组过敏原变体，其特征在于和 已知的野生型过敏原相比，具有降低的IgE反应性以及基本保留的与 T-淋巴细胞的反应性。
2.根据权利要求1的过敏原变体，选自Ph1 p 5a、Poa p 5和 Lo1 p 5。
3.根据权利要求1或2的一项或多项的过敏原变体，由Ph1 p 5a 衍生而得。
4.根据权利要求1至3中的一项或多项的过敏原变体，其特征在 于和已知野生型过敏原相比，对应于Ph1 p 5a的氨基酸序列区94-113 和175-198的至少一个区域或其组合缺失了。
7.根据权利要求1-6中的一项或多项的过敏原变体，其特征在于 它们是通过重组基因工程方法获得。
13.用作药物的权利要求1-7中的一项或多项的过敏原变体。
15.根据权利要求1-7中的一项或多项的至少一种过敏原变体在 制备用于早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原参与触发的过敏 症的药物中的应用。
5.过敏原Ph1 p 5a的变体，其特征在于选自氨基酸序列区94- 113和175-198的至少一个区域或其组合缺失了。
6.根据权利要求5的过敏原Ph1 p 5a的变体，它具有选自SEQ ID NO 4、6和8的氨基酸序列。
8.编码根据权利要求1-7中的一项或多项的过敏原变体的DNA分 子。
9.对应于选自SEQ ID NO 3、5和7的一个序列DNA序列的DNA 分子。
10.包含根据权利要求8或9的DNA分子的重组表达载体，它与 表达控制序列功能性地结合。
17.用作药物的权利要求10的重组表达载体。
11.使用权利要求8或9的DNA分子或权利要求10的表达载体转 化的宿主体。
12.通过培养权利要求11的宿主体以及从培养物分离相应的过敏 原变体而制备根据权利要求1-7的过敏原变体的方法。
14.用于早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原参与触发的 过敏症的药物组合物，包括对应于权利要求1-7中的一项或多项的至 少一种过敏原变体以及任选的另外的活性组分和/或佐剂。
16.用作药物的权利要求8或9的DNA分子。
18.用于早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原参与触发的过敏 症患者的免疫的DNA接种和/或所述过敏症的预防的药物组合物， 它包括权利要求16的至少一种DNA分子或权利要求17的至少一种表 达载体以及任选另外的活性组分和/或佐剂。
19.权利要求18的药物组合物，它包括氢氧化铝、具有免疫刺激 作用的包含CpG的寡核苷酸或上述两种组合的作为佐剂。
20.权利要求16的至少一种DNA分子或权利要求17的至少一种 表达载体在制备早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原参与触发的过 敏症患者的免疫的DNA接种和/或所述过敏症的预防的药物中的应 用。
具有降低的过敏原性和保留的T-细胞反应性的Phl p 5a衍生物
本发明涉及早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原变体的制备和 用途，其特征在于和已知的野生型过敏原相比，具有降低的IgE反应 性以及基本保留的与T-淋巴细胞的反应性。这些低过敏原性的过敏原 变体可用于草类花粉过敏患者的特定免疫疗法(弱敏性)或用于草类 花粉过敏的预防免疫疗法。
发明背景
I型变态反应具有世界范围的重要性。在工业化国家，最高达20 ％的人遭受诸如过敏性鼻炎、结膜炎或支气管哮喘的困扰。这些变 态反应由空气中存在的过敏原(空气过敏原)引起，这些过敏原由例如 植物花粉、螨、猫或狗等各种来源释放。而最高达40％的I型变态反 应又表现为特异性的与草类花粉过敏原的IgE反应性(Friedhoff 等.，1986，J.Allergy Clin.Immunol.78，1190-2002)。
触发I型变态反应的物质是蛋白、糖蛋白或多肽。经粘膜吸收后， 这些过敏原与致敏人的结合在肥大细胞表面的IgE分子反应。如果2 个IgE分子经过1个过敏原彼此连接，就导致效应细胞的介导分子(例 如组胺、前列腺素)和细胞因子的释放，然后引起相应的临床症状。
根据具有抗一些单个的过敏原分子与变态反应患者的IgE抗体反 应的相对频率，可以看出主要过敏原和次要过敏原的差别。
在梯牧草(Phleum pratense)的病例中，迄今为止，Phl p1(Petersen等.，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92：789-796)， Phl p 5(Matthiesen and Lwenstein，1991， Clin.Exp.Allergy21，297-307；Petersen等.，Int.Arch.Allergy Immunol.98：105-109)，Phl p6(Petersen等.，1995， Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)，Phl p2/3(Dolecek等.， 1993，FEBS 335(3)，299-304)，Phl p4(Haavik等.，1985， Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78：260-268；Valenta等.，1992， Int.Arch.Allergy Immunol.97：287-294，Fischer等.，1996， J.Allergy Clin.Immunol.98：189-198)和Phl p13(Suck等.，2000， Clin.Exp.Allergy30：324-332；Suck等.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)迄今被确定为主要过敏原。
在梯牧草(Phleum pratense)中占优势的主要过敏原为Phl p1 和Phl p 5，Phl p 5以5a和5b两种形式存在，其分子量不同并且由 各自的基因编码。推断地Phl p 5a和Phl p 5b的氨基酸序列已经通 过重组DNA技术的方法得以确定。Phl p 5a为约32kD的蛋白质并且 与85-90％的草类花粉过敏患者的IgE抗体反应。Phl p 5a以一系列 同源变体形式存在，其相互间因点突变而不同而可能对应于不同的等 位形式。相关草类，如黑麦草(Lolium perenne)、草地早熟禾(Poa pratensis)及其他的花粉包含与Phl p 5a同源的过敏原且一起已知 为第5组过敏原。这些草类第5组过敏原的高级结构同源性相应地引 起与草类花粉过敏患者的IgE抗体高的分子交叉反应性。
对变态反应有效的经典方法是特异性的免疫和脱敏 (Fiebig，1995，Allergo J.4(6)，336-339，Bousquet等.，1998， J.Allergy Clin.Immunol.102(4)，558-562)。在这些方法中，把天 然过敏原提取物以逐步增加剂量的方式给病人皮下注射。不过，该方 法必须承受变态反应甚至过敏性休克的风险。为了把这些风险降低到 最小程度，现在采用类变应原形式的新颖制备物。与未处理过的提取 物相比，这些化学修饰的过敏原提取物明显地降低IgE反应性，但具 有一致的T细胞反应性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。
