用于骨关节炎的作为聚蛋白聚糖酶抑制剂的取代羧酸衍生物

用于骨关节炎的作为聚蛋白聚糖酶抑制剂的取代羧酸衍生物

本发明涉及式I化合物和特别是包含至少一种式I化合物的药物，其用于在和/或预防触发中涉及ADAMTS5的生理学上和/或病理生理学上的状况，特别是用于和/或预防骨关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛或痛觉过敏。

发明背景

骨关节炎(OA)是发达国家最致残疾病之一。估计OA的流行在世界范围内是年龄超过60岁的十分之一的男性和五分之一的女性。因此，该疾病占大量卫生保健费用，因此代表显著社会经济负担。至今为止，没有获得疾病改善。因此，重要的是当可能涉及总体关节置换术时，当前仍然是完全有症状的。

即使这对于健康体系非常重要，但OA的成因迄今为止一直不清楚，并且有效的预防性措施一直仍然是遥远的目标。关节间隙减小（由关节软骨的破坏导致）与软骨下骨和骨赘形成中的变化一起为该疾病的放射学特征。然而，对于患者，具有随后的功能损伤的疼痛（负荷依赖性和夜行性静息痛）成为主要。这也迫使患者成为具有相应的次级疾病的社会孤立。

根据非官方定义的术语骨关节炎是指“关节磨损”，其超出年龄的通常范围。成因被认为是过度负荷（例如增加的体重）、出生时的或外伤的原因，例如关节错位、或由于骨病导致的骨变形，例如骨质疏松症。骨关节炎可以同样由于另一疾病引发，所述另一疾病例如为关节炎症（关节炎）（次级骨关节炎）、或伴随超负荷诱导的渗出（次级炎性反应）（活化骨关节炎）。英美专家文献在骨关节炎(OA)（其中关节表面的损坏能够主要归因于负荷影响）和关节炎(类风湿性关节炎，RA)（其中由于炎性组分导致的关节退行性病变变得重要）之间区分。

大体上，骨关节炎还根据其成因区分。在之前存在的黑尿病的情况下，关节黑尿病基于关节中尿黑酸增加的沉积。在血友病关节的情况下，定期关节内出血在血友病（血友病关节）的情况下发生。关节尿酸由在健康软骨上的尿酸盐晶体（尿酸）的机械影响导致(Pschyrembel W.等人: Klinisches W?rterbuch, Verlag Walter de Gruyter & Co, 第253版, 1977)。

骨关节炎的经典成因为关节发育不良。使用臀部的实例，很清楚在生理学上臀部位置的情况下具有最大机械应力的区域代表比发育不良臀部的情况下明显更大的区域。然而，由作用在关节上的力导致的应力基本上独立于关节形状。它们基本上分布在主应力区域。较大的压力因此在相对小区域的情况下比在较大区域的情况下更易发生。因此，在关节软骨上的生物机械压力在发育不良臀部情况下比在生理学上臀部位置的情况下更大。这个规则通常认为是在不同于理想解剖学形状的支撑关节中的关节炎变化发病率增加的原因。

如果损伤的后果导致过早磨损，则使用术语创伤后关节。正在讨论的次级关节病或骨关节炎的其他成因为机械、炎症、代谢、化学（喹诺酮）、摄食、荷尔蒙、神经病学和遗传原因。在大部分情况下，然而，提供的诊断为先天性关节病，医生对其释义为明显不存在因果的疾病(H. I. Roach and S. Tilley, Bone and osteoarthritis、F. Bronner and M. C. Farach-Carson (编者), Verlag Springer, 第4卷, 2007)。

骨关节炎的医学成因可以为例如旋转酶抑制剂类型的抗生素（氟喹诺酮，例如环丙沙星、左氧氟沙星）。这些药物导致弱血管组织（透明关节软骨、腱组织）中镁离子的络合，其具有发生在结缔组织的不可逆性损伤的结果。该损伤通常在儿童和青少年生长期更显著。肌腱病和关节病是这类药物的已知副作用。在成人中，根据来自独立的药理学家和风湿病学家的信息，这些抗生素导致透明关节软骨的加速的生理学上退化(Menschik M.等人, Antimicrob. Agents Chemother. 41, 第2562-2565页, 1997; Egerbacher M. 等人, Arch. Toxicol. 73, 第557-563页, 2000; Chang H. 等人, Scand. J. Infect. Dis.  28, 第641-643页, 1996; Chaslerie A. 等人, Therapie 47, 第80页, 1992)。在关节内结构的应力的情况下，通过降低骨密度，采用苯丙香豆素的延伸也可能帮助关节。

除了年龄之外，骨关节病的已知危险因素为机械超负荷、（微）创伤、由固定机制的丧失导致的关节失稳、和遗传因素。然而，发病和可能的介入都没得到完全的解释(H. I. Roach and S. Tilley, Bone and osteoarthritis、F. Bronner and M. C. Farach-Carson (编者), Verlag Springer, 第4卷, 2007)。

在受骨关节炎影响的关节中，一氧化氮的含量在一些情况下增加。由于软骨组织的高机械刺激已经观察到类似情况(Das P. 等人, Journal of Orthopaedic Research 15, 第87-93页, 1997; Farrell A. J. 等人, Annals of the Rheumatic Diseases 51, 第1219-1222页, 1992; Fermor B. 等人, Journal of Orthopaedic Research 19, 第729-737页, 2001)，而适中的机械刺激倾向于具有阳性效果。因此机械力的作用因果地参与骨关节炎的进展中(Liu X. 等人, Biorheology 43, 第183-190页, 2006)。

大体上，骨关节炎疗法按照两个目的：首先在正常负荷下脱离疼痛，第二在关节中防止机械限制或变化。这些目的不能通过疼痛作为纯症状疗法途径长时间不能实现，因为这不能阻止疾病的进展。如果实现后者，软骨损伤必须停止。由于成人患者中的关节软骨不能再生，则治病因素例如关节发育不良或错位（其导致关节软骨上增加的点压力）的消除另外是非常重要的。

最后，试图借助于药物预防或阻止软骨组织中的退化过程。

用于功能化状态的关键因素和因此关节软骨抵抗应力的阻力为细胞外基质，其主要由胶原、蛋白聚糖和水构成。参与细胞外基质的退化的酶包括特别是金属蛋白酶、聚蛋白聚糖酶和组织蛋白酶。

聚集蛋白聚糖(Aggrecan)为软骨的主要蛋白聚糖，并且由蛋白酶导致的核心蛋白的分解是与滑动关节软骨损坏相关的关节障碍例如类风湿性关节炎和骨关节炎的早期信号之一。导致软骨损伤的分解的该过程开始于软骨表面上的聚集蛋白聚糖的消失和胶原II型纤维的分解过程(Sandy J. D.等人, J. Clin. Invest. 89, 1512?1516, 1992; Lohmander L. S.等人, Arthritis Rheum. 36, 1214?1222, 1993)。

裂解Asn 341-Phe 342的MMP(基质金属蛋白酶)和裂解Glu 373-Ala 374的聚蛋白聚糖酶称为参与该聚集蛋白聚糖的该分解的酶，并且两者都为在催化活性中心中具有锌的金属蛋白酶。在1999年，后者被确定为ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的解聚素和金属蛋白酶)。迄今为止已经识别ADAMTS 1至20，并且ADAMTS 4和5分别对应于聚蛋白聚糖酶-1和聚蛋白聚糖酶-2, (Abbaszade I. 等人, J. Biol. Chem. 274 (33): 23443–23450, 1999,  Hurskainen T.L. 等人, J. Biol. Chem. 274 (36): 25555–25563, 1999)。通常，MMP已经被认为主要导致软骨损伤，但很多报道已经证实在骨关节炎 (OA)患者的关节中存在的聚集蛋白聚糖片段主要为由聚蛋白聚糖酶裂解的片段。因此，聚蛋白聚糖酶还被认为是这些疾病状况的显著恶性因素。

聚蛋白聚糖酶已经示出参与裂解聚集蛋白聚糖，原骨胶原加工(Colige A 等人, Proc. Natl Acad. Sd. USA, 94, 2374-2379, 1997)、炎症 (Kuno K. 等人, J. Biol. Chem., 272, 556-562, 1997)、血管生成 (Vazquez F. 等人, J. Biol. Chem. 1999, 274, 23349-23357)和肿瘤侵袭(Masui T. 等人, J. Bio.l Chem., 272, 556- 562, 1997)。

ADAMTS5为ADAMTS（具有血小板反应蛋白基序的解聚素和金属蛋白酶）蛋白家族的成员。该家族成员分享几个不同的蛋白分子，包括前肽区域、金属蛋白酶结构域、类解聚素结构域、和血小板反应蛋白1型(TS)基序。该家族的单个成员与C-端TS基序的数目不同，并且一些具有独特的C-端结构域。由该基因编码的酶含有两个C-端TS基序和功能作为裂解聚集蛋白聚糖的聚蛋白聚糖酶，一种主要的软骨蛋白聚糖。

其中删除ADAMTS5的催化结构域的基因改性小鼠对在骨关节炎的实验模型中的软骨损伤耐受(Glasson S.S. 等人, Nature 434 (7033): 644–648, 2005)，ADAMTS5是炎性关节炎的小鼠模型中小鼠软骨中的主要聚蛋白聚糖酶(Stanton H. 等人, Nature 434 (7033): 648–652, 2005)。

