新型β-内酰胺抗生素、其制备方法及用途

新型β-内酰胺抗生素、其制备方法及用途

说明

本发明涉及以β-内酰胺衍生物为基础的新型抗微生物剂和它们作为抗 生素的用途。

背景技术

β-内酰胺抗生素，特别是头孢菌素类，属于最常用的抗生素。类似于 结构密切相关的碳头孢烯类和青霉素类，头孢菌素类抑制细菌细胞壁的合 成并且仅仅在细菌的生长期内具有杀菌效力。头孢菌素类的抗菌基团已重 点地得到了加工。临床使用的衍生物通常得自7-氨基头孢烷酸基体，其中， 变化都是对该基体进行的，例如在7位的R1取代、在3位的R2取代，还 有对于头霉素类，在7位具有附加的甲氧基。

大量合成的头孢菌素衍生物证明，头孢菌素类和碳头孢烯类比青霉素 类提供更好的结构修饰和效力优化的可能(U.，Biochemie der Antibiotika[Biochemistry of Antibiotics]，Spektrum Akademischer Verlag， Heidelberg，Berlin，New York，1992)。

在各组β-内酰胺抗生素中，已经证实存在因它们的效力谱和药代动力 学性质而为某些适应症所优选的物质。

过去，没有单种β-内酰胺衍生物可以被视为是普遍适用的。因此，为 了取得适合预期应用的衍生物，多用途分子的设计是必不可少的。

然而，对于这些一开始有效的抗生素也出现耐药性，特别是对葡萄球 菌(甲氧西林耐药金黄葡萄球菌菌株＝MRSA)。在所有高度工业化国家 中，临床分离菌株中耐药菌株的百分率不断升高，在美国、日本和中国， 目前等于大于70％。对于免疫应答减弱的病人，多重耐药葡萄球菌的医院 感染越来越难以克服。因此，开发具有对抗多重耐药葡萄球菌的效力的抗 生素是非常重要的。

头孢菌素类的羧基的酯化相当于目前的工艺水平，例如：M.Murakami， M.Hajima，F.Takami，M.Yoshioka(Heterocylces，1990，31，2055-264)。酯化 尤其导致能被更好地重吸收的衍生物。这时可以使用酶以便允许在保守条 件下发生反应。脂肪酶催化各种底物的酯化(Ching等人，Angew.Chem.101， 711-724，1989)。

式1的聚六亚甲基双胍盐酸盐

被称为杀微生物剂并且被以Vantocil IR、Polihexanid，Lavasept R或 PHMB-HCl的名称引入实践中用于消毒和抗菌药，并特别地用作伤口抗菌 药，而且还作为辅药用于急性和慢性骨与软组织感染外科护理的伤口处理。 它涉及不同分子量范围的聚合物混合物，它的分离至今只能使用谱法才 能检测到，但是在制备上不能操作。因此，已知的杀微生物剂效力总是涉 及所述聚合物混合物，但不是最佳化的。至今，医学上仅仅使用由具有不 同数量亚单位的聚合物制成的混合物，而不是盐酸盐。一般的聚合物具有 4-7个单位，分子量为900-1300g/mol。纯聚合物部分的产生至今还没有成 功。为了医学应用而进行聚合物混合物的纯化很困难并且昂贵。

β-内酰胺抗生素和聚六亚甲基双胍的组合至今还不为人知。

总之，因此可以说，β-内酰胺抗生素最重大的缺点是因为要对抗的细 菌的耐药性增强而使它们的效力越来越多地受到限制。在兽医学中，耕作 动物受多重耐药葡萄球菌的感染变得越来越普遍。

由于越来越多的耐药性问题，迫切需要新型的抗生素药物，而已知的 活性成分不能满足这种需要。

本发明的技术问题

因此，本发明的技术问题是公开新型的活性成分。本发明特别地基于 通过结构和效力上改变的且得自获得临床证明的活性成分的抗生素来满足 因为细菌对人和兽医学中的常规抗生素不断产生耐药性而引起的需要的技 术问题。

解决技术问题的技术方案

根据权利要求的特征解决所述技术问题。本发明提供新型的、过去未 知的来自β-内酰胺抗生素组的活性成分。而且，通过形成具有阳离子的β- 内酰胺抗生素的盐(它们本身具有活性成分特征)以及通过这些活性成分 经随后的化学反应进行精制来制备新型的化合物。

在式图4、7和8中说明了本发明的新型活性成分。

本发明的主题还包括制备本发明的β-内酰胺抗生素(包括中间产物) 的方法。为了解决所述技术问题，我们提出两种不同的途径，根据本发明， 它们可以有利地组合。

途径1：

令人惊奇地，由作为阴离子成分X-的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷 酸的衍生物和作为阳离子成分的聚六亚甲基双胍的衍生物制备的式图3的 β-内酰胺抗生素被证明是高效的。本发明的活性成分在所有被测的多重耐 药的细菌菌株、甚至是在作为盐酸盐的所述阳离子活性成分和所述阴离子 (即无阳离子成分的抗生素)均无效的菌株中都产生抑制作用。

微生物学研究显示，即使是非常难以对抗并且在临床上经常出现问题 的MRSA病菌也被所述新型活性成分灭活。因此，式3的本发明的活性成 分适用于急性和慢性伤口的抗感染，包括冲洗吸引引流术 (irrigation-suction drainag)和内脏腔的抗感染灌洗应用。

在这些过去未知的式图3或7的化合物中，β-内酰胺抗生素优良的杀 微生物性质与实践上极受关注的其它效力相结合。在实施方案之前，发现 式4-9以及这些式的反应方程10和11。通过与表面活性阳离子结合，刺激 物到达特别难以接近的部位。在式7的本发明的化合物中，亲水性的胍和 β-内酰胺基位于亲脂性烃链的对面，说明所述新型活性成分具有表面活性 剂性质。由于这些表面活性剂性质，本发明的化合物在生物被膜中也是有 效的。

这种类型的化合物可以得自式图2的至今没有被描述过的聚六亚甲基 双胍的碳酸氢盐。通过这种方式，利用所述碳酸氢盐比可商购的盐酸盐更 难溶于水得多。通过这种方式，最初，在水溶液中用碱金属碳酸氢盐将聚 六亚甲基双胍盐酸盐转化为式2的聚六亚甲基双胍碳酸氢盐

由此，与酸形成式3的聚六亚甲基双胍衍生物：

如果该沉淀通过部分添加碳酸盐或碳酸氢盐来逐步进行，那么，较高 分子量部分首先沉淀出来。这个原则一方面形成用于将双胍分离为各种分 子量范围的方法，该方法也用本专利加以保护。将聚合物混合物分离为具 有不同分子量范围的部分有利于许多应用领域。

具体地，该原则可以有利地用于制备过去没有描述过的新型β-内酰胺 抗生素衍生物。通过一方面用碳酸氢钠进行分级沉淀，和另一方面β-内酰 胺的取代，所得产物可以适应各种应用的需要，特别地，分布行为可以系 统地改变。通过β-内酰胺的取代，分布行为改变，logP值也因而改变。根 据实施方案，在抗生素(logP值＜0)中引入parachinoid取代(logP值＜或＞0)与 分布系数增加有关(logP值＞0)。

有利地应用式图2的抗溶性(antisoluble)碳酸氢盐和/或式图3的得自 该物质的盐(其中如果需要，抗微生物有效的脂肪酸衍生物和/或β-内酰胺抗 生素作为阴离子)，用于创伤敷料的吸收芯的抗微生物材料。具有浓度为 0.01-0.03％、特别有利地为0.02％的式图2的物质的吸收芯的材料的具体优 点是对吸收性敷料的杀菌效力有限。因此，尽管可作为抗微生物材料，但 不局限于将它分类为药品。

基于过去没有描述过的式图2的物质的抗溶解性(antisolubility)，实 现了创伤敷料内部和下方病菌生长的完全抑制，但是向伤口内的扩散被阻 止了。然而，观察到仅0.93±0.73mm(n＝7)的抑制区，即，在创伤敷料周 围区域中的扩散是最小的。仅仅在浓度＞0.04％时，才开始更大地扩散到伤 口。