使用通过重组方法产生的过敏原，有可能更实质性地优化方 法。通过重组方法产生高纯度的过敏原的确定的混合剂，如果需要与 各个病人相匹配，可以代替来源于天然过敏原的提取物，因为除了各 种过敏原外，后者还含有相对大量的免疫原性但不伴有过敏原性的蛋 白。用表达产物获得安全脱敏疗法的真实前景，可通过特异突变重组 过敏原来实现，在这些过敏原中，IgE表位被特异地缺失，而不损坏治 疗所须的T细胞表位(Schramm等.，1999，J.Immunol.162，2406- 2414)。
通过方法影响过敏患者中扰乱的Th细胞平衡的另一个可能 是，用编码相关过敏原(免疫性DNA疫苗)的可表达的DNA进行 。给啮齿类注射编码过敏原的DNA，已经得到了对过敏原特异的免 疫应答的初步实验证据(Hsu等.，1996，Nature Medicine 2(5)， 540-544)。
本发明的目的在于提供蛋白质和DNA水平的具有降低的IgE活性 而同时T-细胞反应性基本保留的早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏 原的新变体，并且因此适于特异性的免疫疗法和免疫的DNA接种。
附图
图1：早熟禾亚科(Pooideae)种类Phl p 5a同源cDNA序列相 关区域的对比：黑麦草(Lol p)、草地早熟禾(Poa p)、普通小麦 (Tri a)和大麦(Hor v)
编号：DNA插入的核苷酸位点
Phl p 5a、Poa p 5和Lol p 5序列：来自国家生物技术信息中 心(NCBI)，Bethesda，USA“Gen-Bank”数据库的cDNA序列
Hor v和Tri a序列：来自基因组研究所(TIGR)，Rockville， USA EST数据库的EST序列
黑边框：与Phl p 5a(基于GenBank AJ555152)一致的序列
带点的边框：对应于氨基酸94-113(基于GenBank AJ555152) 的缺失
带长划的边框：对应于氨基酸175-198(基于GenBank AJ555152) 的缺失
图2：早熟禾亚科(Pooideae)种类Phl p 5a同源氨基酸序列的 对比(相关的序列区域，由DNA序列推断)：黑麦草(Lol p)、草地 早熟禾(Poa p)、普通小麦(Tri a)和大麦(Hor v)
编号：DNA插入的核苷酸位点
Phl p 5a、Poa p 5和Lol p 5序列：来自国家生物技术信息中 心(NCBI)，Bethesda，USA“Gen-Bank”数据库的cDNA序列
Hor v和Tri a序列：来自基因组研究所(TIGR)，Rockville， USA EST数据库的EST序列
黑边框：与Phl p 5a(基于GenBank AJ555152)一致的序列
带点的边框：对应氨基酸94-113(基于GenBank AJ555152)的 缺失
带长划的边框：对应氨基酸175-198(基于GenBank AJ555152) 的缺失
图3：组氨酸融合蛋白形式的纯化的缺失突变体的SDS-PAGE
1)标记
2)rPhl p 5a wt(His)
3)Phl p 5a DM-Δ94-113(His)
4)Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)
5)Phl p 5a DM-Δ175-198(His)
6)标记
图4：纯化的非融合蛋白Phl p 5a DM-D94-113、175-198和rPhl p 5a wt(顶端)的SDS-PAGE和用αPhl p 5抗体进行的鉴定试验(底 端)
αPhl p 5 mAb α-1D11结合区175-198(只有rPhl p 5a wt 是阳性的)
αPhl p 5a mAb α-3B2结合两个Phl p 5a分子的连接点表位(两 个蛋白质均是阳性的)(mAb：单克隆抗体)
图5：缺失突变体Phl 5a DM-Δ94-113、175-198和重组野生型 Phl p 5a(纯化的非融合蛋白)的分析SEC
柱：Superdex75 HR10/30(Amersham Bioscience，Uppsala， Sweden)
洗脱液：PBS
箭头：排除体积
图6：缺失突变体Phl 5a DM-Δ94-113、175-198和重组野生型 Phl p 5a(纯化的非融合蛋白)的非-变性等电聚焦
1)IEF标记
2)rPhl p 5a wt
3)Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198
p1 rPhl p 5a wt＝8.7
pl rPhl p 5a DM-Δ94-113、175-198＝6.4
图7：用于检查Phl p 5a缺失突变体(非-变性的)的IgE结合 能力的剥离试验
P：临床确定的草类花粉过敏症患者的血清
图8：通过使用两个代表性的单份血清(a和b)和血清库(c)的 EAST抑制试验来确定Phl p 5a缺失突变体的降低的IgE反应性
-●-nPh p 5a/b
-○-rPhl p 5a wt
-△-rPhl p 5a wt(His)
-◇-Phl p 5a DM-Δ94-113(His)
-◆-Phl p 5a DM-Δ175-198(His)
-■-Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198
-□-Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)
P：临床确定的草类花粉过敏症患者的血清
图9：通过使用六个不同草类花粉过敏症患者(P)的嗜碱细胞的 嗜碱细胞活性试验来确定Phl p 5a缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94- 113、175-198的弱敏性
发明详述
cDNA序列的诱变和克隆
本发明特别优选的弱敏性Phl p 5a变体的起始点为通过特异性引 物经聚合酶链式反应(PCR)从梯牧草(Phleum pratense)总cDNA 中分离的野生型Phl p 5a异构体的cDNA(NCBI(国家生物技术信息 中心，Bethesda，USA)GenBank编号AJ555152)(SEQ ID NO 1)。 SEQ ID NO 2的氨基酸序列已经从cDNA序列推断出来。Phl p 5a，由 284个氨基酸组成，在大肠杆菌中以可溶性蛋白形式在胞内可溶性地表 达且随后被纯化。Phl p 5a(rPhl p 5a wt)的重组野生型形式与单 克隆抗-Phl p 5抗体以及能与天然纯化的Phl p 5a(nPhl p 5a)反 应的草类花粉过敏症患者的IgE抗体反应。
由所述的rPhl p 5a wt的cDNA起始，通过限制性酶切/连接方法 和PCR以及连接入表达载体pProExHTa(Invitrogen，Carlsbad，USA) 来制备一系列不同的缺失变体(缺失突变体)。分布于cDNA分子整个 序列的6至72bp长度的片段被缺失，导致在大肠杆菌中表达的蛋白的 多肽链中对应缺失体的诱导出现。
通过免疫印迹研究了Phl p 5a缺失变体与草类花粉过敏症患者的 代表性血清库中IgE抗体的结合能力。
在该方法中，令人惊奇的是，发现Phl p 5a的两个缺失变体(Phl p 5a DM-Δ94-113、氨基酸94-113缺失和Phl p 5a DM-Δ175-198、 rPhl p 5a wt的氨基酸175-198缺失)，其具有降低的与IgE抗体的 (代表性血清库)结合。这两个Phl p 5a缺失体作为包含两个有效缺 失(Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198)的双缺失变体构建的起始点。