另外，指出聚蛋白聚糖酶如MMP参与肿瘤细胞的转移或组织渗透，并因此预期聚蛋白聚糖酶抑制剂是有效的抗肿瘤试剂。此外，以下文件公开了聚蛋白聚糖酶抑制剂也有效于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、痛觉过敏,  类风湿性关节炎、关节损伤、反应性关节炎、硬化、作为炎性肠病的炎性疾病、溃疡性结肠炎、胃炎、牛皮癣、湿疹和皮炎、哮喘、过敏反应、慢性阻塞性肺病、纤维化肺、急性呼吸窘迫(ARDS)、肺部感染、间质性肺炎、动脉粥样硬化、骨质疏松症、年龄相关性黄斑变性、心肌梗死、角膜溃疡癌、肿瘤转移和侵袭、作为骨关节炎中的细胞外基质的不受控退化、中枢神经系统疾病、异常创伤修复、多发性硬化血管生成和再狭窄。

US7030242、US6566384和WO9805635公开了异羟肟酸和羧酸衍生物作为聚蛋白聚糖酶和MMP-13抑制剂，其用于骨关节炎。US20080096918公开了环脲衍生物作为聚蛋白聚糖酶抑制剂，其用于类风湿性关节炎和骨关节炎。

WO2001062750和WO2000012478公开了芳基哌嗪作为MMP抑制剂，其用于各种疾病。WO2009109230公开了芳基-和杂芳基苯并吡喃酮脒基衍生物，其用于骨关节炎和癌症相关的疼痛，WO2008024922公开了羟基喹啉衍生物，其用于金属蛋白酶相关的障碍。

WO2005058884公开了环丙烷化合物作为聚蛋白聚糖酶和MMP-13抑制剂，其用于障碍例如类风湿性关节炎和骨关节炎、关节损伤、反应性关节炎、骨吸收障碍、癌症、哮喘、过敏反应、慢性肺气肿、纤维化肺、急性呼吸窘迫(ARDS)、肺部感染和间质性肺炎。

WO2007008994和WO2008058278公开了谷氨酸衍生物作为聚蛋白聚糖酶抑制剂，其用于关节炎障碍、骨关节炎、癌症、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、年龄相关性黄斑变性、心肌梗死、角膜溃疡和其他眼表疾病、肝炎、主动脉瘤、肌腱炎、中枢神经系统疾病、异常创伤修复、血管生成, 再狭窄, 硬化、多发性硬化、血管球性肾炎、移植物抗宿主疾病、糖尿病、炎性肠病、休克、无脊椎椎间盘退行性病变、中风、骨质缺乏和牙周病。

本发明基于寻具有有价值性质的新型化合物特别是溃疡可以用于制备药物的那些的目的。

本发明的目的具体为寻新型活性化合物并且尤其优选新型ADAMTS5抑制剂，其可以用于预防和骨关节炎并特别是具有对于ADAMTS5的高选择性。另外，该目的寻求新型ADAMTS5抑制剂，其至少对于局部或关节内给药充分稳定。

发明概述

令人惊奇地，发现根据本发明的式I化合物高度有效地抑制ADAMTS5或ADAMTS4和ADATMS5两者，其在形成骨关节炎中起到重要作用。此外，本发明化合物是ADAMTS5或ADAMTS4和ADATMS5两者的高度选择性抑制剂而没有抑制MMP1和MMP14形式的其他MMP，其能够导致不期望的副作用。另外，根据本发明的化合物在滑液中具有足够好的稳定性，意味着它们适合关节内给药并因此用于骨关节炎或类风湿性关节炎。

令人惊讶地，与WO2007008994的类似化合物相比，本发明化合物（其在α位被取代成羧酸）示出对于ADAMTS5或ADAMTS4和ADATMS5两者的较高选择性，而WO2007008994的化合物被公开为还抑制导致不期望的副作用的其他MMP（基质金属蛋白酶）。另外，本发明化合物是比WO2007008994的化合物更有效的ADAMTS5抑制剂。此外，脂族羧酸为在本情况酰基葡糖苷酸中在反应性代谢物形成下代谢消除。例如对于WO2007008994的化合物(S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基乙基氨基甲酰基]-丁酸描述的反应性代谢物的该形成和高剂量导致较高危险的特质毒性(Smith G. F., Designing drugs to avoid toxicity, 2011)。与WO2007008994的化合物相比，由于在α位被取代成羧酸，本发明的化合物示出显著降低的葡萄糖醛酸化(glucuronidation)，导致较小毒性。最后，与WO2007008994的化合物相比，本发明化合物示出明显增加的血浆蛋白结合（人蛋白）。

本发明涉及式I化合物,

其中

X                                        为CHR¹或CR¹R²，其中R¹和R²和与它们键合的C-原子一起任选形成含有3至7个C-原子的环烷基或杂环基，其中1 至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, -SO-, –SO₂–, –NR–,  –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, –NRSO₂R’–, –COO–, –CONR–或–CH=CH–替代并且其中1至11个H-原子任选被F或Cl替代,

D                                        为-E-G-K或-L,

E, K                                  彼此独立地为饱和、不饱和或芳族烃环，其未被取代或被R¹或R²取代1至4次，或具有1至4个选自N、O和S的杂原子的单环饱和、不饱和或芳族杂环，其未被取代或被R¹, R², =S, =NR¹或=O单-、二-或三取代,

G                                        为单键,

L                                        为-E-G-K, 其中 E和K除了单键G之外通过含有1至3个C-原子的另外的烷基连接基连接，其中一个CH₂-基团任选被–CR¹R²–, –O–, –S–, -SO-, –SO₂–, –NR¹–, –OCO–,               –NR¹CONR²–, –NR¹CO–, –NR¹SO₂R²–, –COO–, –CONR¹–或–CH=CH–替代,

Y                                        为H, R¹或饱和、不饱和或芳族烃环，其未被取代或被R¹取代1至4次，或具有1至4个选自N、O和S的杂原子的单环饱和、不饱和或芳族杂环，其未被取代或被R¹, =S, =NR¹ 或=O单-、二-或三取代,

Q                                        为单键或含有1至10个C-原子的线性、支化或单-或二环烷基连接基，其中1至5个CH₂-基团任选被–CR³R⁴–, –S–, –SO–,          –SO₂–, –NR³–,  –OCO–, –NR³CONR⁴–, –NR³CO–,               –NR³SO₂R⁴–,  –COO–或–CONR³–替代并且其中1至20个H-原子任选被F或Cl替代，其中 R³和R⁴和与它们键合的原子一起任选形成含有3至7个C-原子的环烷基或杂环基，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, –SO–, –SO₂–, –NR–,  –OCO–, –NRCONR’–,  –NRCO–, –NRSO₂R’–,        –COO–, –CONR–或–CH=CH-替代并且其中1至11个H-原子任选被F或Cl替代,

R¹, R², R³, R⁴                      彼此独立地选自：Hal, E, OR, NRR’, SOR, SO₂R, SO₂NRR’, CN, COOR, CONRR’, NRCONR’R’’, NRSO₂R’, NRCOR’, 含有1至10个C-原子的线性或支化烷基，其未被取代或被=S, =NR, =O, E, OR, NRR’, SOR, SO₂R, SO₂NRR’, CN, COOR, CONRR’, NRCONR’R’’, NRSO₂R’或NRCOR’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, –SO–, –SO₂–,    –NR–, –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, –NRSO₂R’–,            –COO–, –CONR–, –C≡C–或–CH=CH–替代并且其中1至20个H-原子任选被F或Cl替代，和含有3至7个C-原子的环烷基或杂环基，其未被取代或被=S, =NR, =O, E, OR, NRR’, SOR, SO₂R, SO₂NRR’, CN, COOR, CONRR’, NRCONR’R’’, NRSO₂R’或NRCOR’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, –SO–, –SO₂–, –NR–,  –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, – NRSO₂R’–, –COO–, –CONR– 和–CH=CH-替代并且其中1至11个H-原子任选被F或Cl替代,

R,R’                                   彼此独立地选自：H, Hal, E, R⁵, OR⁵, NR⁵, SO₂R⁵, SO₂NR⁵R⁶, CN, COOR⁵, CONR⁵R⁶, NR⁵CONR⁵R⁶, NR⁵SO₂R⁶, NR⁵COR⁶, 含有1至10个C-原子的线性或支化烷基，其未被取代或被=S, =NR⁵, =O, Hal, E, R⁵, OR⁵, NR⁵, SO₂R⁵, SO₂NR⁵R6, CN, COOR⁵, CONR⁵R⁶, NR⁵CONR⁵R⁶, NR⁵SO₂R⁶或NR⁵COR⁶单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, –SO–, –SO₂–, –NR⁵–, –OCO–,      –NR⁵CONR⁶–, –NR⁵CO–, – NR⁵SO₂R⁶–, –COO–, –CONR⁵–, –C≡C–或–CH=CH–替代并且其中1至20个H-原子任选被F或Cl替代，和含有3至7个C-原子的环烷基或杂环基，其未被取代或被=S, =NR⁵, =O, Hal, E, R⁵, OR⁵, NR⁵, SO₂R⁵, SO₂NR⁵R⁶, CN, COOR⁵, CONR⁵R⁶, NR⁵CONR⁵R⁶, NR⁵SO₂R⁶或NR⁵COR⁶单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–, –S–, –SO–, –SO₂–, –NR⁵–, –OCO–, –NR⁵CONR⁶–, –NR⁵CO–,  –NR⁵SO₂R⁶–, –COO–, –CONR⁵–或–CH=CH–替代并且其中1至11个H-原子任选被F或Cl替代,