通过这种方式，解决了未涂布的吸收性创伤敷料和具有吸收芯的伤口 敷布中出现的问题。在创伤敷料、尤其是在吸收芯中，发生强烈的病菌繁 殖，这一方面对愈合过程有害，另一方面也能导致病菌携带(carryover)。

根据本发明，通过所述聚六亚甲基双胍碳酸氢盐与6-氨基青霉烷酸或 7-氨基头孢烷酸的衍生物的反应，可以通过简单的制备方式获得许多过去 未知的具有高效地抗微生物的阴离子的六亚甲基双胍的盐。通过这种方式， 可获得具有许多用途的抗微生物化合物。

途径2：

另一方面，当多酚氧化酶的底物(在特别有利的方式中，式6或式9 的底物)在自由基的影响下与β-内酰胺抗生素(在特别有利的方式中，与 式5的衍生物)结合时，获得通式4或8(权利要求1)的新型β-内酰胺抗 生素。所述多酚氧化酶的底物的羟基可以根据式6和式9排列在对位或邻 位。

合成所述新型活性成分特别优选用漆酶EC 1-10.3.2(根据International Enzyme Nomenclature；Enzyme Nomenclature，academic Press，Inc.，1192，pp. 24-154)使2，5-二羟基苯甲酸衍生物氨基化，这造成宽的衍生可能性。

根据本发明，用儿茶酚类进行的氨基化局限于式8的活性成分。

本发明的活性成分的特征是，新的取代基改变应用性质，但不影响官 能团。因此，本发明的活性成分显示优于过去已知的β-内酰胺抗生素的优 点，即高杀菌效力且低毒性。

可以用生物学的、化学的和/或物理学的方法来产生合成本发明的新型 活性成分所需的基团。特别优选通过使用木素降解真菌的上清液和/或从分 离的基团形成酶的上清液产生的基团。有利地，使用分类为EC 1.10.3.2的 基团形成酶和分类为EC 1.11.17的过氧化物酶、一元酚单氧酶EC 114.99.1 和/或抗坏血酸氧化酶EC 1.10.3.3。作为一个例子，Trametes sp.漆酶可用于 合成所述新型活性成分。

由式4和8的新型活性成分开始，可以通过由现有技术已知的羧基酯 化获得其它新型抗生素。通过这种方式，可以使用酶(例如脂肪酶)以使 得在保守条件(低温、常压)下发生反应。

式图4和8的新型活性成分在金黄葡萄球菌(S.aureus)脓毒症小鼠模 型中的保护效力特别令人惊奇。在腹腔内感染小鼠后的存活测试中，在不 进行有效的情况下，100％的动物死亡。然而，在30min和6h后两次 施用本发明的活性成分导致动物完全恢复，而无可见的永久性损伤。当在6 和20h后给药本发明的抗生素时，获得相同的成功。本发明的新型活 性成分扩大了细菌感染中的可能性，因为对抗已变得多重耐药的 病菌的效力也能够被证明。

通式3、4和8的活性成分可以单独使用，也可以与其它活性成分联合 使用。

当使用通式7的新型活性成分时，获得独特的优势，因为在这种情况 下，获得非常有效的对抗多重耐药的病菌的化合物。

而且，本发明提供用于纯化聚六亚甲基双胍的方法，其特征在于，用 碱金属碳酸氢盐使聚六亚甲基双胍盐酸盐(式图1)在水溶液中沉淀，将沉 淀物从母液中分离，并用盐酸使其转化回纯化的式图1的产物。

对于制备其它的新型聚六亚甲基双胍的盐，实际上，所有酸性强度超 过所述碳酸氢盐的无机酸和有机酸都适合。通过这种方法，开发了其它应 用。

应用式图3的活性成分(其中抗微生物有效的脂肪酸衍生物和/或β-内 酰胺抗生素作为阴离子)产生针对局部施用的特别优点。作为牛乳腺炎预 防而施用于乳房特别有利。通过在施用于使用者的制剂中的使用，可以治 疗乳腺炎和/或可以预防葡萄球菌感染的传播并因此避免牛奶的污染。

当使所述新型β-内酰胺抗生素与脂质混合并且通过高压开裂均质化转 变为微米粒子(micro-particles)和纳米粒子(nano-particles)时，获得其它的适 合局部施用的制剂。

总之，应再次简述本发明：

第一次制备了式图3的β-内酰胺抗生素，其可以通过由作为阴离子成 分X的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸的衍生物和作为阳离子的聚六亚 甲基双胍的衍生物形成盐来获得。而且，制备了式图4的β-内酰胺抗生素， 其可以由可商购的式图5的活性成分经与式图6的活性成分的反应获得。 而且，式图8的β-内酰胺抗生素也是本发明的主题，它可以由可商购的式 图5的活性成分经与式图9的活性成分的反应获得。

描述了用于将聚六亚甲基双胍分离成不同分子量范围的方法，其特征 在于，用碱金属碳酸氢盐使聚六亚甲基双胍盐酸盐在水溶液中沉淀，其中 所述沉淀部分地、逐步地发生，通过这种方式，实现分级分离成窄分子量 范围的聚合物。式图3的活性成分的特征在于，以分级的方式用碱金属碳 酸氢盐使聚六亚甲基双胍盐酸盐在水溶液中沉淀，成为聚六亚甲基双胍碳 酸氢盐，并且用酸性强度超过所述碳酸氢盐的抗生素使沉淀产物转化。还 有可能，所述阴离子成分是抗微生物有效的脂肪酸。通过所述阳离子成分 的分级沉淀，所述活性成分的溶解性和分布行为可以被改变。用于纯化聚 六亚甲基双胍的方法也是本发明的主题，其特征在于，用碱金属碳酸氢盐 使聚六亚甲基双胍盐酸盐(式图1)在水溶液中沉淀，将沉淀物从母液中分 离，并用盐酸使其转化回纯化的式图1的产物。以这种方法，经聚六亚甲 基双胍碳酸氢盐与无机酸或有机酸的反应获得新型的聚六亚甲基双胍的 盐。

本发明的用途是吸收性创伤敷料的抗微生物材料，其特征在于，所述 材料用抗溶性的聚六亚甲基双胍的盐通过浸涂和/或喷雾来实现，其中保持 这样的浓度，在所述浓度下，不发生所述双胍至伤口的明显扩散。

我们将参考结构式和实施例更具体地说明本发明，但并不是将本发明 缩小到这些实施例。

实施例

总则：

实施例1-实施例36的结构分析和生物活性试验形成指示结构要素以及 式10对应的物质的基础。

实施例1

7-{2-2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基}-2-(4- 羟基苯基)乙酰氨基}脱乙酰氧基头孢烷酸1a

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝CONHCH₂CH₂OH)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)和75MHz(¹³C和DEPT-135)时记录核 磁共振波谱。¹H NMRδ2.01(s，3H，H-10)、3.19(d，J＝18.3Hz，1H，H-2)、 3.37(m，J＝5.7Hz，2H，H-9”)，3.43(d，J＝18.3Hz，1H，H-2)，3.57(t，J＝5.5 Hz，2H，H-10”)，4.89(d，J＝4.7Hz，1H，H-6)，5.65(dd，J＝4.7Hz，J＝8.9Hz， 1H，H-7)，5.87(d，J＝6.5Hz，1H，H-13)，6.56(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.67 (d，J＝10.1Hz，1H，H-5”)，6.82(d，J＝8.7Hz，2H，H-3’，H-5’)，7.39(d，J＝8.7 Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.52(d，J＝8.6Hz，1H，H-11)，9.77(t，1H，H-8”)，13.12 (d，1H，J＝6.2Hz，H-14)。¹³C NMRδ19.91(C-10)，30.34(C-2)，42.10(C-9”)， 57.97(C-6)，59.82(C-7)，61.52(C-10”)，62.95(C-13)，101.39(C-1”)，116.65 (C-3’，C-5’)，123.15(C-4)，129.83(C-1’)，129.96(C-2’，C-6’)，132.41(C-3)， 133.33(C-4”)，141.34(C-5”)，153.46(C-2”)，158.46(C-4’)，164.01(C-8)， 165.05(C-9)，170.12(C7”)，171.96(C-12)，184.60(C-6”)，185.52(C-3”)。 LC/MSm/z 557.5([M+H]⁺，597.5[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