以下描述通过遗传工程方法构建Phl p 5a DM-Δ94-113、Phl p 5a DM-Δ175-198和Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198和其生化和免疫 学表征。
对于缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113(SEQ ID NO 3、cDNA序列 (795bp)和SEQ ID NO4，氨基酸序列(264aa))，首先从rPhl p 5a wt起始制备两个片段。片段“F1-93”，编码rPhl p 5a wt的氨基酸 1-93，是通过利用引物1和引物5的PCR进行制备的，而片段 “F114-284”是利用引物4和引物6进行制备的(引物序列参见表1)。 在使用引物1和4的另外的PCR中片段“F1-93”和“F114-284”被用 作底物，其导致对编码缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113的完整cDNA 的扩增。通过PCR连接片段“F1-93”和“F114-284”的基础为两个片 段的共同序列区域。该序列区域通过PCR扩增片段“F114-284”而形 成，该PCR使用在其5’区域包含编码氨基酸88-93的额外的DNA序列 的特异性有义的寡核苷酸(表1)。
通过两个单独制备的cDNA片段的限制性酶切和随后的连接而产生 编码缺失变体Phl p 5a DM-Δ175-198(SEQ ID NO 5、cDNA序列 (783bp)和SEQ ID NO6、氨基酸序列(260aa))。5’端片段“F1- 174”是通过PCR使用引物1和2制备的而3’端片段“F199-284”是 使用引物3和4制备的。将cDNA片段用限制性酶Spel消化，随后连 接(参见表1)。使用引物1和4通过PCR将连接产物扩增。
缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的cDNA(SEQ ID NO 7，cDNA序列(723bp)和SEQ ID NO8，氨基酸序列(240aa))类似 地是从两个cDNA片段制备的。利用引物1和5以及以rPhl p 5a wt-cDNA为基质产生5’端片段，而利用引物4和6以及以Phl p 5a DM- Δ175-198-cDNA为基质产生3’端片段。通过对应于rPhl p 5a wt蛋 白的氨基酸88-93的共同序列区域，利用引物1和4经第三次PCR连 接片段，并且扩增片段。
将编码修饰的过敏原的cDNA经EheI和HindIII限制性酶切位点 连接入表达载体pProExHTa(Invitrogen，Carlsbad，USA)并且随 后进行全长测序。
早熟禾亚科(Pooideae)，例如草地早熟禾和黑麦草第5组过敏 原的免疫交叉反应基于非常相似的氨基酸序列。可以认为相应的基因 来自共同的祖基因。早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原中的同源 序列区存在于Phl p 5a wt蛋白序列(参考：GenBank AJ555152)的 缺失体Δ94-113和Δ175-198序列并且存在于其侧翼序列区。所述序 列区的高同源性可在DNA水平和氨基酸水平得到证实(图1和图2)。
表1：用于制备缺失变体的PCR引物列表
SpeI限制性酶切位点由下划线表示。
重组Phl p 5a分子的表达和纯化
将重组蛋白以组氨酸融合蛋白形式在大肠杆菌(JM109)中表达， 该融合蛋白含有整合的蛋白酶切割位点(表达载体pProExHTa； Invitrogen，Carlsbad，USA)，用于任选地除去组氨酸融合组分 (His)。将rPhl p 5a wt和缺失突变体首先通过将N-端组氨酸残基 特异性地结合至Ni2+螯合物基质(固定化的金属离子亲和谱，IMAC) 并且随后通过制备性的凝胶过滤(体积排阻谱)而纯化。
通过SDS-PAGE和分析SEC监控洗脱的蛋白的纯度。结果显示rPhl p 5a wt(His)、Phl p 5a DM-Δ94-113(His)；Phl p 5a DM-Δ 175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198(His)可以以 高纯度和单体形式制备(图3)。蛋白的身份是通过Phl p 5a-特异性 单克隆抗体被证实的。
IgE反应性是通过IgE结合技术(免疫印迹、剥离试验、EAST抑 制试验和嗜碱细胞活性试验)的检验和T-细胞反应性的研究以及使用 不带有组氨酸融合组分的检验物质而进行的。
为了达到这个目的，首先以融合蛋白的形式以类似于对照蛋白 rPhl p 5a wt的方式制得缺失变体。然而，组氨酸融合组分随后被酶 切除去(TEV蛋白酶，Invitrogen，Carlsbad，USA)，仅留下甘氨酸 作为靶蛋白N端蛋白酶切割序列的残基。将切除的组氨酸组分和用于 切割的蛋白酶通过IMAC彻底分离。经制备性的SEC后，通过SDS-PAGE 和分析性的SEC检验洗脱蛋白的纯度和组成，如图4和5分别显示的 rPhl p 5a wt和突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198。以纯化和 单体形式制得所有蛋白。通过对非-融合蛋白的非-变性等电聚焦 (IEF)的研究显示表面电荷的高度均一性(参见图6，图解Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198)。
通过单克隆抗-Phl p 5a的抗体(Allergopharma，Reinbek， Germany)α-1D11或α-3B2(参见图4，图解Phl p 5a DM-Δ94-113、 175-198)以及N-端测序证实重组蛋白的身份。
Phl p 5a缺失变体的降低的IgE结合的测定
用于测定变态反应分子的IgE反应性的一个简单的试验方法为通 过剥离试验研究来自过敏症患者血清的特异性IgE与膜-结合试验蛋白 的结合。
为此，将试验物质在非-变性条件下以相同的浓度和量依次结合在 硝酸纤维素膜条带上。可以将一系列所述膜条带与过敏症患者的多种 血清同时孵育。经过洗涤步骤后，将特异性结合的IgE抗体通过由抗 -hlgE/碱性磷酸酶偶联物促进的生反应而在膜上呈现出来。
通过使用43个草类花粉过敏症患者的血清在剥离试验中比较研究 重组蛋白rPhl p 5a wt(His)、Phl p 5a DM-Δ94-113(His)； Phl p 5a DM-Δ175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198 (His)的IgE反应性(图7)。
所有43个过敏症患者的血清包含Phl p 5a-特异性IgE抗体，其 与天然Phl p 5a(nPhl p 5a，此处未显示)和重组等同物rPhl p 5a wt(His)强烈地反应。
令人惊奇的是，清楚地显示所有43个患者血清的Phl p 5a-特异 性IgE抗体均不与缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His) 结合或仅以大大降低的程度相结合。该降低的IgE结合归因于缺失Δ 94-113和缺失Δ175-198。缺失变体Phl p 5a DM-Δ175-198(His) 在该试验的43个过敏症患者血清的35个中显示清晰可见的降低的IgE 结合能力。在一些试验中，氨基酸175-198缺失的影响如此之大以致 IgE的结合基本上完全被阻止(Ex.：P3、P20、P28)。