R⁵, R⁶                                彼此独立地为H、烷基或单-或二环饱和、不饱和或芳族的烃环或具有1至4个选自N、O和S的杂原子的杂环

R⁷                                       为H或含有1至7个C-原子的烷基，和

Hal                                     为F, Cl, Br或I,

和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明优选涉及全部上述的式I化合物，其中E为

并且X, D, G, K, L, Y, Q, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的另一优选实施方案为上述式I化合物，其中K为

并且X, D, E, G, L, Y, Q, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

根据本发明的另一优选实施方案为上述式I化合物，其中Q为

并且X, D, E, G, K, L, Y, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的另一优选实施方案为上述式I化合物，其中

R1,R2                                 彼此独立地为含有1至5个C-原子的线性或支化烷基，其未被取代或被E, OR, NRR’, COOR, CONRR’, NRCOR’或NRCONR’R’’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–,–NR–, –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, –COO–或–CONR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代，或含有3至6个C-原子的环烷基，其未被取代或被E, OR, NRR’, COOR, CONRR’, NRCOR’或NRCONR’R’’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–,–NR–,  –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, –COO–或–CONR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代,

并且X, D, E, G, K, L, Q, Y, R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的另一更优选实施方案为上述式I化合物，其中

R1,R2              彼此独立地为甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、异丁基、2-丁基、叔丁基、环丁基、OH或OR，其未被取代或被E或OR单-、二-或三取代并且其中1至3个CH₂-基团任选被–O–或–NR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代,

并且X, D, E, G, K, L, Q, Y, R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的特别优选的实施方案为式I化合物，其中

E为

K为

Q为

并且X, D, G, L, Y, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的另一特别优选的实施方案为式I化合物，其中

E为

K为

Q为

R¹,R²                                  彼此独立地为含有1至5个C-原子的线性或支化烷基，其未被取代或被E, OR, NRR’, COOR, CONRR’, NRCOR’或NRCONR’R’’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–,–NR–, –OCO–, –NRCONR’–, –NRCO–, –COO–或–CONR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代，或含有3至6个C-原子的环烷基，其未被取代或被E, OR, NRR’, COOR, CONRR’, NRCOR’或NRCONR’R’’单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O–,–NR–, –OCO–,               –NRCONR’–, –NRCO–, –COO–或–CONR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代,

并且X, D, G, L, Y, R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

本发明的另一特别优选的实施方案为式I化合物，其中

E为

K为

Q为

R¹,R²               彼此独立地为甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基、异丁基、2-丁基、叔丁基、环丁基、OH或OR，其未被取代或被E或OR单-、二-或三取代，其中1至3个CH₂-基团任选被–O– 或–NR–替代并且其中1至10个H-原子任选被F替代,

并且X, D, G, L, Y, R³, R⁴, R⁵, R⁶和R⁷彼此独立地具有上文公开的含义，和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

非常特别优选的是提供如下式I化合物，其选自

a) 4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸

b) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[5-(4-氟-苯基)-噻唑-2-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸

c) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[(S)-2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

d) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸

e) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

f) (2S,4S)-2-苄基-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-丁酸

g) (2S,4S)-2-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-乙基}-戊酸

h) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲氧基甲基-丁酸

i) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸

j) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-2-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

k) (2S,4S)-4-[(3-氟-联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

l) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[1-(4-氟-苯基)--4-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸

m) 4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡啶-2-羰基)-氨基]-丁酸

n) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸

o) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基-哌嗪-1-羰基)-氨基]-丁酸

p) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

q) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(5-甲基-噻唑-2-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸

r) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[2-(4-氟-苯基)-噻唑-5-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸

s) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡唑-1-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

t) (2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

u) 2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

v) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

w) 2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-2-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

x) (2S,4S)-4-[(3-氟-联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

y) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸甲酯

z) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[5-(4-氟-苯基)-噻唑-2-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

aa) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[2-(4-氟-苯基)-噻唑-5-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

bb) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(5-甲基-噻唑-2-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸甲酯

cc) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[1-(4-氟-苯基)--4-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

dd) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡唑-1-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

ee) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基--1-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

ff) 2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基-哌嗪-1-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

gg) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯

hh) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

ii) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯

jj) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡嗪-2-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

kk) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(1,1,3-三甲基-丁基氨基甲酰基)-丁酸

ll) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡嗪-2-羰基)-氨基]-丁酸

mm) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡唑-1-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

nn) (2S,4S)-4-[4-(1-二氟甲基-1H-吡唑-4-基)-苯甲酰基氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

oo) (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸

pp) (S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2,2-二甲基-丁酸

qq) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[3-(4-氟-苄基)-氧杂环丁烷-3-基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

rr) (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-丙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸

和其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。

如果上述氨基酸可以多种对映异构体形式存在，在上文和下文中包括全部这些形式和其混合物（例如DL形式）。

此外，缩写具有以下含义：

Boc              叔丁氧基羰基

CBZ              苄基氧基羰基

DNP             2,4-二硝基苯基

FMOC   9-芴基甲氧基羰基

imi-DNP       在咪唑环的1-位的2,4-二硝基苯基

OMe             甲酯

POA     苯氧基乙酰基

DCCI     二环己基碳二亚胺

HOBt     1-羟基苯并三唑

CDI              羰基联咪唑

DCM    二氯甲烷

DMA    二甲基乙酰胺

DMF             二甲基甲酰胺

EDCI    1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

MTBE   甲基叔丁基醚

PE         石油醚

RT               室温

TFA             三氟乙酸

THF             四氢呋喃

NMO    N-甲基吗啉

T3P              丙基膦酸酐

Hal是指氟、氯、溴或碘，特别是氟或氯。

A是非支化的(线性)、支化或环烃链并具有1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9或10个C原子。A优选表示甲基, 此外乙基, 丙基, 异丙基, 丁基, 异丁基, 仲丁基或叔丁基, 此外还戊基, 1-, 2-或3-甲基丁基, 1,1-, 1,2-或2,2-二甲基-丙基, 1-乙基丙基, 己基, 1-, 2-, 3-或4-甲基戊基, 1,1-, 1,2-, 1,3-, 2,2-, 2,3-或3,3-二甲基丁基, 1- 或2-乙基丁基, 1-乙基-1-甲基-丙基, 1-乙基-2-甲基-丙基, 1,1,2-或1,2,2-三甲基丙基, 线性或支化庚基, 辛基, 壬基或癸基。

环状烷基或环烷基优选表示（如果A为环状，其表示）环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。

=O为羰基氧，

另外，A还表示烯基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基等。

“烷基”以及具有前缀"烷"的其他基团，例如烷氧基和烷酰基，是指可以为线性或支化和其组合的碳链，除非另外定义碳链。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。特别优选的是C₁-C₅烷基。C₁-C₅烷基例如为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或戊基。

“芳基” “Ar”或“芳族烃残基”是指包含碳环原子的单-或多环芳族环系。优选的芳基为单环或二环6-10元芳族环系。“芳基”的实例包括但不限于苯基、2-萘基、1-萘基、联苯基、茚满基和其取代的衍生物。最优选的芳基为苯基。

“杂环”和“杂环基”是指包含至少一个选自O、S和N的杂原子的饱和或不饱和非芳族环或环系，还包括硫的氧化形式，即SO和SO₂。杂环的实例包括四氢呋喃(THF)、二氢呋喃、1,4-二氧杂环己烷、吗啉、1,4-二噻烷、哌嗪、、1,3-二氧杂环戊烷、咪唑烷、咪唑啉、吡咯啉、吡咯烷、四氢吡喃、二氢吡喃、氧硫杂环戊烷、二硫杂环戊烷、1,3-二氧杂环己烷、1,3-二噻烷、氧杂噻烷、硫代吗啉等。

“杂芳基”是指含有至少一个选自O、S和N的环杂原子的芳族或部分芳族杂环。因此，杂芳基包括稠合至其他类型环例如芳基、环烷基和并非芳族的杂环的杂芳基。杂芳基的实例包括：吡咯基、异噁唑基、异噻唑基、吡唑基、吡啶基、噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、噻唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、三嗪基、噻吩基、嘧啶基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、二氢苯并呋喃基、吲哚啉基、哒嗪基、吲唑基、异噁唑基、异吲哚基、二氢苯并噻吩基、吲哚嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、萘啶基、咔唑基、苯并二氧杂环己二烯基、苯并二氧杂环戊烯基、喹喔啉基、嘌呤基、呋咱基、噻吩基、异苄基呋喃基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、吲哚基、异喹啉基、二苯并呋喃基等。对于杂环基和杂芳基，包括含有3-15个原子的环和环系，形成1-3个环。

这些化合物的全部生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物和立体异构体, 包括它们全部比率的混合物，也是根据本发明的。

本发明还涉及这些化合物的光学活性形式(立体异构体)、对映异构体、外消旋体、非对映异构体和水合物和溶剂合物。

根据本发明的式I化合物由于它们的分子结构可以是手性的并因此可以各种对映异构体形式存在。它们因此可以为外消旋或光学活性形式。由于根据本发明化合物的外消旋体或立体异构体的药理学功效可能不同，因此可能需要使用对映异构体。在这些情况下，终产品，但也甚至是中间体，可以通过本领域技术人员已知的或在合成中已经原样使用的化学或物理测量分离成对映异构体化合物。