稳定性检验

该新型活性成分在大于60天的储存期中证明是稳定的。图1显示了 7-{2-2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基}-2-(4-羟基 苯基)乙酰氨基}脱乙酰氧基头孢烷酸1a的储存稳定性。

实施例2

7-[2-(2-氨基甲酰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-(4-羟基苯基)乙 酰氨基]脱乙酰氧基头孢烷酸1b

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝CONH₂)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ2.01(s，3H，H-10)，3.15(d，J＝18.4，1H，H-2)，3.44(d，J＝18.4 Hz，1H，H-2)，4.89(d，J＝4.7Hz，1H，H-6)，5.65(dd，J＝4.7Hz，J＝8.8Hz，1H， H-7)，5.89(d，J＝6.9Hz，1H，H-13)，6.58(d，J＝10.3Hz，1H，H-4”)，6.69(d， J＝10.3Hz，1H，H-5”)，6.82(d，J＝8.7Hz，2H，H-3’，H-5’)，7.30(d，J＝8.6Hz， 2H，H-2’，H-6’)，7.39(d，J＝8.7Hz，1H，H-11)，9.07(s，2H，H-8”)，13.13(d， 1H，J＝6.8Hz，H-14)。LC/MS m/z 515.1([M+H]⁺，535.1[M+Na]⁺API-ES正 离子模式)。

实施例3

7-[2-(4-羟基苯基)-2-(2-甲氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)乙酰 氨基]脱乙酰氧基头孢烷酸1c

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ1.99(s，3H，H-10)，3.12(d，J＝18.1Hz，1H，H-2)，3.42(d，J＝ 18.1Hz，1H，H-2)，3.64(br s，3H，H-8”)，4.86(d，J＝4.6Hz，1H，H-6)，5.63(dd， J＝4.6Hz，J＝8.8Hz，1H，H-7)，5.89(d，J＝6.9Hz，1H，H-13)，6.58(d，J＝ 10.0Hz，1H，H-4”)，6.67(d，J＝10.1Hz，1H，H-5”)，6.77(d，J＝8.5Hz，2H， H-3’，H-5’)，7.20(d，J＝8.5Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.52(d，J＝8.7Hz，1H， H-11)，13.17(d，1H，J＝6.8Hz，H-14)。LC/MS m/z 528.3([M+H]⁺，550.1 [M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例4

7-[2-(2-乙氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-(4-羟基苯基)乙酰 氨基]脱乙酰氧基头孢烷酸1d

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₂CH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ1.14(br，3H，H-9”)，2.01(s，3H，H-10)，3.14(d，J＝18.4Hz， 1H，H-2)，3.43(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，4.08(br，2H，H-8”)，4.87(d，J＝4.7 Hz，1H，H-6)，5.66(dd，J＝4.7Hz，J＝8.8Hz，1H，H-7)，5.89(d，J＝6.9Hz，1H， H-13)，6.58(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.68(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)，6.78 (d，J＝8.5Hz，2H，H-3’，H-5’)，7.20(d，J＝8.4Hz，2H，H-2’，H-6’)，7.55(d，J ＝8.7Hz，1H，H-11)，13.17(d，1H，J＝6.7Hz，H-14)。LC/MS m/z 543.9 ([M+H]⁺，564.0[M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例5

式4的新型化合物的体外抗微生物效力

方法：

试验系统1(抗微生物效力)

预培养：

将试验病菌大肠杆菌(Escherichia coli)SBUG 1135和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)SBUG 1152提取到5ml营养培养基II中过夜(17h， 37℃)。在摇动培养箱(INFORS AG CH 4103，Bottmingen，Switzerland)中以 180rpm的摇动频率进行培养。

培养17h后，大肠杆菌细胞密度达到约2.4×10¹⁰细胞/ml，巨大芽孢 杆菌的细胞密度达到约2.1×10¹⁰细胞/ml。

营养琼脂的接种：

选择将细菌接种到琼脂中，以便在培养后产生密集的但未融合的个体 菌落。

使用以下的量：

巨大芽孢杆菌：10ml营养琼脂中的0.1ml未稀释的过夜培养物 其相当于10⁶的细胞数量。

大肠杆菌：用生理盐水溶液1∶100稀释，0.1ml转变为10ml营养 琼脂。这相当于10⁶的细胞数。

接种了的营养琼脂置于无菌培养皿中，使其干燥几分钟。

抗微生物效力试验：

以步进的量(10μg，50μg，100μg)使试验物质沉积在活性成分载体上 (敏感圆盘)。为此，根据它们的溶解度，将试验物质溶解在甲醇或A.dest. 中。各接种板装配有3个试验取样板。

于37℃培养20h后，可测量单个试验取样板周围的抑制区。以mm说 明抑制区的直径。

试验系统II(对抗多重耐药病菌的效力)

为此，将细菌培养在Müller-Hinton-Agar II板上。

用1-1.5ml的生理盐水溶液制备McFarland 0.5(相当于150×10⁶病菌 的细菌密度)的细菌悬浮液。然后，用无菌玻璃棒将一小滴细菌悬浮液置 于Müller-Hinton-Agar板上并按三层涂布(垂直的、水平的和横向的)。然 后，将带有新型半合成的试验物质的敏感圆盘放置在顶部。将装配好的板 在37℃培养18-20h。培养后，读取抑制区的直径，作为该新型半合成试验 物质的抗微生物活性的量度。

结果：该新型活性成分具有强抗微生物效力(表1)。

实施例6

通过分级沉淀使式2的活性成分的阳离子组分适应生物学需要(例如 抗微生物效力)

通过用碳酸氢钠使可商购的聚盐酸己双胍(Dr.Trippen GmbH，Freiburg) 分级沉淀，将聚合物混合物分离成溶解度和脂质-水分配关系相互明显不同 的各个部分。

本发明的方法

通式2的活性成分(其中阿莫西林代表阴离子)的抗微生物效力。

方法参照实施例5

结果：新型活性成分的效力大大超过商品Lavasept(Desomed AG)(表 2)。

表1.新型活性成分1a-1d和2a的抗微生物效力。

¹抑制区直径(以mm计)

²r＝耐药的(没有检测到抑制区)

表2与Lavasept(量为0.09μmol)比较，式2的化合物(其中X-＝阿 莫西林阴离子)对抗多重耐药的细菌的抗微生物效力

¹抑制区直径(以mm计)，²r＝耐药的(没有检测到抑制区)

表3

与6-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨 基]-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基}青霉烷酸(量为0.09μmol)比较，式3的化合物 (其中X-＝6-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨 基]-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基}青霉烷酸盐)对抗多重耐药细菌的抗微生物效 力

¹r＝耐药的(没有检测到抑制区)

该新型活性成分在所有被测的多重耐药细菌菌株中、甚至在阳离子和 无阳离子组分的抗生素都对其无效的菌株中都产生抑制作用(表3)。

实施例7

通过与本身具有活性成分性质的阳离子形成盐来制备新型头孢菌素

用7-氨基头孢烷酸与式4(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，R4＝ CONHCH₂CH₂OH，X＝S)的活性成分和式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃， X＝S)的活性成分转化实施例6的部分。在此，获得具有强抗微生物效力的 产物。

实施例8

式7(实施例7)的物质的体外抗微生物效力

方法

实施一系列稀释试验。测定导致生长绝对抑制的重量百分比浓度(最 小抑制浓度，MHK)。

结果

式7的活性成分有效对抗广谱的病菌(表4)。

表4.通式7的活性成分的MHK(以μmol/l计)