缺失Δ94-113对IgE结合反应性的影响相对较少被提及，但同样 是清晰可见的。与参照rPhl p 5a wt(His)相比，缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113(His)与43个过敏症患者血清中的19个IgE结合明显 地更微弱(Ex.：P31、P37、P42)。然而，相比Δ175-198引起的降 低，在许多个体试验中所述IgE结合的降低相对不那么明显。
因此很显然，这两个缺失对缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113、 175-198(His)的总IgE结合反应性的降低有贡献。
与剥离试验相反，EAST抑制试验(酶过敏原吸附试验)可研究溶 液中过敏原/IgE的相互作用，使得能干扰固定于膜上试验物质表位的 屏蔽被基本上排除。EAST抑制试验如下进行。给微量滴定板包被过敏 原，过敏原在此处为天然-ral Phl p 5(nPhl p 5a/b、Phl p 5a和 Phl p 5b的混合物)。通过洗涤除去未结合的过敏原分子后，将平板 用牛血清白蛋白封阻以防止随后的非特异性结合。将过敏症患者的IgE 抗体，作为个体血清的代表性库(血清库)或单个血清，以合适的稀 释度与过敏原包被的微量滴定板一起孵育。通过偶联至二级抗体(抗 -hlgE/碱性磷酸酶偶联物)的酶将底物转化成生的终产物而对过敏 原结合的IgE抗体量进行光度定量。
IgE抗体的结合受浓度依赖的可溶性过敏原或所要检测物质(重组 修饰的过敏原)的物质特异性的抑制。免疫化学相同的物质呈现一致 的抑制曲线。
在研究中所用的参照分子为nPhl p 5、rPhl p 5a wt以及组氨 酸融合蛋白rPhl p 5a wt(His)。除了其他分子，通过与这些参照 对比对组氨酸融合蛋白Phl p 5a DM-Δ94-113(His)、Phl p 5a DM- Δ175-198(His)和Phl p 5a DM-Δ94-113，175-198(His)以及 非-融合蛋白Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的IgE结合进行了研 究。
图8a-c代表性地显示试验物质与草类花粉过敏症患者的两个单个 血清和血清库的特异性的抑制曲线。nPhl p 5a/b在所有试验中显示 最大的抑制作用(浓度10μg/ml时约为80-95％的抑制作用)。rPhl p 5a的抑制作用明显较低，为最大值的70-80％。该作用由nPhl p 5a/b 的组合物引起，其除了异构体Phl p 5a外，还包含异构体Phl p 5b。 Phl p 5b的特异性IgE抗体不被rPhl p 5a wt抑制。
组氨酸融合组分对IgE结合没有影响。这在所有试验中通过rPhl p 5a wt(His)和rPhl p 5a wt的相同的抑制曲线清楚可见。这证实 了组氨酸融合蛋白试验的效力。
通常，两组患者血清在定性的IgE结合方面不同。
第一组由单独的血清P15表示(图8a)。这些过敏症患者的血清 包含IgE抗体，其与Phl p 5a的结合因缺失Δ94-113和Δ175-198 而降低。此处缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113(His)仅显示约最 大抑制作用的50％，而缺失突变体Phl p 5a DM-Δ175-198(His) 仅显示抑制作用的20-30％。
双缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198(His)在所用 的最高浓度时仅能抑制0-10％IgE抗体的结合。非-融合蛋白Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的使用证实了该结果(最大IgE抑制的0-10 ％)。
第二组过敏症患者的血清，由单个血清P44表示(图8b)，与第 一组的不同在于，血清中的IgE抗体与Phl p 5a DM-Δ94-113(His) 的反应和参照rPhl p 5a wt(His)(70-80％最大抑制)的同样良好， 然而没有或没有可检测量的与Phl p 5a DM-Δ175-198(His)反应的 IgE抗体(最大抑制的0-10％)。
双缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198同样显示对该组 过敏症患者的血清的很大程度降低的抑制作用(0-10％)，对于融合 蛋白和无融合组分的蛋白来说均如此。
这些过敏症患者的血清显然包含主要针对该分子C-端部分的表位 的IgE抗体。
20个过敏症患者的血清库的IgE抗体的IgE结合反应性的测定数 据强调了缺失Δ94-113和Δ175-198对Phl p 5a的IgE结合降低的 重要性(图8c)。两个单缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113(His) 和Phl p 5a DM-Δ175-198(His)显示较低的最大抑制作用，与rPhl p 5a wt(约70％)相比，分别为40-50％和约30％。双缺失突变体 Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198仅与血清库的IgE抗体非常微弱地 结合(最大抑制的10-15％)，其与剥离试验中43个过敏症患者的检 验相一致，表明该Phl p 5a变体在许多，即使不全是草类花粉过敏症 的患者中显示了很大程度上降低的IgE结合反应性。
通过嗜碱细胞活性试验测定缺失突变体的弱敏性
通过嗜碱细胞活性试验，研究了缺失突变体的降低的IgE结合能 力对效应细胞的膜-结合IgE通路中功能效应的影响及其活性。因此在 灵敏的体外试验中测定了变态反应中功能的降低。
对于嗜碱细胞活化试验，将来自过敏症患者肝素化的全血与各种 浓度的试验物质一起孵育。致敏物质能结合特异性的IgE抗体，该抗 体与嗜碱性粒细胞的高-亲和性IgE受体相联系。
由过敏原分子启动的IgE/受体复合物的交联产生信号传导，其引 起效应细胞的脱粒以及体内变态反应的起始。
在体外，过敏原-诱导的嗜碱免疫细胞的活化可通过与IgE受体交 联的信号传导偶联的表面蛋白(CD203c)表达的定量化而测定(Kahlert 等.，Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceeding of the EAACI 2002(2003)Naples，Italy 739-744)。通过荧光标 记的单克隆抗体结合至表面蛋白以及随后通过荧光-激活的流式细胞 术的分析而高灵敏度地测定细胞上表面蛋白的表达量以及细胞库中活 化细胞的百分比。
此处所用的参照物质为纯化的天然Phl p 5a(nPhl p 5a)和与 试验物质相似的rPhl p 5a wt。来自六个个体的双缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198对嗜碱细胞的试验结果在图9中以曲线显示。 来自全部10个确定为过敏症患者的嗜碱细胞的试验结果在表2中显 示。