特别优选的是式I化合物的如下立体异构体：

。

药学上或生理学上可接受的衍生物是指例如根据本发明化合物的盐和所谓的前药化合物。前药化合物是指式I化合物，其已经采用例如烷基或酰基、糖或寡肽修饰并且其快速裂解或释放在有机体中以形成根据本发明的有效化合物。本发明化合物的前药为例如表1a的酯化合物No. 22-37，其中残基R⁷快速裂解或释放在有机体中以形成根据本发明的有效化合物。前药还包括根据本发明化合物的生物可降解聚合物衍生物，如例如在Int. J. Pharm. 115 (1995), 61-67中记载的。

合适的酸加成盐为全部生理学上或药学上可接受的酸的无机或有机盐，例如卤化物，特别是盐酸盐或氢溴酸盐、乳酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、乙酸盐、磷酸盐、甲基磺酸盐或对甲苯磺酸盐。

式I化合物的溶剂合物是指惰性溶剂分子在式I化合物上的加合物，其由于它们相互吸引力而形成。溶剂合物为例如水合物，例如一水合物或二水合物、或醇合物，即与醇，例如与甲醇或乙醇的加成化合物。

本发明还涉及根据本发明的式I化合物的混合物，例如两种非对映异构体的例如1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:100或1:1000比率的混合物。它们特别优选为两种立体异构化合物的混合物。

本发明的另一实施方案为制备式I化合物的方法，其特征在于所述化合物通过结构块(building blocks)的逐步反应制备（参见实施例2）。

在各情况下可以逐步进行反应并采用保护基概念的改编改变结构块的连接反应的顺序。

起始材料或起始化合物通常是已知的。如果它们是新颖的，它们可以通过本身已知的方法制备。

如果需要的话，也可以通过不从反应混合物分离起始原料，但代替地立即将它们进一步转化成式I化合物而原位形成该起始原料。

式I化合物优选通过溶剂分解特别是通过水解或通过氢解从它们的官能衍生物释放它们获得。用于溶剂分解或氢解的优选的起始原料为含有相应保护的氨基、羧基和/或羟基代替一个或多个游离氨基、羧基和/或羟基的那些，优选携带氨基保护基代替连接至N原子的H原子的那些。优选方案为此外提供携带羟基保护基代替羟基的H原子的起始原料。优选方案是还提供携带保护的羧基代替游离羧基的起始原料。多个相同或不同的保护的氨基、羧基和/或羟基存在于起始原料的分子中也是可以的。如果存在的保护基彼此不同，它们在很多情况下可以选择性裂解掉。

用作起始原料的式I化合物的官能衍生物可以通过例如在所述标准作品和专利申请中记载的氨基酸和肽合成的已知方法制备。

式I化合物从它们的官能衍生物释放，取决于使用的保护基，例如借助于强酸，有利地使用三氟乙酸或高氯酸，但还使用其他强无机酸，例如盐酸或硫酸、强有机酸，例如三或磺酸例如苯甲酸或对甲苯磺酸。另外的惰性溶剂和/或催化剂的存在是可以的，但不总是必要的。

取决于各合成路线，起始原料可以任选在惰性溶剂的存在下反应。

合适的惰性溶剂为例如庚烷、己烷、石油醚、DMSO、苯、甲苯、二甲苯、三氯乙烯、1,2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷；醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚，例如二乙醚、二异丙醚（优选对于在吲哚氮上取代）、四氢呋喃(THF)或二氧杂环己烷；二醇醚，例如乙二醇单甲醚或单乙醚、乙二醇二甲醚（二甘醇二甲醚）；酮，例如丙酮或丁酮；酰胺，例如乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)；腈，例如乙腈；酯，例如乙酸乙酯，羧酸或酸酐，例如乙酸或乙酸酐，硝基化合物，例如硝基甲烷或硝基苯，任选还有所述溶剂彼此的混合物或与水的混合物。

溶剂的量不重要；每g待反应的式I化合物可以优选添加10 g至500 g溶剂。

可以有利的是添加酸结合试剂，例如弱酸的碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或其他碱金属或碱土金属盐，优选钾、钠或钙盐，或添加有机碱，例如三乙胺、二甲胺、吡啶或喹啉，或过量的胺组分。

根据本发明的所得化合物可以从制备它们的相应的溶液分离（例如通过离心和洗涤）和可以在分离之后储存在另一组合物中，或它们可以直接保留在制备溶液中。根据本发明的所得化合物也可以溶解在需要的溶剂中用于特定用途。

合适的反应温度为0至40℃，优选5至25℃的温度。

反应持续时间取决于所选择的反应条件。一般而言，反应持续时间为0.5 小时至10天，优选1至24小时。在使用微波时，反应时间可以减少到1至60分钟的值。

式I化合物和制备它们的起始原料还另外通过已知方法例如在对于所述反应已知并适合的反应条件下制备，如在文献中记载的(例如在标准作品，例如Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie [Methods of Organic Chemistry], Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart)。在此也可以使用本身已知的变体，其在本文中没有更详细地描述。

常规操作步骤，例如添加水至反应混合物和萃取，能够使化合物在除去溶剂之后获得。对于产物的进一步纯化，之后进行蒸馏或结晶或进行层析纯化可能有利。

本发明的另一实施方案为用于制备式I化合物的方法，其特征在于

a) 通过采用酸处理将式I化合物的碱转化成其一种盐，或

b) 通过采用碱处理将式I化合物的酸转化成其一种盐。

可以使用碱例如通过当量酸和碱在惰性溶剂例如乙醇中的反应将式I化合物转化成相关的加成盐，并随后蒸发。用于该反应的合适的碱特别是提供生理学上可接受的盐的那些。因此，式I的酸可以使用碱（例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾）转化成相应的金属盐，特别是碱金属或碱土金属盐或转化成相应的铵盐。提供生理学上可接受的盐的有机碱，例如乙醇胺也适合该反应。

另一方面，式I的碱可以使用酸例如通过当量碱和酸在惰性溶剂例如乙醇中的反应转化成相关的酸加成盐，随后蒸发。用于该反应的合适的酸为特别是提供生理学上可接受的盐的那些。因此，可以使用无机酸，例如硫酸、硝酸、氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸、磷酸，例如正磷酸、氨基磺酸，此外有机酸，特别是脂族、脂环族、芳脂族、芳族或杂环族的一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、特戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸或乙磺酸、乙烷二磺酸、2-羟基磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘单磺酸和萘二磺酸或月桂基硫酸。与生理学上不接受的酸的盐例如为盐，可以用于式I化合物的分离和/或纯化。

已经发现式I化合物是良好接受的并具有有价值的药理学性质，因为它们选择性抑制ADAMTS5。

因此，本发明此外涉及根据本发明的化合物用于制备药物的用途，所述药物用于和/或预防由ADAMTS5和/或ADAMTS5-促进的信号传导导致、促进和/或传播的疾病。

本发明此外还涉及特别是包含至少一种根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、前药、溶剂合物和立体异构体之一（包括它们全部比率的混合物）的药物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况。

特别优选的是提供特别是与ADAMTS5相关的生理学上和/或病理生理学上的状况。

生理学上和/或病理生理学上的状况是指为医学上相关的例如疾病或病况和医学上障碍、病痛、症状或并发症等特别是疾病的生理学上和/或病理生理学上的状况。

本发明进一步涉及药物，其包含至少一种根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体之一, 包括它们全部比率的混合物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎、类风湿性关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、和痛觉过敏。

本发明的特别优选的实施方案为药物，其包含至少一种根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体之一，包括它们全部比率的混合物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎和疼痛。

本发明进一步涉及药物，其包含至少一种根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体之一，包括它们全部比率的混合物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、痛觉过敏,  类风湿性关节炎、关节损伤、反应性关节炎、硬化、作为炎性肠病的炎性疾病、溃疡性结肠炎、胃炎、牛皮癣、湿疹和皮炎、哮喘、过敏反应、慢性阻塞性肺病、纤维化肺、急性呼吸窘迫(ARDS)、肺部感染、间质性肺炎、动脉粥样硬化、骨质疏松症、年龄相关性黄斑变性、心肌梗死、角膜溃疡癌(corneal ulceration cancer)、肿瘤转移和侵袭、作为骨关节炎中的细胞外基质的不受控退化、中枢神经系统疾病、异常创伤修复、多发性硬化、血管生成和再狭窄。

本发明进一步优选涉及药物，其包含至少一种根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物和立体异构体之一，包括它们全部比率的混合物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、痛觉过敏, 类风湿性关节炎、关节损伤、反应性关节炎、中枢神经系统疾病、多发性硬化、血管生成癌症、肿瘤转移和侵袭。

特别优选的是本发明涉及药物，其包含至少一种根据本发明的化合物，包括至少一种根据权利要求1至16的一项或多项的化合物，和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物和立体异构体之一，包括它们全部比率的混合物，其用于和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况，其选自骨关节炎、类风湿性关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、和痛觉过敏。

疼痛是复杂的感官知觉，其作为急性事件，具有警告和控制信号的特征，但作为慢性疼痛已经失去这个，并且在该情况下（作为慢性疼痛综合症）应该视为独立的症状并且当今作为独立的症状。痛觉过敏是在医学上用于对疼痛过度敏感和对刺激反应(其通常是疼痛的)的术语。能够触发疼痛的刺激，例如为压力、热、冷或炎症。痛觉过敏为痛觉过敏的形式，对刺激过度敏感的通用术语。触摸痛是在医学上用于由刺激触发的疼痛的感觉（其通常不导致疼痛）的术语。