 金黄葡萄  球菌SBUG 11   枯草芽孢杆菌   SBUG 14S   奇异变形   杆菌SBUG   47   大肠杆菌   SBUG 17   粘质沙雷菌   SBUG 9  式7的活性成分  0,06   0,06   0,12   0,5   0,5

实施例9

实施例6的化合物在局部施用中的抗微生物效力的检验

方法

使用“小鼠耳试验”模型来进行检验：

在处死动物后，切下小鼠耳并装在专门的夹持装置上。用5μl 1∶10稀 释的具有对应于McFarland标准0.5的光密度的MRSA菌株“北德传染性 菌株”的悬浮液来感染这些耳。于30℃培养1.5h后，一半的耳用实施例6 的本发明的活性成分，另一半不。于37℃培养24h后，评估生长 的细菌菌落。

结果

在未的耳中，观察到1000-10000的病菌数。相反，对于被研究的 实施例6的活性成分，病菌生长被完全抑制。

实施例10

将活性成分加工成脂质并制备微米粒子和纳米粒子

方法

配方

 本发明的活性成分   量(g)  实施例1的活性成分   0.1  脂质混合物   10.00  乳化剂(Plantacare 2000)   0.1  去离子水   加至100.00

将脂质加热到50℃，然后将实施例1中使用的活性成分分散于其中。 除此之外，将乳化剂水溶液加热到相应的温度(50℃)。然后，在所需的均 质化温度下合并这两相。借助于来自Janke und Kunkel GmbH & Co.KG (Staufen，Germany)的Ultra Turax T25，在8000转/分钟和30秒时间的乳化 过程中处理该混合物。

然后，用活塞间隙高压均质机Micron Lab 40(APV-Gaulin，Lübeck)在 500bar的压力和50℃的温度下均质化该悬浮液4次。如实施例9中所述地 测试所得制剂用于皮肤上时的抗微生物效力。

结果

在被的皮肤上，病菌的生长被完全抑制。

实施例11

式4(实施例1-实施例4)的新型物质的体外抗微生物效力

用感染金黄葡萄球菌的小鼠模型测定体内效力的方法

小鼠的预处理：

在第0天，用在250μl PBS中的环磷酰胺(250mg/kg)经腹腔注射(i.p.) 预处理小鼠，每种试验物质或对照至少3只BALB/c小鼠(表8)。

在第2天，动物再次接受i.p.100mg/kg。

细菌预培养：

第二天，将试验病菌的菌落从生长琼脂平板(Müller-Hinton-Agar， Beckton Dickinson)转移至具有10mlCASO肉汤(CASO-B.，大豆蛋白胨-酪 蛋白胨肉汤，SIFIN，30g/l)的烧瓶中，并在37℃和250rpm的摇动频率下 培养过夜。

第三天，用CASO-B 1∶50稀释预培养物(Vk)，并进一步培养约2小时 直到在550nm波长时介质吸光达到0.6。然后，在室温下用PBS使其生长 1倍，并再次设定到0.6的吸光。

感染：

用10μl/g体重的成熟病菌的吸光为0.6的细菌悬浮液(约0¹⁰-10¹²CFU， 菌落形成单位)经腹腔注射来感染动物，每种试验物质或对照至少3只动 物。

试验物质：

变体1：

30分钟后，将在具有3％DMSO的200μl PBS中的抗生素溶液腹腔 注射到小鼠体内，6小时后，以相同的浓度进行第二次抗生素注射。

变体2：

6小时和20小时后，将在具有3％DMSO的200μl PBS中的抗生素 溶液腹腔注射到小鼠体内。

结果

在“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中，未进行有效动物100 ％死亡。用式4的本发明的活性成分后，所有动物都存活(表5)。

表5“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中活性成分的体外效力

实施例12

通过基团介导引入新取代基而引起的可商购的抗生素头孢羟氨苄(式 5，R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的亲脂性(lipophily)的靶向增 加

为了实现在亲脂表面上的充足固定，通过基团介导引入对二羟基化的 取代基，将选择性增加可商购的抗生素头孢羟氨苄(式5，R1＝OH，R2＝ H，R3＝CH₃，X＝S)的亲脂性。最初，根据以下方法，将头孢羟氨苄的 分布行为设定介于水相和亲脂相之间。

方法

根据Donovan等人的方法(Journal of Chromatography A，952，2002， 47-61)，通过HPLC测定logP值，以此设定分布行为。

谱条件：

●操作温度18-24℃

●流速1.5mL/min

●线性梯度(甲醇/0.1％磷酸pH 2)，9.4min内10％-100％，2次运行 之间的平衡时间是6min

样品制备：

约将0.5mg分析物加入0.5ml标准溶液(440mg苯磺酸甲酯和380μl 甲苯的150mL甲醇溶液)。进样2μl该样品溶液。

计算：

因为每次测试中使用的两种标准物的分布系数是已知的，所以，从分 析物/标准保留时间的关系可测定分析物的分布系数。

结果：

测得可从商购的抗生素头孢羟氨苄(式5，R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃， X＝S)的logP值等于-3.50。为了实现充分与亲脂的支架基质结合，应该 选择性地增加亲脂性。

根据本发明，通过基团介导的反应解决了所述问题，所述反应对应于 实施例1与2，5-二羟基-N-(2-羟基乙基)苯甲酰胺(logP值＝-1.21；式6，R4 ＝CONHCH₂CH₂OH)的反应；实施例2与2，5-二羟基苯甲酰胺(logP值＝ -0.4；式6，R4＝CONH₂)的反应；实施例4与2，5-二羟基苯甲酸乙酯(logP 值＝2.65；式6，R4＝COOCH₂CH₃)的反应。

获得了具有明显更高的亲脂性(表6)同时又维持抗微生物活性(表1) 的抗生素。

表6

logP值

  本发明的活性成分   logP值   1a   1.00   1b   1.33   1d   1.76

实施例13

7-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基]-2-苯 基乙酰氨基}脱乙酰氧基头孢烷酸1e

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝CONHCH₂CH₂OH)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)和75MHz(¹³C和DEPT-135)时记录核磁 共振波谱。¹H NMRδ2.01(s，3H，H-10)，3.15(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.37 (m，J＝5.7Hz，2H，H-9”)，3.44(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.57(t，J＝5.6Hz， 2H，H-10”)，4.90(d，J＝4.7Hz，1H，H-6)，5.69(dd，J＝4.6Hz，J＝8.9Hz，1H， H-7)，6.00(d，J＝6.5Hz，1H，H-13)，6.59(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.71(d， J＝10.1Hz，1H，H-5”)，7.46(m，6H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’，H-11)，9.79 (t，1H，H-8”)，13.29(d，1H，J＝6.2Hz，H-14)。¹³C NMRδ19.93(C-10)，30.35 (C-2)，42.10(C-9”)，57.95(C-6)，59.81(C-7)，61.50(C-10”)，63.15(C-13)， 101.42(C-1”)，123.15(C-4)，128.41(C-2’，C-6’)，129.84(C-4’)，130.09(C-3’， C-5’)，132.41(C-3)，133.33(C-4”)，138.36(C-1’)，141.34(C-5”)，153.39 (C-2”)，161.46(C-8)，165.01(C-9)，170.12(C7”)，171.96(C-12)，184.60 (C-6”)，185.52(C-3”)。LC/MSm/z 543.1([M+H]⁺，563.0[M+Na]⁺API-ES正 离子模式)。

实施例14

7-[2-(2-氨基甲酰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨基] 脱乙酰氧基头孢烷酸1f

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝CONH₂)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ2.02(s，3H，H-10)，3.15(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.44(d，J＝ 18.4Hz，1H，H-2)，4.90(d，J＝4.6Hz，1H，H-6)，5.69(dd，J＝4.5Hz，J＝8.5 Hz，1H，H-7)，6.00(d，J＝6.7Hz，1H，H-13)，6.59(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)， 6.71(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)，7.46(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)， 7.59(d，J＝8.4Hz，1H，H-11)，9.09(s，2H，H-8”)，13.29(d，1H，J＝6.7Hz， H-14)。LC/MS m/z 497.0([M+H]⁺，519.0[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例15