参照分子的A50值(A50：活化的嗜碱细胞数达到最大值的50％ 时的过敏原的浓度)各自在～1.3-15pM(对于rPhl p 5a wt)以及～ 0.3-10pM(对于nPhl p 5a)的范围内变化(表2)。相反，缺失变 体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的A50值为～18-8400pM。测定 的所用三种物质的A50值被用于确定每个试验个体中相对于未改变的 参照分子nPhl p 5a和rPhl p 5a wt、缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113、 175-198的变态反应效力(表2)。
缺失变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的相对变态反应效力 (Pr，相对潜力)与参照分子rPhl p 5a wt相比降低了～12-5000倍， 或与参照nPhl p 5a相比降低了～16-32000倍(表2)。
表2：通过嗜碱细胞活性试验测定缺失突变体Phl p 5a DM-Δ 94-113、175-198的弱敏性
a活化的嗜碱细胞数达到最大值的50％时的过敏原的浓度
b相对潜力
c临床确定的草类花粉过敏症患者
d从A50 rPhl p 5a wt/A50 Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198 计算得到
e从A50 nPhl p 5a/A50 Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198计算 得到
f粗体的：最小和最大值
T-细胞反应性
让辅助性淋巴细胞与通过在抗原-呈递细胞(APC)中进行酶降解 而形成的过敏原的多肽片段(约12-25个氨基酸)反应并且在APC表 面包含了II型MHC分子的合适的多肽后将其呈递至T-细胞。该辅助性 的T淋巴细胞过敏原-特异性的活化对于随后的反应(增值、无反应性、 凋亡)以及功能性区分(TH1和TH2)是必需的。在脱敏作用中用过敏 原或过敏原变体处理的过敏原-特异性T淋巴细胞的影响被认为是 效力的关键。
为了研究T-细胞的反应性，通过常规方法用nPhl p 5或rPhl p 5 分子刺激而建立禾本科花粉过敏症患者的寡克隆T-细胞系(TCL)。
在增值试验中，用参照过敏原nPhl p 5a和rPhl p 5a wt和双 缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198刺激各种T-细胞系。通 过掺入[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷按照常规方法测定增值率。
表3：通过采用Phl p 5-特异性T-细胞系(TCL)的增值试验测 定缺失突变体Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198的T-细胞反应性
a从[3H]测定值计算得到。过敏原刺激的细胞培养物的cpm测定值 /未刺激的细胞培养物的cpm测定值
b供体：临床确定的草类花粉过敏症患者
来自六个过敏症患者的十个TCL的结果显示这些TCL受Phl p 5a DM-Δ94-113、175-198刺激而增值的强度与未改变的天然或重组野生 型过敏原的相当(表3)。
本发明因此涉及早熟禾亚科(Pooideae)的第5组过敏原变体， 其特征在于和已知的野生型过敏原相比，具有降低的IgE反应性以及 保留的T-淋巴细胞反应性。这些第5组过敏原优选Phl p 5a、Poa p 5 和Lol p 5，尤其优选Phl p 5a。
已经证实对应于在第5组过敏原中缺失或除去的Phl p 5a氨基酸 序列区94-113和175-198的氨基酸序列区特别有利于实现本发明的目 的，本发明尤其涉及所述的过敏原变体。首次提及的或其次提及的区 域可以分别缺失，但所述区域也可同时缺失，后者的实施方式是特别 优选的。
由于和早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原具有高度的序列同 源性，这些区域可在Phl p 5a序列与来自其他第5组过敏原的序列的 序列对比中明确地得到鉴定。上述过敏原变体优选始于Phl p 5a或对 应于序列SEQ ID NO 4、6或8。
本发明的过敏原变体可在基因工程方法帮助下从克隆的DNA开始 制备。然而原则上，对天然过敏原提取物的化学修饰也是可行的 (Fiebig，1995，Allergo J.4(7)，377-382)。
当然，在其他位点上进行另外的修饰-例如，为了提高弱敏性-通 过本发明申请所述的对第5组过敏原的改变也是可行的。这些修饰可 以是例如氨基酸的插入、缺失和交换、将蛋白质切割为片段以及将蛋 白或其片段与其他蛋白或多肽融合。
在制备此处详细所述的过敏原变体时，可通过基因工程方法引入 His标签以改善对过表达的蛋白的纯化。
本发明进一步涉及编码上述过敏原变体的DNA分子，尤其是根据 SEQ ID NO 3、5或7的序列，涉及包含该DNA分子的重组表达载体以 及使用所述DNA分子或所述表达载体转化的宿主体。合适的宿主体可 以是原核或真核的、单细胞体或多细胞体，如细菌或酵母。本发明优 选的宿主体为大肠杆菌。
本发明进一步涉及通过培养所述宿主体和从培养物分离相应过敏 原变体而制备本发明过敏原变体的方法。
本发明还涉及作为药物的上述过敏原变体、DNA分子和表达载体。
本发明进一步涉及用于早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原参 与触发的过敏症，或用于早熟禾亚科(Pooideae)第5组过敏原 参与触发的过敏症患者的免疫接种和/或所述过敏症的预防的药 物组合物，其包括这些过敏原变体或相应的DNA分子或相应的表达载 体中的至少一种以及任选另外的活性组分和/或佐剂。
如果这些药物组合物为第二种类型(包括至少一种DNA分子或表 达载体)，则该组合物优选进一步包括氢氧化铝、具有免疫刺激作用 的包含CpG的寡核苷酸或上述两种的组合作为佐剂。
为了实现本发明的目的，药物组合物可用作人或兽类药物的 制剂。合适的赋形剂为有机或无机物质，其适于肠胃外给药并且不与 本发明的第5组过敏原变体反应。适于肠胃外给药尤其指溶液，优选 油性或水溶液，进一步为悬液、乳剂或植入物。本发明的过敏原变体 可以是经冷冻干燥的以及用于例如注射制剂制备的所得到的冷冻干燥 物。所述组合物可以是无菌的和/或包括佐剂，如润滑剂、防腐剂、稳 定剂和/或湿剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐类、缓冲物质和/或多 种另外的活性组分。
最后，本发明涉及至少一种本发明的过敏原变体或本发明的DNA 分子或本发明的表达载体在制备药物中的用途，其用于早熟禾亚科 (Pooideae)第5组过敏原参与触发的过敏症或早熟禾亚科 (Pooideae)第5组过敏原参与触发的过敏症患者的免疫接种和/ 或所述过敏症的预防。
序列表
<110>Merck Patent GmbH
<120>具有降低的过敏原性和保留的T-细胞反应性的Phl p 5a衍生物
<130>P 03/109
<140>DE 10325508.7
<141>2003-06-04
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>855
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>1
gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60
gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag 120
aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgccg ccggcgtccc gccagcggac 180
aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc 240
ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctcca aggccgcgct cacctccaag 300
ctcgacgccg cctacaagct cgcctacaag acagccgagg gcgcgacgcc tgaggccaag 360
tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag 420
gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag 480
gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccgccgccaa cgccgcgccc 540
gccaacgaca agttcaccgt cttcgaggcc gccttcaaca acgccatcaa ggcgagcacg 600
ggcggcgcct acgagagcta caagttcatc cccgccctgg aggccgccgt caagcaggcc 660
tacgccgcca ccgtcgccac cgcgccggag gtcaagtaca ccgtctttga gaccgcgctg 720
aaaaaggcca tcaccgccat gtccgaggcc cagaaggctg ccaagcccgc tgccgctgcc 780
accgccaccg caacctccgc cgttggcgcg gccaccggcg ccgccaccgc cgctactggt 840
ggctacaaag tctga 855
<210>2
<211>284
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>2
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Thr pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Pro Ala Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly Phe Lys Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Pro Ala Asp Lys Tyr Arg Thr
50 55 60
Phe Val Ala Thr Phe Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly
65 70 75 80
Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala
85 90 95
Leu Thr Ser Lys Leu Asp Ala Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala
100 105 110
Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu
115 120 125
Ser Glu Ala Leu Arg Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val
130 135 140
Lys Pro Ala Ala Glu Glu Val Lys Val Ile pro Ala Gly Glu Leu Gln
145 150 155 160
Val Ile Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala
165 170 175
Asn Ala Ala Pro Ala Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe Glu Ala Ala Phe
180 185 190
Asn Asn Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys
195 200 205
Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys Gln Ala Tyr Ala Ala Thr
210 215 220
Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr Val phe Glu Thr Ala Leu
225 230 235 240
Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys Pro
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Val Gly Ala Ala Thr
260 265 270
Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Lys Val
275 280
<210>3
<211>795
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>3
gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60
gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag 120
aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgccg ccggcgtccc gccagcggac 180
aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc 240
ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctccg gcgcgacgcc tgaggccaag 300
tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag 360
gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag 420
gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccgccgccaa cgccgcgccc 480
gccaacgaca agttcaccgt cttcgaggcc gccttcaaca acgccatcaa ggcgagcacg 540
ggcggcgcct acgagagcta caagttcatc cccgccctgg aggccgccgt caagcaggcc 600
tacgccgcca ccgtcgccac cgcgccggag gtcaagtaca ccgtctttga gaccgcgctg 660
aaaaaggcca tcaccgccat gtccgaggcc cagaaggctg ccaagcccgc tgccgctgcc 720