意欲上文公开的药物包括根据本发明的化合物用于制备药物的相应用途，所述药物用于和/或预防上述生理学上和/或病理生理学上的状况。

另外，意欲上文公开的药物包括用于和/或预防上文生理学上和/或病理生理学上的状况的相应方法，其中将根据本发明的至少一种化合物给予需要此类的患者。

根据本发明的化合物优选展现出有利的生物活性，其能够容易地在酶分析和动物实验中证实，如实施例中描述的。在此类酶基分析中，根据本发明的化合物优选展现出并导致抑制效果，其通常由合适范围内，优选微摩尔范围内和更优选纳摩尔范围内的IC₅₀值记录。

根据本发明的化合物可以给予人类或动物，特别是哺乳动物，例如猿、狗、猫、大鼠或小鼠，并可以用于人类或动物体的和用于遏制上述疾病。它们可以进一步用作诊断剂或用作试剂。

此外，根据本发明的化合物可以用于分离和研究ADAMTS5的活性或表达。另外，它们特别适合用于与受干扰的ADAMTS5活性相关的疾病的诊断方法。因此，本发明此外涉及根据本发明的化合物用于分离或研究ADAMTS5的活性或表达或作为ADAMTS5的粘合剂和抑制剂的用途。

为了诊断目的，根据本发明的化合物可以例如为放射活性标记的。放射活性的标记的实例为³H, ¹⁴C, ²³¹I和¹²⁵I。优选的标记方法为iodogen法(Fraker 等人, 1978)。另外，根据本发明的化合物可以通过酶、荧光团和发光团标记。酶的实例为碱性磷酸酶、β-牛乳糖和葡糖氧化酶，荧光团的实例为荧光素，发光团的实例为鲁米诺，并且自动检测系统，例如用于荧光着，例如记载于4,125,828和US 4,207,554中。

式I化合物可以用于制备药物组合物，特别是通过非化学方法。在这种情况下，它们与至少一种固体、液体和/或半固体赋形剂或辅助剂和任选与一种或多种其他活性成分组合一起形成合适的剂型。

因此，本发明此外涉及药物组合物，其包含至少一种式I化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物。具体地，本发明还涉及药物组合物，其还包含赋形剂和/或辅助剂，并还涉及药物组合物，其包含至少一种其他药物活性成分。

具体地，本发明还涉及制备药物组合物的方法，其特征在于使式I化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体之一，包括它们全部比率的混合物，与固体、液体或半液体赋形剂或辅助剂和任选与其他药物活性成分一起形成合适的剂型。

根据本发明的药物组合物可以用作人类或兽类医学的药物。患者或宿主可以属于任何哺乳动物类，例如灵长类动物类，特别是人类；啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔；马、牛、狗、猫等。动物模型为对于实验研究感兴趣的，其中它们提供用于人类疾病的模型。

合适的载体物质为有机或无机物质，其适合肠内（例如口服）、肠胃外或局部给药并且不与新型化合物例如水、植物油（例如葵花油或鳕鱼肝油）、苄醇、聚乙二醇、胶质、糖类例如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石、羊毛脂或凡士林反应。由于本领域专家知识，本领域技术人员熟悉哪种辅助剂适合期望的药物制剂。除了溶剂例如水、生理学上的盐水溶液、或醇例如乙醇、丙醇或甘油、糖溶液例如葡萄糖或甘露醇溶液、或所述溶剂的混合物、成胶剂、片剂助剂和其他活性成分载体之外，还可以使用例如润滑剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、抗氧化剂、分散剂、消泡剂、缓冲物质、调味料和/或芳香料或矫味剂、防腐剂、增溶剂或染料。如果需要的话，根据本发明的组合物或药物可以包含一种或多种其他的活性成分，例如一种或多种维生素。

术语“药物制剂”和“药物组合物”出于本发明目的作为同义词使用。

本文中使用的“药学上接受的”是指药物、沉淀剂、赋形剂、辅助剂、稳定剂、溶剂和帮助将从其中获得的药物组合物给予哺乳动物而没有不期望的生理学上副作用例如反胃、眩晕、消化问题等的其他试剂。

在用于肠胃外给药的药物组合物中，需要等渗性、水合正常(euhydration)和制剂（低毒性）的、使用的辅助剂的和初级包装的容忍性和安全性。令人惊奇地，根据本发明的化合物优选具有如下优点：可以直接使用，并且用于除去毒理学上不可接受的试剂，例如高浓度有机溶剂或其他毒理学上不可接受的辅助剂的进一步的纯化步骤因此在使用药物制剂中的本发明的化合物之前不是必要的。

本发明特别优选还涉及药物组合物，其包含沉淀的非晶体、沉淀的晶体形式或溶解的或悬浮形式的至少一种根据本发明的化合物，和任选的赋形剂和/或辅助剂和/或其他药物活性成分。

根据本发明的固体化合物优选能够制备高浓缩制剂，而不发生根据本发明的化合物的不利的不期望的聚集。因此，可以借助于根据本发明的化合物和含水溶剂或在含水介质中制备具有高活性成分内容物的即用型溶液。

也可以冻干所述化合物和/或其生理学上可接受的盐和溶剂合物和使用所得冻干物，例如用于制备注射制品。

可以通过在水溶液和任选的添加辅助剂中溶解或悬浮根据本发明的化合物制备含水组合物。至此，包含限定浓度的所述其他辅助剂的限定体积的储存溶液有利地添加至具有限定浓度的根据本发明的化合物的溶液或悬浮液中，并且所述混合物任选用水稀释成预计算浓度。或者，所述辅助剂可以固体形式添加。在各情况下需要的量的储存溶液和/或水可以随后添加至获得的水溶液或悬浮液中。根据本发明的化合物也可以有利地直接溶解或悬浮在包含全部其他辅助剂的溶液中。

可以有利地制备包含根据本发明的化合物并具有4至10的pH，优选具有5至9的pH和具有250至350 mOsmol/kg的渗透度的溶液或悬浮液。因此，可以直接给予所述药物组合物，而基本上没有静脉内、动脉内、关节内、皮下或经皮的疼痛。另外，所述制品也可以添加至输液剂，例如葡糖溶液、等渗盐水溶液或Ringer溶液，其也可以含有其他活性成分，因此还能够给予相对大量的活性成分。

根据本发明的药物组合物也可以包含多种根据本发明的化合物的混合物。

根据本发明的组合物为生理学上良好接受的，易于制备，可以精确分配和优选在整个储存和运输中并在多次冻融过程期间对于分析、分解产物和聚集体稳定。它们可优选在至少三个月或两年的时间内在冷冻器温度(2-8℃)和室温(23-27℃)和60%相对大气湿度(R.H.)下以稳定方式储存。

例如，根据本发明的化合物可以通过干燥以稳定方式储存并当需要时通过溶解或悬浮转化成即用型药物组合物。在不限于这些实施例的情况下，可行的干燥方法为例如氮气干燥、真空炉干燥、冻干、采用有机溶剂的洗涤和随后的空气干燥、液床干燥、流化床干燥、喷雾干燥、辊筒式干燥、层干燥、室温下的空气干燥和其他方法。

术语“有效量”是指在组织、体系、动物或人类中导致例如由研究者或医师寻求的或需要的生物或药物反应的药物或药物活性成分的量。

另外，术语“有效量”是指与尚未接受该量的相应对象相比，具有以下效果的量：疾病、综合症、疾病状况、病况、障碍的改进的、治愈、预防或消除、或副作用的预防、或疾病、病况或障碍进展中的减轻。术语“有效量”还包括有效提高正常生理机能的量。

在使用根据本发明的组合物或药物时，根据本发明的化合物和/或其生理学上可接受的盐和溶剂合物通常类似于已知的商购组合物或制品使用，优选的剂量为每个使用单位0.1至500 mg，特别是5至300 mg。日剂量优选为0.001至250 mg/kg人体，特别是0.01指100 mg/kg人体。所述组合物可以每日一次或多次给药，例如每日两次、三次或四次。然而，患者的单个剂量取决于大量的单个因素，例如使用的特定化合物的功效、年龄、体重、一般健康状况、性别、营养成分、给药时间和方法、排泄率、与其他药物的组合和特定疾病的严重度和持续时间。

在有机体中吸收药物活性成分的量度为其生物利用度。如果将药物活性成分以注射溶液形式静脉内递送至有机体，则其绝对生理利用度，即到达全身血液即主循环的不变形式的药物的比率为100%。在活性成分的口服给药的情况下，所述活性成分通常为制剂中的固体形式，并必须因此首先溶解从而其能够克服进入障碍，例如胃肠道、口腔黏膜、鼻膜或皮肤，特别是角质层，或可以被身体吸收。可以类似于J. Shaffer 等人, J. Pharm. Sciences, 88 (1999), 313-318的方法获得关于药代动力学，即生物利用度的数据。

此外，可以通过药物领域中通常已知的一种方法制备这类药物。

药物可以适合通过任何需要的合适途径，例如通过口服（包括含服或舌下）、直肠、经肺、经鼻、局部（包括含服、舌下或经皮）、阴道或肠胃外（包括皮下、肌内、静脉内、真皮内和特别是关节内）途径给药。这种类型的药物可以通过药物领域已知的全部方法例如通过合并活性成分与赋形剂或辅助剂制备。