7-[2-(2-甲氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨基]脱 乙酰氧基头孢烷酸1g

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ2.01(s，3H，H-10)，3.14(d，J＝18.2Hz，1H，H-2)，3.43(d，J＝ 18.2Hz，1H，H-2)，3.65(br s，3H，H-8”)，4.88(d，J＝4.6Hz，1H，H-6)，5.65(dd， J＝4.6Hz，J＝8.8Hz，1H，H-7)，5.92(d，J＝6.8Hz，1H，H-13)，6.57(d，J＝ 10.2Hz，1H，H-4”)，6.69(d，J＝10.1Hz，1H，H-5”)，7.47(m，5H，H-2’，H-3’， H-4’，H-5’，H-6’)，7.52(d，J＝8.8Hz，1H，H-11)，13.18(d，1H，J＝6.8Hz， H-14)。LC/MS m/z 510.0([M+H]^-API-ES负离子模式)，534.0([M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例16

7-[2-(2-乙氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨基]脱 乙酰氧基头孢烷酸1h

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₂CH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ1.12(br，3H，H-9”)，2.01(s，3H，H-10)，3.12(d，J＝18.2Hz， 1H，H-2)，3.40(d，J＝18.2Hz，1H，H-2)，3.99(br，2H，H-8”)，4.86(d，J＝4.7 Hz，1H，H-6)，5.67(dd，J＝4.6Hz，J＝8.7Hz，1H，H-7)，6.19(d，J＝8.4Hz，1H， H-13)，6.58(d，J＝10.1Hz，1H，H-4”)，6.68(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)，7.37 (m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.46(d，J＝8.7Hz，1H，H-11)。LC/MS m/z 426.3([M+H]⁺，548.1[M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例17

式4(实施例13-实施例16)的新型化合物的体外抗微生物效力

方法参照实施例5

结果

该新型活性成分具有强抗微生物效力(表7)。

实施例18

通过与本身具有活性成分性质的阳离子形成盐来制备新型头孢菌素

使实施例6的部分与式4(R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃，R4＝ CONHCH₂CH₂OH，X＝S)的活性成分和式5(R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃， X＝S)的活性成分反应。通过这种方式，获得具有强抗微生物效力的产物。

实施例19

式4(实施例13，实施例14)的新型物质的体内抗微生物效力

方法参照实施例11

结果

在“感染金黄葡萄球菌小鼠”模型中，未进行有效的动物100％死 亡。用式3的本发明的活性成分后，所有动物都存活(表8)。

表7.新型活性成分1e-1h和2b的抗微生物效力。

¹抑制区直径(以mm计)；²r＝耐药的(没有检测到抑制区)

表8

“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中活性成分的体外效力

实施例20

通过基团介导引入新取代基而引起的可商购的抗生素头孢氨苄(式5， R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的亲脂性的靶向增加

为了实现在亲脂表面上的充足固定，通过基团介导引入对二羟基化的 取代基，可选择性地增加可商购的抗生素头孢氨苄(式5，R1＝H，R2＝H， R3＝CH₃，X＝S)的亲脂性。最初，将头孢羟氨苄的分布行为设定介于水 相和亲脂相之间。

方法参照实施例12

结果：

测得可从商购的抗生素头孢氨苄(式5，R1＝H，R2＝H，R3＝CH₃， X＝S)的logP值等于-2.63。为了实现充分与亲脂支架基质结合，应该选 择性地增加亲脂性。

根据本发明，通过基团介导的、对应于实施例13与2，5-二羟基-N-(2- 羟基乙基)苯甲酰胺(logP值＝-1.21；式6，R4＝CONHCH₂CH₂OH)的反应， 来解决所述问题。

获得了具有明显更高的亲脂性(表9)同时又维持抗微生物活性(表7) 的抗生素

表9

logP值

  本发明的活性成分   logP值   1e   1.61

实施例21

3-氯-7-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨 基]-2-苯基乙酰氨基}-8-氧代-1-硫杂-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1i

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝S)的活性成分与通式6(R4＝ CONHCH₂CH₂OH)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)和75MHz(¹³C和DEPT-135)时记录核磁 共振波谱。¹H NMRδ3.36(m，J＝5.7Hz，2H，H-9”)，3.38(d，J＝18.2Hz，1H， H-2)，3.57(t，J＝5.6Hz，2H，H-10”)，3.75(d，J＝18.2Hz，1H，H-2)，4.99(d， J＝4.9Hz，1H，H-6)，5.72(dd，J＝4.8Hz，J＝9.0Hz，1H，H-7)，5.94(d，J＝6.7 Hz，1H，H-13)，6.56(d，J＝10.1Hz，1H，H-4”)，6.71(d，J＝10.1Hz，1H， H-5”)，7.42(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.66(d，J＝8.9Hz，1H， H-11)，9.76(t，1H，H-8”)，13.25(d，1H，J＝6.2Hz，H-14)。¹³C NMR δ31.27 (C-2)，42.11(C-9”)，58.09(C-6)，60.04(C-7)，61.48(C-10”)，63.48(C-13)， 101.40(C-1”)，124.60(C-4)，128.41(C-2’，C-6’)，129.13(C-3)，129.84(C-4’)， 130.09(C-3’，C-5’)，133.36(C-4”)，138.69(C-1’)，141.89(C-5”)，153.55 (C-2”)，162.30(C-8)，165.83(C-9)，170.10(C7”)，171.37(C-12)，184.75 (C-6”)，185.51(C-3”)。LC/MS m/z 562.2([M+H]⁺，584.1[M+Na]⁺API-ES正 离子模式)。

稳定性检验

该新型活性成分在大于60天的储存期中证明是稳定的。图2显示3- 氯-7-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基]-2-苯 基乙酰氨基}-8-氧代-1-硫杂-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1i的储存稳定 性。

实施例22

3-氯-7-{2-[2-(2-氨基甲酰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基]-2-苯基乙 酰氨基}-8-氧代-1-硫杂-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1j

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝S)的活性成分与通式6(R4＝ CONH₂)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ3.41(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.77(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)， 5.01(d，J＝4.9Hz，1H，H-6)，5.74(dd，J＝4.9Hz，J＝8.5Hz，1H，H-7)，5.96(d， J＝6.7Hz，1H，H-13)，6.60(d，J＝10.3Hz，1H，H-4”)，6.71(d，J＝10.3Hz，1H， H-5”)，7.45(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.61(d，J＝8.5Hz，1H， H-11)，9.09(s，2H，H-8”)，13.27(d，1H，J＝6.7Hz，H-14)。LC/MS m/z 518.2 ([M+H]⁺，540.0[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例23

3-氯-7-[2-(2-甲氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基]-2-苯基乙酰氨 基}-8-氧代-1-硫杂-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1k

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝S)的活性成分与通式6(R4＝ COOCH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。¹H NMRδ3.23(d， J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.38(d，J＝18.4Hz，1H，H-2)，3.83(br s，3H，H-8”)， 4.92(d，J＝4.6Hz，1H，H-6)，5.65(dd，J＝4.6Hz，J＝7.5Hz，1H，H-7)，5.96(d， J＝6.7Hz，1H，H-13)，6.68(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.74(d，J＝10.1Hz，1H， H-5”)，7.42(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.61(d，J＝7.5Hz，1H， H-11)，13.27(d，1H，J＝6.7Hz，H-14)。LC/MS m/z 532.5([M+H]⁺，554.5 [M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例24

3-氯-7-[2-(2-乙氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨 基]-8-氧代-1-硫杂-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1l