accgccaccg caacctccgc cgttggcgcg gccaccggcg ccgccaccgc cgctactggt 780
ggctacaaag tctga 795
<210>4
<211>264
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>4
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Pro Ala Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly Phe Lys Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Pro Ala Asp Lys Tyr Arg Thr
50 55 60
Phe Val Ala Thr Phe Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly
65 70 75 80
Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala Thr
85 90 95
Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu
100 105 110
Arg Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Glu Glu Val Lys Val Ile pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile Glu Lys
130 135 140
Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro
145 150 155 160
Ala Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe Glu Ala Ala Phe Asn Asn Ala Ile
165 170 175
Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala
180 185 190
Leu Glu Ala Ala Val Lys Gln Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala
195 200 205
pro Glu Val Lys Tyr Thr Val phe Glu Thr Ala Leu Lys Lys Ala Ile
210 215 220
Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Val Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr
245 250 255
Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Lys Val
260
<210>5
<211>783
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>5
gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60
gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag 120
aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgecg ccggcgtccc gccagcggac 180
aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc 240
ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctcca aggccgcgct cacctccaag 300
ctcgacgccg cctacaagct cgcctacaag acagccgagg gcgcgacgcc tgaggccaag 360
tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag 420
gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag 480
gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccagcacggg cggcgcctac 540
gagagctaca agttcatccc cgccctggag gccgccgtca agcaggccta cgccgccacc 600
gtcgccaccg cgccggaggt caagtacacc gtctttgaga ccgcgctgaa aaaggccatc 660
accgccatgt ccgaggccca gaaggctgcc aagcccgctg ccgctgccac cgccaccgca 720
acctccgccg ttggcgcggc caccggcgcc gccaccgccg ctactggtgg ctacaaagtc 780
tga 783
<210>6
<211>260
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>6
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Pro Ala Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly phe Lys Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Pro Ala Asp Lys Tyr Arg Thr
50 55 60
Phe Val Ala Thr Phe Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly
65 70 75 80
Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala
85 90 95
Leu Thr Ser Lys Leu Asp Ala Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala
100 105 110
Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu
115 120 125
Ser Glu Ala Leu Arg Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val
130 135 140
Lys Pro Ala Ala Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln
145 150 155 160
Val Ile Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ser Thr
165 170 175
Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala
180 185 190
Val Lys Gln Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys
195 200 205
Tyr Thr Val Phe Glu Thr Ala Leu Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser
210 215 220
Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala
225 230 235 240
Thr Ser Ala Val Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly
245 250 255
Gly Tyr Lys Val
260
<210>7
<211>723
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>7
gccgatctag gctacggccc ggccacccca gctgccccgg ccgccggcta cacccccgcc 60
gccccggccg gagcggagcc agcaggtaag gcgacgaccg aggagcagaa gctgatcgag 120
aagatcaacg ccggcttcaa ggcggccttg gccgctgccg ccggcgtccc gccagcggac 180
aagtacagga cgttcgtcgc aaccttcggc gcggcctcca acaaggcctt cgcggagggc 240
ctctcgggcg agcccaaggg cgccgccgaa tccagctccg gcgcgacgcc tgaggccaag 300
tacgacgcct acgtcgccac cctaagcgag gcgctccgca tcatcgccgg caccctcgag 360
gtccacgccg tcaagcccgc ggccgaggag gtcaaggtta tccctgccgg cgagctgcag 420
gtcatcgaga aggtcgacgc cgccttcaag gtcgctgcca ccagcacggg cggcgcctac 480
gagagctaca agttcatccc cgccctggag gccgccgtca agcaggccta cgccgccacc 540
gtcgccaccg cgccggaggt caagtacacc gtctttgaga ccgcgctgaa aaaggccatc 600
accgccatgt ccgaggccca gaaggctgcc aagcccgctg ccgctgccac cgccaccgca 660
acctccgccg ttggcgcggc caccggcgcc gccaccgccg ctactggtgg ctacaaagtc 720
tga 723
<210>8
<21l>240
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>8
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala Glu Pro Ala Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly Phe Lys Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Pro Ala Asp Lys Tyr Arg Thr
50 55 60
Phe Val Ala Thr Phe Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly
65 70 75 80
Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala Thr
85 90 95
Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu
100 105 110
Arg Ile Ile Ala Gly Thr Leu Glu Val His Ala Val Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile Glu Lys
130 135 140
Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ser Thr Gly Gly Ala Tyr
145 150 155 160
Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys Gln Ala
165 170 175
Tyr Ala Ala Thr Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr Val Phe
180 185 190
Glu Thr Ala Leu Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala GLn Lys
195 200 205
Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ser Ala Val
210 215 220
Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Lys Val
225 230 235 240
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>9
gccgatctag gctacggccc ggcc 24
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>10
aacataacta gtggcagcga ccttgaaggc ggcgtc 36
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>11
atctaactag tacgggcggc gcctacgaga 30
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>12
aacataaagc tttcagactt tgtagccacc agt 33
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>13
ggagctggat tcggcggcgc ccttggg 27
<210>14
<211>45
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>14
gccgccgaat ccagctccgg cgcgacgcct gaggccaagt acgac 45
本文发布于:2024-09-25 11:17:34，感谢您对本站的认可！
本文链接：https://www.17tex.com/tex/2/71225.html
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系，我们将在24小时内删除。
| 留言与评论（共有 0 条评论） |
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议