肠胃外给药优选适合给予根据本发明的药物。在肠胃外给药的情况下，特别优选关节内给药。

因此，本发明还优选涉及根据本发明的药物组合物用于在和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况（其选自骨关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛或痛觉过敏）中关节内给药的用途。

关节内给药具有如下优点：可以将根据本发明的化合物直接给予关节软骨附近的滑液中并也能够从此处扩散至软骨组织中。根据本发明的药物组合物可以因此还直接注入关节间隙中并因此直接在期望的作用位点发挥其作用。根据本发明的化合物还适合制备具有缓慢、持续和/或可控释放活性成分的待肠胃外给药的药物。它们因此还适合制备延迟释放的制剂，其有利于患者，因为给药仅在相对大的时间间隔是必要的。

特别优选的是根据本发明的药物组合物在和/或预防生理学上和/或病理生理学上的状况（其选自骨关节炎、类风湿性关节炎、创伤性软骨损伤、疼痛、触摸痛、和痛觉过敏）中用于关节内给药的用途。

适合肠胃外给药的药物包括包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质的含水和非水无菌注射溶液，所述制剂凭借其能够与待的接受者的血液或滑液等张；以及含水和非水无菌悬浮液，其可以包含悬浮介质和增稠剂。所述制剂可以递送至单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并以在冻结干（冻干）状态储存，从而出于注射目的需要在使用前立即仅添加无菌载体液体，例如水。根据所述制剂制备的注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备。

根据本发明的化合物也可以脂质体递送体系形式例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡给药。可以从各种磷脂质，例如胆固醇、硬脂胺或卵磷脂形成脂质体。

根据本发明的化合物也可以偶合成可溶性聚合物作为目标药物赋形剂。此类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟基丙基甲基丙烯酰胺基苯酚、多羟基乙基天冬酰胺基苯酚或聚环氧乙烷多熔素（被棕榈酰基取代）。根据本发明的化合物此外可以偶合至生物可降解聚合物类，其适合实现慢速释放药物，例如聚乳酸、聚ε己内酯、多、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸-共-乙醇酸、聚合物，例如右旋糖酐和甲基丙烯酸酯之间的缀合物、聚磷酸酯、各种多糖和多胺和聚ε己内酯、白蛋白、壳聚糖、胶原或改性胶质和交联或水凝胶的两亲嵌段共聚物。

适合肠内给药（口服或直肠）的为特别是片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、糖浆剂、汁剂、滴剂或栓剂，并且适合局部给药的是软膏、乳油、糊、洗液、凝胶、喷雾剂、泡沫剂、气雾剂、溶液剂（例如在醇例如乙醇或异丙醇、乙腈、DMF、二甲基乙酰胺、1,2-丙二醇或其彼此和/或与水的混合物中的溶液）或粉剂。还特别适合局部使用的是脂质体组合物。

在提供软膏的制剂的情况下，所述活性成分可以与石蜡或水混溶性乳油基料一起使用。或者，所述活性成分可以与水包油型乳油基料或油包水型基料一起配制成乳油。

适合经皮给药的药物可以作为用于持续、紧密与接受者表皮接触的独立膏药递送。因此，例如所述活性成分可以通过电离子渗入疗法从膏药供应，如在Pharma-ceutical Research, 3(6), 318 (1986)中以一般形式记载的。

不言而喻，除了上文具体述及的组分之外，根据本发明的药物还可以包含在特定类型的药物制剂的领域中通常的其他试剂。

本发明还涉及套件(药盒)，其由如下的独立包装构成

a) 有效量的式I化合物和/或其生理学上可接受的盐、衍生物、溶剂合物、前药、和立体异构体，包括它们全部比率的混合物，和

b) 有效量的其他药物活性成分。

所述套件包括合适的容器，例如盒或纸箱、单独的瓶、袋或安瓿。所述套件可以例如包括单独的安瓿，其各自包含有效量的式I化合物和/或其药学上可接受的衍生物、溶剂合物、前药和立体异构体，包括它们全部比率的混合物，以及有效量的溶解或冻干形式的其他药物活性成分。

此外，根据本发明的药物也可以用于以某些已知疗法提供附加或协同效应和/或可以用于恢复某些现存疗法的功效。

除了根据本发明的化合物之外，根据本发明的药物组合物也可以进一步包含药物活性成分，例如用于骨关节炎的其他DDR2抑制剂、组织蛋白酶D抑制剂、ADAMTS5抑制剂、NSAIDS、Cox-2抑制剂、糖皮质激素、透明质酸、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、抗-CAM抗体，例如抗-ICAM-1抗体、FGF-18。对于上述其他疾病，根据本发明的药物组合物也可以在其中除了根据本发明的化合物之外还包含本领域技术人员已知的其他药物活性成分。

甚至在没有其他评论的情况下，认为本领域技术人员能够以最宽范围使用上述描述。因此，优选实施方案应该仅视为描述性公开，而绝非以任何方式限制。

因此，以下实施例意在解释本发明而并非对其限制。除非另外指明，否则百分比数据是指按重量计的百分比。全部温度都以℃表示。“常规操作”：添加水，如果需要的话，调节pH，如果需要的话，至2至10的值，取决于终产物的构成，所述混合物采用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，分离各相，经硫酸钠干燥有机相，过滤并蒸发，并通过在硅胶上的层析法和/或通过结晶纯化产物。

硅胶上的Rf值；质谱分析法：EI (电子碰撞电离): M⁺, FAB (快原子撞击)：(M+H)⁺，THF (四氢呋喃)，NMP (N-甲基吡咯烷酮)，DMSO (二甲基亚砜)，EA (乙酸乙酯)，MeOH (甲醇)，TLC (薄层层析法)。

已经合成并表征以下物质。然而，也可以通过本领域技术人员通过其他方法进行所述物质的制备和表征。

实施例 1: 式I化合物的示例

表1a

为了避免任何疑虑，在其中根据本发明的化合物的化学名称和所述化合物的化学结构的描述错误地不符合的全部情况下，通过化学结构的描述清楚地定义根据本发明的化合物。

表1b

实施例 2: 根据本发明化合物的制备

对于本领域技术人员，通过以下合成顺序可合成要求保护的化合物。所述实施例记载所述合成但并非将其限制至所示出的实施例。

合成顺序：

基于谷氨酸酯衍生物B，即容易从商购结构块A合成，低温下使用强碱例如LiHDMS去质子化、然后非对映选择性烷基化导致中间体C。应用该方法，可以使用各种反应性烷基化试剂，例如烷基-、烯丙基-、或苄基-卤化物（特别是碘化物）或环氧化物或其他活化烷基化剂。这些烷基化剂也可以携带另外的官能团，优选以保护形式。

通过第二去质子化-烷基化顺序也可以获得二烷基化化合物如C1：

可以使用该顺序制备以下中间体，而不将其限定至如下所示的实施例：

按照如下顺序实现其中D = -E-G-K或L并且E为芳族、杂芳族、环脂族或环杂脂族基团的式I化合物的获得：

苄酯的氢化裂解、使用本领域那些技术人员已知的标准偶合方法（例如EDCI-偶合，或使用氯甲酸异丁酯和NMM）的酰胺形成、在酸性条件下（例如DCM中的TFA，或二氧杂环己烷中的HCl）的BOC裂解提供中间体D。使用酰氯D-COCl或应用使用相应酸和n活化剂（例如T3P）的其他偶合方法的酰胺形成，然后在温和条件下的甲基酯裂解（在水、甲醇、THF或类似溶剂或合适的混合物中的LiOH）从而防止外消旋化会导致获得式的化合物。

在需要所需要的酰氯D-COCl的情况下，它们可以从相应的酸制备，所述酸为商购或通过实施例中所示的各种方法制备。其对于需要的胺结构块NH₂-Q-Y是正确的。

通过如下顺序实现其中D = -E-G-K或L并且E为N-基或N-哌嗪基的式I化合物的获得：

实施例 3: 4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡啶-2-羰基)-氨基]-丁酸 (表1a, 化合物13)

步骤1: (S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-苄酯5-甲酯

将(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-苄酯(10 g, 29.63 mmol)和干燥碳酸钾(6.13 g, 44.45 mmol)一起溶解在无水DMF (100 mL)中并冷却至0℃。向其中逐滴添加(2.02 mL, 32.60 mmol)并搅拌3 h以使反应完成。通过硅藻土垫过滤烧瓶的内容物并浓缩以获得通过柱层析法纯化的粗产物(石油醚/乙酸乙酯25%)以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 9.5 g, (91%, 灰白固体)。

步骤2: (2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸1-苄酯5-甲酯

在-78℃下将干燥THF (10 mL) 中的(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊二酸1-苄酯5-甲酯 (5 g, 14.24 mmol)添加至双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(1M 在THF中的溶液) (29.9 mL, 29.9 mmol)的搅拌溶液中并在同一温度下搅拌1 h。在-78℃下将(2.64 mL, 42.72 mmol)逐滴添加至反应物质中并搅拌1 h以使反应完成。采用氯化铵饱和溶液淬灭烧瓶的内容物并用乙酸乙酯萃取，分别用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩以获得通过柱层析法(石油醚/乙酸乙酯15%)纯化的粗产物。

收率: 3.8 g, (73%, 灰白固体)。

步骤3: (2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸5-甲酯

将(2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸1-苄酯5-甲酯 (2.5 g, 6.84 mmol)溶解在干燥甲醇(50 mL)中，并向其中添加10%碳载钯(250 mg)并在氢气气囊中搅拌1 h以使反应完成。通过硅藻土过滤反应物质并浓缩以获得无油形式的产物。