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝S)的活性成分与通式6(R4＝ COOCH₂CH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。¹H NMRδ1.14 (br，3H，H-9”)，3.35(d，J＝18.2Hz，1H，H-2)，3.73(d，J＝18.2Hz，1H，H-2)， 4.16(br，2H，H-8”)，4.95(d，J＝4.6Hz，1H，H-6)，5.69(dd，J＝4.6Hz，J＝8.8 Hz，1H，H-7)，6.59(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.70(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)， 7.38(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.55(d，J＝8.7Hz，1H，H-11)。 LC/MS m/z 547.0([M+H]⁺，569.0[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例25

式4(实施例21-实施例24)的新型化合物的体外抗微生物效力

方法参照实施例5

结果：

该新型活性成分具有强抗微生物效力(表10)。

实施例26

通过与本身具有活性成分性质的阳离子形成盐来制备新型头孢菌素

使实施例6的部分与7-氨基头孢烷酸和式4(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl， R4＝CONHCH₂CH₂OH，X＝S)的活性成分和式5(R1＝H，R2＝H，R3＝ Cl，X＝S)的活性成分反应。通过这种方式，获得具有强抗微生物效力的产 物。

实施例27

式4(实施例21-实施例24)的新型物质的体内抗微生物效力

方法参照实施例11

结果

在“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中，未进行有效的动物100 ％死亡。用式4的本发明的活性成分后，所有动物都存活(表11)。

表10.新型活性成分1i-1l和2c的抗微生物效力。

¹抑制区直径(以mm计)；²r＝耐药的(没有检测到抑制区)

表11

“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中活性成分的体外效力

实施例28

通过基团介导引入新取代基而引起的可商购的抗生素头孢克洛(式5， R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝S)的亲脂性的靶向增加

为了实现在亲脂表面上的充足固定，应通过基团介导引入对二羟基化 的取代基，选择性增加可商购的抗生素头孢克洛(式5，R1＝H，R2＝H， R3＝Cl，X＝S)的亲脂性。最初，将头孢克洛的分布行为设定介于水相和 亲脂相之间。

方法参照实施例12

结果：

测得可商购的抗生素头孢克洛(式5，R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝ S)的logP值等于-3.28。为了实现充分与亲脂支架基质结合，应该选择性 地增加亲脂性。

根据本发明，通过基团介导的、对应于实施例21与2，5-二羟基-N-(2- 羟基乙基)苯甲酰胺(logP值＝-1.21；式5，R4＝CONHCH₂CH₂OH)的反 应，来解决所述问题。

获得具有明显更高的亲脂性(表12)同时又维持抗微生物活性(表10) 的抗生素。

表12

logP值

  本发明的活性成分   logP值   1i   1.81

实施例29

3-氯-7-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨 基]-2-苯基乙酰氨基}-8-氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1m

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的活性成分与通式6(R4 ＝CONHCH₂CH₂OH)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)和75MHz(¹³C和DEPT-135)时记录核 磁共振波谱。¹H NMRδ1.33(m，2H，H-1)，2.40(m，2H，H-2)，3.37(m，J＝5.6 Hz，2H，H-9”)，3.58(t，J＝5.5Hz，2H，H-10”)，3.74(m，J＝5.0Hz，1H，H-6)， 5.31(m，J＝5.0Hz，J＝8.3Hz，1H，H-7)，5.90(d，J＝6.7Hz，1H，H-13)，6.55 (d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.66(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)，7.41(m，5H，H-2’， H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.54(d，J＝7.9Hz，1H，H-11)，9.76(t，1H，H-8”)， 13.23(d，1H，J＝6.3Hz，H-14)。¹³C NMRδ22.19(C-1)，31.70(C-2)，42.12 (C-9”)，53.13(C-6)，59.24(C-7)，61.51(C-10”)，63.62(C-13)，101.65(C-1”)， 124.74(C-4)，128.33(C-2’，C-6’)，129.03(C-3)，129.79(C-4’)，130.07(C-3’， C-5’)，133.34(C-4’)，138.96(C-1’)，141.92(C-5”)，153.47(C-2”)，162.22 (C-8)，165.73(C-9)，170.09(C7”)，171.37(C-12)，184.69(C-6”)，185.49 (C-3”)。LC/MS m/z 544.2([M+H]⁺，566.1[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

稳定性检验

该新型活性成分在大于60天的储存期中证明是稳定的。图3显示3- 氯-7-{2-[2-(2-羟基乙基氨基甲酰基)-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基]-2-苯 基乙酰氨基}-8-氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1m的储存稳定性。

实施例30

3-氯-7-[2-(2-氨基甲酰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰 氨基]-8-氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1n

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的活性成分与通式6(R4 ＝CONH₂)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。

¹H NMRδ1.34(m，2H，H-1)，2.40(m，2H，H-2)，3.72(m，J＝4.8Hz，1H， H-6)，5.35(m，J＝4.8Hz，J＝8.3Hz，1H，H-7)，5.90(d，J＝6.7Hz，1H，H-13)， 6.55(d，J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.66(d，J＝10.2Hz，1H，H-5”)，7.41(m，5H， H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.54(d，J＝8.4Hz，1H，H-11)，9.07(s，2H， H-8”)，13.14(d，1H，J＝6.7Hz，H-14)。LC/MS m/z 500.3([M+H]⁺，521.1 [M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例31

3-氯-7-[2-(2-甲氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨 基]-8-氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1o

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。¹H NMRδ1.34 (m，2H，H-1)，2.42(m，2H，H-2)，3.63(br s，3H，H-8”)，3.71(m，J＝4.9Hz，1H， H-6)，5.32(m，J＝4.9Hz，J＝8.3Hz，1H，H-7)，6.57(d，J＝10.1Hz，1H， H-4”)，6.67(d，J＝10.0Hz，1H，H-5”)，7.34(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’， H-6’)，7.91(br d，1H，H-11)。LC/MS m/z 514.7([M+H]⁺，535.9[M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例32

3-氯-7-[2-(2-乙氧羰基-3，6-二氧代环己-1，4-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨 基]-8-氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1p

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的活性成分与通式6(R4 ＝COOCH₂CH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代乙腈中在300MHz(¹H)时记录核磁共振波谱。¹H NMRδ1.13(br， 3H，H-9”)，1.33(m，2H，H-1)，2.46(m，2H，H-2)，3.75(m，J＝5.1Hz，1H， H-6)，4.02(br，2H，H-8”)，5.34(m，J＝5.1Hz，J＝8.4Hz，1H，H-7)，6.59(d， J＝10.2Hz，1H，H-4”)，6.70(d，J＝10.0Hz，1H，H-5”)，7.38(m，5H，H-2’， H-3’，H-4’，H-5’，H-6’)，7.61(br d，1H，H-11)。LC/MS m/z 529.8([M+H]⁺， 550.2[M+Na]⁺ API-ES正离子模式)。

实施例33

式4(实施例29-实施例32)的新型化合物的体外抗微生物效力

方法参照实施例5

结果：

该新型活性成分具有强抗微生物效力(表13)。

表13.新型活性成分1m-1p和2d的抗微生物效力。

¹抑制区直径(以mm计)，²r＝耐药的(没有检测到抑制区)

实施例34

通过与本身具有活性成分性质的阳离子形成盐来制备新型头孢菌素

使实施例6的部分与7-氨基头孢烷酸和式4(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl， R4＝CONHCH₂CH₂OH，X＝CH₂)的活性成分和式5(R1＝H，R2＝H，R3 ＝Cl，X＝CH₂)的活性成分反应。通过这种方式，获得具有强抗微生物效力 的产物。

实施例35

式4(实施例29-实施例32)的新型物质的体内抗微生物效力

方法参照实施例11

结果

在“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中，未进行有效的动物100 ％死亡。用式4的本发明的活性成分后，所有动物都存活(表14)。

表14

“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中活性成分的体外效力

实施例36

通过基团介导引入新取代基而引起的可商购的抗生素氯碳头孢(式5， R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的亲脂性的靶向增加

为了实现在亲脂表面上的充足固定，应通过基团介导引入对二羟基化 的取代基，选择性增加可商购的抗生素氯碳头孢(式5，R1＝H，R2＝H， R3＝Cl，X＝CH₂)的亲脂性。最初，将氯碳头孢的分布行为设定介于水相 和亲脂相之间。