收率 : 1.6 g, (85%, 无油)。

步骤4: (2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

将(2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸5-甲酯 (2 g, 7.26  mmol)和N-甲基吗啉(1 g, 10.89 mmol)溶解在甲苯(25 mL)中并向其中添加2-(4-氟苯基)1,1-二甲基乙胺(1.33 g, 7.90 mmol)和氯甲酸异丁酯(1.2 mL, 8.74 mmol)。在RT下搅拌反应物质1 h以使反应完成。用水淬灭反应物质并分离有机层并经无水硫酸钠干燥，浓缩以获得通过柱层析法纯化的粗产物(石油醚/乙酸乙酯25%)。

收率:  2.75 g, (92%, 无胶)。

步骤5: (2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐

将(2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯 (2.75 g, 6.48 mmol)溶解在干燥DCM (20 mL)中，并向其中逐滴添加三氟乙酸(2 mL)并搅拌5 h以使反应完成。浓缩反应物质并与甲苯共沸两次以获得无油形式的标题盐。

收率: 2 g, (72%, 无油)。

步骤6: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡啶-2-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

将(2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (0.43 g, 1 mmol)和5-苯基吡啶-2-甲酸(0.2 g, 1 mmol)溶解于干燥DCM (10 mL)中并向其中添加三乙胺(0.42 mL, 3 mmol)。将烧瓶的内容物冷却至0℃，并向其中逐滴添加50% T3P在乙酸乙酯中的溶液(0.63 g, 2 mmol)，并搅拌2 h以使反应完成。用水、盐水洗涤反应物质。经无水硫酸钠干燥有机相，浓缩以获得通过柱层析法纯化的粗产物(石油醚/乙酸乙酯 15%)以获得灰白固体形式的产物。

收率: 0.2 g, (40%, 灰白固体.)。

步骤7: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡啶-2-羰基)-氨基]-丁酸

将(2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(5-苯基-吡啶-2-羰基)-氨基]-丁酸甲酯 (0.2 g, 0.39 mmol)溶解于溶剂THF (3 mL)、甲醇(1 mL) 和水(1 mL)的混合物中，并向其中添加氢氧化锂单水合物 (33 mg, 0.78 mmol)，并搅拌2 h以使反应完成。浓缩烧瓶的内容物并采用稀释的HCl水溶液淬灭粗物质。过滤获得的固体并用水洗涤，吸干以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 0.17 g, (89%, 灰白固体.)。

实施例 4: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸 (表1a, 化合物14)

步骤1: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤6的程序使用6-苯基烟酸(80 mg, 0.4 mmol)和(2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (0.18 g, 0.4 mmol)合成以提供灰白固体形式的标题化合物。

收率 : 0.12 g, (60%, 灰白固体.)。

步骤2: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸

使用类似于实施例1步骤7的程序使用4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(6-苯基-吡啶-3-羰基)-氨基]-丁酸甲酯(0.1 g, 0.19 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 30 mg, (31%, 灰白固体.)。

实施例 5: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸 (表1a, 化合物16)

步骤1: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤6的程序使用4-吡啶-3-基苯甲酸(120 mg, 0.6 mmol)和(2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (0.26 g, 0.6 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 130 mg, (39%, 灰白固体.)。

步骤2: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

使用类似于实施例1步骤7的程序使用 (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-3-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯 (0.1 g, 0.19 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 40 mg, (46%, 灰白固体.)。

通过应用实施例3步骤6中描述的程序使用合适的酸作为偶联搭配物，已经制备以下酯：

实施例 6: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-2-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

。

实施例 7: (2S,4S)-4-[(3-氟-联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

。

实施例 8: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸甲酯

。

实施例 9: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[5-(4-氟-苯基)-噻唑-2-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

。

实施例 10: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[2-(4-氟-苯基)-噻唑-5-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

。

实施例 11: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(5-甲基-噻唑-2-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸甲酯

。

实施例 12: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[1-(4-氟-苯基)--4-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸甲酯

。

实施例 13: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡唑-1-基-苯甲酰基氨基)-丁酸甲酯

。

实施例 14: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基--1-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

将(2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (200 mg, 0.89 mmol)和DIPEA (175 mg, 1.35 mmol)溶解在乙腈(10 mL)中并冷却至0℃。向其中添加二琥珀酰亚胺基碳酸酯(138 mg, 0.54 mmol)并在RT下搅拌反应物质1 h。在0℃下将4-苯基 (87 mg, 0.54 mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(82 mg, 0.54 mmol)添加至反应物质中并在RT下搅拌16 h以使反应完成。

用碳酸氢钠的水溶液淬灭反应物质并用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥并浓缩以获得通过柱层析法纯化的粗产物以获得无油形式的标题化合物。

收率 : 130 mg, (56%, 无油)。

通过应用实施例3步骤7中描述的程序，已经从相应的酯制备以下的酸：

实施例 15: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡啶-2-基-苯甲酰基氨基)-丁酸 (表1a, 化合物10)

手性纯度: 99.7%。

实施例 16: (2S,4S)-4-[(3-氟-联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物11)

手性纯度: 100%。

实施例 17: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸 (表1, 化合物9)

手性纯度: 100%。

实施例 18: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[5-(4-氟-苯基)-噻唑-2-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物2)

手性纯度: 100%。

实施例 19: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[2-(4-氟-苯基)-噻唑-5-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物20)

手性纯度: 94.2%。

实施例 20: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[4-(5-甲基-噻唑-2-基)-苯甲酰基氨基]-丁酸 (表1a, 化合物19)

手性纯度: 99.6%。

实施例 21: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-(4-吡唑-1-基-苯甲酰基氨基)-丁酸

手性纯度: 99.6%。

实施例 22: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-4-{[1-(4-氟-苯基)--4-羰基]-氨基}-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物12)

手性纯度: 100%。

实施例 23: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基--1-羰基)-氨基]-丁酸 (表1a, 化合物18)

手性纯度: 100%。

实施例 24: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基-哌嗪-1-羰基)-氨基]-丁酸甲酯

使用类似于实施例13的程序使用4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (200 mg, 0.89 mmol)和4-苯基哌嗪 (144 mg, 0.89 mmol)合成以获得无油形式的标题化合物。

收率: 120 mg, (54%, 无油)。

实施例 25: (2S,4S)-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-4-[(4-苯基-哌嗪-1-羰基)-氨基]-丁酸 (表1a, 化合物15)

手性纯度: 100%。

实施例 26: 4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸 (表1a, 化合物1)

步骤1: (2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤4的程序使用 (2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸5-甲酯 (400 mg, 1.4 mmol)和3,4,5-三甲氧基苄基胺 (310 mg, 1.5 mmol)合成以提供无胶形式的标题化合物。

收率: 0.3 g, (48%, 无胶)。

步骤2: (2S,4S)-4-氨基-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯TFA盐

使用类似于实施例1步骤5的程序使用 (2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯 (300 mg, 0.66 mmol)和TFA (2 mL)合成以获得TFA盐形式的标题化合物。

收率: 0.25 g, (83%, 无胶)。

步骤3: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤6的程序使用(2S,4S)-4-氨基-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯TFA盐 (250 mg, 0.53 mmol)和联苯-4-甲酸(105 mg, 0.53 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 110 mg, (38%, 灰白固体)。

步骤4: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸

使用类似于实施例1步骤7的程序使用(2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲酯 (100 mg, 0.19 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 60 mg, (62%, 灰白固体.)。

手性纯度: 在C2立体中心的部分外消旋。

实施例 27和28:

步骤1: (2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

使用类似于实施例步骤4的程序使用(2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸5-甲酯 (1.5 g, 5.45 mmol)和1-(4-氟苯基丙烷-2-胺盐酸盐(1.12 g, 5.99 mmol)合成以获得无胶形式的标题化合物。

收率: 0.9 g, (40%, 无胶)。

步骤2: (2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐

使用类似于实施例1步骤5的程序使用(2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯 (900 mg, 2.19 mmol)和TFA (2 mL)合成以获得TFA盐形式的标题化合物。

收率: 0.6 g, (65%, 无胶)。

步骤3: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤6的程序使用(2S,4S)-4-氨基-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (600 mg, 1.43 mmol)和联苯-4-甲酸(284 mg, 1.43 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物，其示出手性纯度的两种异构体，其通过手性prep分离，所获得的两种异构体示出以下数据。

异构体A

收率 : 80 mg, (12%, 灰白固体)。

异构体B

收率 : 90 mg, (13%, 灰白固体)。

步骤4: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸

表1a, 化合物17:

使用类似于实施例1步骤7的程序使用 (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯 (异构体A) (80 mg, 0.16 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率 : 50 mg, (65%, 灰白固体.)。

表1a, 化合物3:

使用类似于实施例1步骤7的程序使用 (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1-甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸甲酯 (异构体B) (90 mg, 0.18 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 55 mg, (63%, 灰白固体.)。

实施例 29: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸

步骤1: (2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤4的程序使用(2S,4S)-2-叔丁氧基羰基氨基-4-甲基-戊二酸5-甲酯 (0.37 g, 1.34 mmol)和(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基乙基)胺(0.2 g, 1.34 mmol)合成以获得无胶形式的标题化合物。