方法参照实施例12

结果：

测得可商购的抗生素氯碳头孢(式5，R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝ CH₂)的logP值等于-3.13。为了实现充分与亲脂的支架基质结合，应该选 择性地增加亲脂性。

根据本发明，通过基团介导的、对应于实施例29与2，5-二羟基-N-(2- 羟基乙基)苯甲酰胺(logP值＝-1.21；式6，R4＝CONHCH₂CH₂OH)的反应， 来解决所述问题。

获得具有明显更高的亲脂性(表12)同时又维持抗微生物活性(表15) 的抗生素。

表15

logP值

  本发明的活性成分   logP值   1m   1.62

实施例37-实施例41的结构分析和生物活性试验形成指示结构要素和 对应式11的物质的基础。

实施例37

7-[2-(5-甲基-3，4-二氧代环己-1，5-二烯基氨基)-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基] 头孢烷酸1q

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式9(R4 ＝H，R5＝CH₃)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代DMSO中在300MHz ¹H时记录核磁共振波谱、HMBC和 HSQC。

¹H NMRδ(DMSO-d₆)1.86(s，3H，H7”)，1.99(s，3H，H10)，3.29(d，J＝ 18.4Hz，1H，H2)，3.49(d，J＝18.4Hz，1H，H2)，4.89(d，J＝4.4Hz，1H，H6)， 5.19(d(s)，J＝1.5Hz，1H，H2”)，5.31(d，J＝7.0Hz，1H，H13)，5.65(dd，J＝4.7 Hz，J＝8.1Hz，1H，H7)，6.76(d，J＝8.2Hz，2H，H3’，H5’)，7.14(d(s)，J＝1.5 Hz，1H，H6”)，7.27(d，J＝8.2Hz，2H，H2’，H6’)，8.71(d，J＝7.1Hz，1H， H14)，9.29(d，J＝8.3Hz，1H，H11)。¹³C NMRδ(DMSO-d₆)15.6(C7”)，19.7 (C10)，29.1(C2)，57.1(C6)，58.8(C7)，59.5(C13)，95.1(C2”)，115.7(C3’， C5’)，122.9(C4)，126.8(C1’)，128.9(C2’，C6’)，129.6(C3)，133.7(C6”)， 140.0(C5”)，155.2(C1”)，157.8(C4’)，163.8(C9)，164.1(C8)，170.0(C12)， 174.7(C3”)，183.6(C4”)。LC/MS m/z 483.4([M]⁺，504.8[M+Na]⁺API-ES 正离子模式)

实施例38

7-[2-(6-甲基-3，4-二氧代环己-1，5-二烯基氨基)-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基] 头孢烷酸1r

通过通式5(R1＝OH，R2＝H，R3＝CH₃，X＝S)的活性成分与通式9(R4 ＝CH₃，R5＝H)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代DMSO中在300MHz ¹H时记录核磁共振波谱、HMBC和 HSQC。

¹H NMRδ(DMSO-d₆)1.99(s，3H，H10)，2.32(s，3H，H8”)，3.29(d，J＝ 18.1Hz，1H，H2)，3.48(d，J＝18.4Hz，1H，H2)，4.99(d，J＝4.4Hz，1H，H6)， 5.12(s，1H，H2”)，5.25(d，J＝6.1Hz，1H，H13)，5.69(dd，J＝4.9Hz，J＝7.8 Hz，1H，H7)，6.32(s，1H，H5”)，6.76(d，J＝8.2Hz，2H，H3’，H5’)，7.11(d，J ＝6.1Hz，1H，H14)，7.34(d，J＝8.2Hz，2H，H2’，H6’)，9.29(d，J＝8.4Hz，1H， H11)。¹³C NMRδ(DMSO-d₆)17.5(C7”)，19.5(C10)，28.6(C2)，56.8(C6)， 58.8(C7)，59.5(C13)，97.7(C2”)，115.9(C3’，C5’)，123.0(C4)，126.7(C1’)， 128.7(C2’，C6’)，129.4(C5”)，129.6(C3)，147.2(C6”)，154.3(C1”)，158.0 (C4’)，163.6(C9)，163.9(C8)，170.2(C12)，175.6(C3”)，182.8(C4”)。LC/MS m/z 483.4([M]⁺，504.9[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例39

3-氯-7-[2-(5-甲基-3，4-二氧代环己-1，5-二烯基氨基)-2-苯基乙酰氨基]-8- 氧代-5-氮杂二环[4.2.0]辛-3-烯-4-羧酸1s

通过通式5(R1＝H，R2＝H，R3＝Cl，X＝CH₂)的活性成分与通式9(R4 ＝CH₃，R5＝H)的物质的反应获得该活性成分。

结构分析：

于氘代DMSO中在300MHz ¹H时记录核磁共振波谱、HMBC和 HSQC。

¹H NMRδ(DMSO-d₆)1.35(m，2H，H1)，1.86(s，3H，H7”)，2.48(m，2H， H2)，3.72(m，J＝7.8Hz，1H，H6)，5.16(s，1H，H2”)，5.25(dd，J＝7.9Hz，J＝ 5.6Hz，1H，H7)，5.33(s，1H，H13)，7.19(s，1H，H6”)，7.35(dd，J＝7.4Hz，1H， H4’)，7.40(dd，J＝7.4Hz，2H，H3’，H5’)，7.49(d，J＝7.6Hz，2H，H2’，H6’)， 8.88(broad，1H，H14)，9.39(d，J＝8.0Hz，1H，H11)。¹³C NMRδ(DMSO-d₆) 21.5(C1)，28.0(C2)，51.4(C6)，57.7(C7)，60.1(C13)，95.0(C2”)，120.2(C4)， 127.2(C4’)，127.6(C2’，C6’)，128.5(C3)，128.7(C3’，C5’)，133.5(C6”)， 136.5(C1’)，163.9(C8)，169.1(C12)，183.0(C4”)。LC/MS m/z 469.5([M]⁺， 491.3[M+Na]⁺API-ES正离子模式)。

实施例40

式8(实施例37-实施例39)的新型化合物的体外抗微生物效力

方法参照实施例5

结果：

该新型活性成分具有强抗微生物效力(表16)。

表16.新型活性成分1q-1r、2a、2b和4a、4b的抗微生物效力

¹r＝耐药的(没有检测到抑制区)

²抑制区直径(以mm计)

实施例41

式8(实施例37)的新型物质的体内抗微生物效力

方法参照实施例11

结果

在“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中，未进行有效的动物100 ％死亡。用式8的本发明的活性成分后，至少50％动物存活(表17)。

表17

“感染金黄葡萄球菌小鼠”感染模型中活性成分的体外效力

实施例42

具有式图3的活性成分的创伤敷料的亲水性吸收芯的材料

将一层吸收芯切割成1cm²大的小片。用不同浓度的式图3的活性成分 的悬浮液浸透这些小片，并且在琼脂试验中试验病菌的减少。为此，借助 Whitley Automatic Spiral Plater(WASP)，线性接种病菌悬浮液。通过这种方 式，使细菌在琼脂平板上均匀生长。30min后，标记出上面施用创伤敷料 的区域，并精确设定对照表面。将25μl生理盐水溶液滴加到各个这些区域 上。放置未涂布的敷布材料和涂布本发明的物质的创伤敷料，并将它们轻 轻压到这些液滴上。使这些板在室温下保持15分钟以进行预扩散，直到它 们被放入温育箱中(37℃)。24h后，标记创伤敷料的表面。计数创伤敷料 下方和只给予盐水溶液的对照区内的表面上的细菌数。将创伤敷料转移至 新鲜琼脂上，以便计数可能存活的病菌。

将吸收芯放置在未接种的琼脂平板上。在这些低病菌数时，仅通过统 计学方法计算定殖。假设为泊松分布，根据下式计算预期存活病菌的中间 数量m

m＝-ln p/p_o

(p＝没有检测到病菌的试验的数量，p_o＝总的试验数量)。

结果

如预期的，未涂布的创伤敷料导致强的病菌繁殖。

相反，对于以0.02％的浓度涂布式图3的活性成分的创伤敷料，敷料 下的细菌生长被完全抑制。然而，在创伤敷料周围观察到仅0.93±0.73mm (n＝7)的抑制区，即，在创伤敷料周围区域中的扩散是最小的。

转移至新鲜琼脂上后，在3个例子中观察到少量的细菌生长，在7个 例子中没有观察到细菌生长，即，在式图3的新型聚盐酸己双胍活性成分 的该浓度下，预期平均仅0.35病菌存活。

对于将该活性成分的浓度减小到0.01％的情况，统计平均地预期在创 伤敷料(n＝5)下为0.2KBE。在将吸收芯放置到未接种的琼脂上之后，观 察到在2个例子中有少量生长，在3个例子中有强生长，即，在此浓度时， 仅达到抑菌作用而不能达到杀菌作用。

对于将浓度增加到0.04％的情况，如预期地，在创伤敷料下方没有发 生生长。对于转移至未接种的琼脂，统计平均地观察到0.22的病菌数(n＝5)。 然而，吸收芯周围的抑制区增加至3mm，即，在此浓度时开始扩散到周围 培养基中。

实施例43

在滤过试验中试验涂布式图2或3的活性成分的创伤敷料

将不同创伤敷料的不同尺寸的小片放置在漏斗中，以约20滴/min(图) 的速度滴加病菌悬浮液(200000KbE/ml)。采集最初的2ml滤液。稀释后， 用螺旋板WASP测定滤液中的细菌数并与初始病菌数作比较。在此，每次 将稀释液调整至初始病菌数。

图4显示滤过试验装置的示意图。

结果

对于未涂布的创伤敷料，病菌几乎完全恢复。相反，对于涂布式图2 或3的活性成分的创伤敷料，病菌全部被灭活；在采集的滤液中没有检测 到病菌生长。

实施例44

将式图2的活性成分与不同脂肪酸(十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、 顺式-9-十六烷酸、十八烷酸、顺式-9-十八烷酸、顺式-9，12-十八烷酸，它们 通过正己烷提取微藻类(提取器DIONEX ASE 200)获得)的混合物混合。 以0.01％的浓度，用获得的产物涂布吸收性敷布。

结果

可完全抑制病菌生长。根据权利要求11，天然脂肪酸的混合物可以用 作转变式图2的物质的酸。所得产物具有突出的强抗微生物效力。

实施例45

猪皮肤上的试验

方法

将浓度各为1％的可商购的式图1的活性成分、阿莫西林和具有阿莫西 林作为阴离子的权利要求2的盐加工成W/O型乳剂基质。

在屠杀后立即用这些制剂在越南大肚子猪的皮肤上进行试验。

该皮肤上定殖了金葡萄球菌(北德传染性菌株)。然后，将具有相应 活性成分的软膏施用到标记的皮肤区域。24h后，冲洗相应的皮肤区域， 测定冲洗溶液中的病菌数量。

结果

虽然在两种单个物质的情况下仍然检测到病菌，但是本发明的产物导 致病菌的完全灭活。

表18

  软膏   菌落形成单位   基质W/O   ＞100000   基质W/O+式1的活性成分   23   基质W/O+阿莫西林   52   基质W/O+权利要求2的活性成分   0

实施例46

加工成纤维素凝胶

方法

将可商购的式图1的活性成分、阿莫西林和具有阿莫西林作为阴离子 的权利要求2的盐(各物质的浓度为0.1％和1％)加工成无醇的纤维素凝 胶。

根据实施例45进行试验。

结果

本发明的制剂是稳定的。

与单个物质相反，本发明的制剂可实现多重耐药金黄葡萄球菌的完 全灭活。

表19

实施例47

实施例46的制剂在口腔粘膜上的试验

方法

参见实施例45，但是使用口腔和咽粘膜。

结果

本发明的制剂对粘膜也显示出最佳的效力。

表20

根据PCT条约第19条的修改说明

原权利要求书由新的权利要求替换，其中权利要求1-10未改变，删除 权利要求11-21。

1.以下通式的β-内酰胺衍生物

其中：

R1＝H、OH

R2＝H、Na、CH₂OH、CHCH₃OCOOC₂H₅、CHCH₃OCOOCH(CH₃)₂、 CH₂OCOC(CH₃)₃

R3＝CH₃、Cl

R4＝CONHCH₂CH₂OH、CONH₂、COOCH₃、COOCH₂CH₃、COOH、 COCH₃、CHO、CH₃、CH₂(CH₂)_0-20CH₃、C(CH₃)₃、C₆H₅、Cl、Br、OCH₃、 O(CH₂)_0-20CH₃

R5＝CONHCH₂CH₂OH、CONH₂、COOCH₃、COOCH₂CH₃、COOH、 COCH₃、CHO、CH₃、CH₂(CH₂)_0-20CH₃、C(CH₃)₃、C₆H₅、Cl、Br、OCH₃、 O(CH₂)_0-20CH₃

X＝S、CH₂。

2.盐，其阴离子组分来自

a)权利要求1的β-内酰胺衍生物，或

b)可商购的β-内酰胺衍生物，或

c)6-氨基青霉烷酸的衍生物，或

d)7-氨基头孢烷酸的衍生物

并且其阳离子组分是聚六亚甲基双胍。

3.权利要求2的盐，其特征在于，其包括以下通式的物质：

其中

R3＝CH₃、Cl；X＝S、CH₂

R5＝H、

R1＝H、OH；

R6＝或H

R4＝CONHCH₂CH₂OH、CONH₂、COOCH₃、COOCH₂CH₃、COOH、 COCH₃、CHO、CH₃、CH₂(CH₂)_0-20CH₃、C(CH₃)₃、C₆H₅、Cl、Br、OCH₃、 O(CH₂)_0-20CH₃。

4.权利要求2或3的盐，其特征在于，n＝2-5。

5.聚六亚甲基双胍碳酸氢盐，其在制备权利要求2或3的聚六亚甲基 双胍盐中作为中间产物。

6.用于制备权利要求1的β-内酰胺衍生物的方法，其特征在于，式5 的具有游离氨基的β-内酰胺抗生素在以下酶的影响下在所述氨基上被羟基 邻位排列的多酚氧化酶的底物取代：

a)分类为EC 1.10.3.2的酶和/或

b)分类EC 1.11.17的过氧化物酶和/或

c)一元酚单氧酶EC 114.99.1和/或

d)抗坏血酸氧化酶EC 1.10.3.3。

7.用于制备权利要求1的β-内酰胺衍生物的方法，其特征在于，式5 的具有游离氨基的头孢菌素在以下酶的影响下在所述氨基上被多酚氧化酶 的底物取代：

a)分类为EC 1.10.3.2的酶和/或

b)分类为EC 1.11.17的过氧化物酶和/或

c)一元酚单氧酶EC 114.99.1和/或

d)抗坏血酸氧化酶EC 1.10.3.3。

8.用于制备权利要求2的盐的方法，其特征在于以下步骤：

●使聚六亚甲基双胍的可溶性盐与碱金属或铵的碳酸氢盐反应，其中 聚六亚甲基双胍碳酸氢盐沉淀出来

●使所述聚六亚甲基双胍碳酸氢盐与权利要求2a)-2d)的β-内酰胺衍生 物反应。

9.权利要求8的方法，其特征在于，分级进行所述聚六亚甲基双胍碳 酸氢盐的沉淀，由此获得不同分子量范围的聚六亚甲基双胍碳酸氢盐。

10.用于制备作为中间产物的聚六亚甲基双胍碳酸氢盐并将其分离成 不同分子量范围的方法，其特征在于，用碱金属碳酸氢盐使聚六亚甲基双 胍盐酸盐在水溶液中沉淀，其中沉淀部分地、逐步地实现，通过这种方式， 实现分级分离成窄分子量范围的聚合物。