收率: 0.12 g, (23%, 无胶)。

步骤2: (2S,4S)-4-氨基-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐

使用类似于实施例1步骤5的程序使用(2S,4S)-4-叔丁氧基羰基氨基-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯 (110 mg, 0.27 mmol)和TFA (2 mL)合成以获得TFA盐形式的标题化合物，其原样用于下一步骤(仅通过TLC鉴定)。

收率: 50 mg, (44%, 无胶)。

步骤3: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯

使用类似于实施例1步骤6的程序使用(2S,4S)-4-氨基-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯TFA盐 (50 mg, 0.12 mmol)和联苯-4-甲酸(24 mg, 0.12 mmol)合成以获得灰白固体形式的标题化合物。

收率: 20 mg, (20 mg, 灰白固体)。

步骤4: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物4)

使用类似于实施例1步骤7的程序使用(2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-(1,1-二甲基-2-吡啶-3-基-乙基氨基甲酰基)-2-甲基-丁酸甲酯 (20 mg, 0.04 mmol)合成以获得其TFA盐形式的标题化合物(prep之后)。

收率: 10 mg, (41%, 黄粘性固体)。

实施例 30: (2S,4S)-2-[(联苯-4-羰基)-氨基]-2-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-乙基}-戊酸 (表1a, 化合物7)

应用对于实施例1步骤2-7描述的程序，但使用步骤2中的烯丙基溴作为烷基化剂，然后进行双键氢化，并使用步骤6中的联苯-4-甲酸获得标题化合物。

LCMS: 519,2 (M+1), Rt. 3.76 min., (方法: 柱: Waters XBridge (C18, 50x2.1mm, 3.5微米) 阀:0, 流量: 0.8 ml/min 柱温: 35℃, 洗脱液A: 0.1% 甲酸/乙腈, 洗脱液B: 0.1% 甲酸/水, Lin. 梯度: t=0 min 5% A, t=3.5min 98% A, t=6 min 98% A, 检测: DAD (220-320 nm), 检测: MSD (ESI 正/负) 质量范围: 100 – 800.)。

实施例 31: (2S,4S)-2-苄基-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-丁酸 (表1a, 化合物6)

应用对于实施例1步骤2-7描述的程序，但使用步骤2中的苄基溴作为烷基化剂并使用步骤6中的联苯-4-甲酸获得标题化合物。

LCMS: 567,2 (M+1), Rt. 2.27 min., (方法: 柱: Waters XBridge (C18, 30x2.1mm, 3.5微米) 阀:6, 流量: 1 ml/min 柱温: 35℃, 洗脱液A: 0.1% 甲酸/乙腈, 洗脱液B: 0.1% 甲酸/水, Lin. 梯度: t=0 min 5% A, t=1.6min 98% A, t=3 min 98% A, 检测: DAD (220-320 nm), 检测: MSD (ESI 正/负) 质量范围: 100 – 800.)。

实施例 32: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲氧基甲基-丁酸 (表1a, 化合物8)

应用对于实施例1步骤2-7描述的程序，但使用步骤2中的甲氧基甲基溴作为烷基化剂并使用步骤6中的联苯-4-甲酸获得标题化合物。

LCMS: 521,2 (M+1), Rt. 2.27 min., (方法: 柱: Waters XBridge (C18, 50x2.1mm, 3.5微米) 阀:0, 流量: 0.8 ml/min 柱温: 35℃, 洗脱液A: 0.1% 甲酸/乙腈, 洗脱液B: 0.1% 甲酸/水, Lin. 梯度: t=0 min 5% A, t=3.5min 98% A, t=6 min 98% A, 检测: DAD (220-320 nm), 检测: MSD (ESI 正/负) 质量范围: 100 – 800.)。

实施例 33: (2S,4S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟-苯基)-1,1-二甲基-乙基氨基甲酰基]-2-甲基-丁酸 (表1a, 化合物5)

应用对于实施例1步骤2-7描述的程序并使用步骤6中的联苯-4-甲酸获得标题化合物。

LCMS: 491,2 (M+1), Rt. 3,59 min., (方法: 柱: Waters XBridge (C18, 50x2.1mm, 3.5微米) 阀:0, 流量: 0.8 ml/min 柱温: 35℃, 洗脱液A: 0.1% 甲酸/乙腈, 洗脱液B: 0.1% 甲酸/水, Lin. 梯度: t=0 min 5% A, t=3.5min 98% A, t=6 min 98% A, 检测: DAD (220-320 nm), 检测: MSD (ESI 正/负) 质量范围: 100 – 800.)

1HNMR:

Bruker 400 MHz

LCMS:

方法 A

方法: A-0.1 % TFA/H₂O, B-0.1 % TFA/ACN: 流量- 2.0 mL/min。

柱: XBridge C8 (50x4.6mm, 3.5μ), +ve 模式

方法 B

A: 10mM NH4HCO3, B:ACN; 流速: 1.0 ml/min

柱:XBridge C8 (50x4.6mm, 3.5μ), +ve 模式

方法 C (ELSD)

A: 0.1% TFA/H2O , B:0.1% TFA/ACN ; 流速:2.0 ml/min

柱:XBridge C8 (50x4.6mm, 3.5A), +ve模式

HPLC:

方法 A

方法: A-0.1 % TFA/H₂O, B-0.1 % TFA/ACN: 流量 – 2.0 mL/min。

柱: XBridge C8 (50 x 4.6 mm, 3.5 μm)。

方法 B: A:10mM NH4HCO3/H2O, B:ACN ; 流速:0.8ml/min

柱: XBridge C8(150X4.6)mm, 3.5μm

手性纯度:

方法信息 : 流动相:0.1%DEA/己烷:IPA::80:20

柱:CHIRALCEL OJ-H(250x4.6)mm,5μm

流速:1.0mlmin。

实施例 34: ADAMTS-5的生物化学活性测试: 聚集蛋白聚糖肽裂解分析

ADAMTS-5为具有谷酰基-内切蛋白酶活性的金属蛋白酶并在球间结构域中在E373-A374处裂解聚集蛋白聚糖核心蛋白。为了完全分析化合物对AdamTS-5活性的抑制潜能，进行采用生物素化43mer 聚集蛋白聚糖寡肽作为底物的Alphascreen?分析。由ADAMTS-5导致的裂解导致在C-端片段处产生新表位(neoepitop)N-端ARGS。采用结合至生物素标记的链霉亲和素- AlphaScreen?  供体珠和锚定抗小鼠IgG-涂布的AlphaLisa?受体珠至生产的片段的另一端的抗新表位(“ARGSV”)抗体进行该产物的检测。从而，供体和受体珠靠近，并且通过释放单线态氧生成发冷光Alphascreen?信号。可以直接通过Alphascreen?信号的增强检测裂解活性剂。

所述聚集蛋白聚糖肽裂解分析在Perkin Elmer 384 AlphaPlate (proxiplate)浅孔微量滴定板中作为384孔AlphaScreen ? (Perkin Elmer)分析模式进行并在10 μl. 4.5 nM人重组AdamTS-5 (R&D systems, Wiesbaden, Germany)的总分析体积中用于高通量筛分，并在测试化合物（10种稀释浓度）不存在或存在下，在37℃下将30 nM生物素化肽ITVQTVTWPDMELPLPRNITEGEARGSVILTVKPIFEVSPSPL-K(bio) (定制, Biosynthan, Berlin, Germany)作为底物孵育在6 μl (100 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05 % Brij?-35, 1 % DMSO, 0.084 % BSA, pH 7.5)的总体积中180 min。停止该反应并通过添加2 μl检测溶液1 (在100mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.05 % Brij?-35, 0.1 % BSA, pH 7.5中的48 mM EDTA, 8 nM 聚集蛋白聚糖抗体N-端新表位 ARG，小鼠单克隆BC3抗体(MDBioproducts, Egg, Switzerland)、100 μg/ml 链霉亲和素 Alphascreen?供体珠(Perkin Elmer, Rodgau, Germany)进行第一检测步骤。在37℃下孵育1小时之后，添加在100mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.05 % Brij?-35, 0.1 % BSA, pH 7.5中的2 μl第二检测溶液( 25 μg/ml抗小鼠AlphaLisa?受体珠(Perkin Elmer, Rodgau, Germany)。在黑暗中在37℃下孵育该板2小时。

采用Envision多态读数器(Perkin Elmer LAS Germany GmbH)采用来自Perkin Elmer (激光模式)发射波长570 nm的Alphascreen程序测试AlphaScreen信号。所使用的全值为无抑制剂反应。对于零值，使用药理学参照。使用来自GeneData的程序Symyx Assay Explorer?或Condosseo?测定化合物的抑制值(IC50)。

实施例 35: MMP1 & MMP14的生物化学活性测试: 淬灭的肽蛋白酶分析

为了分别测定MMP-1和MMP-14蛋白酶活性的调制，在384孔Greiner低容积非结合微量滴定板中进行采用在肽上被第二标记Dnp (2,4-二硝基苯基)淬灭的荧光团MCA ((7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基)标记的合成肽底物的连续酶测试并用于高通量筛分。由MMP-1/14进行的肽底物的裂解产生荧光强度强度的增加。为了测试化合物的抑制活性，测定时间依赖性（动力学测试）荧光强度增加，其与底物的转换直接相关。

在不存在或存在测试化合物(10种稀释浓度)下，分别将10 nM人重组MMP-1催化结构域(Enzo Life Sciences, L?rach, Germany)和2.3 nM人重组MMP-14催化结构域(Enzo Life Sciences, L?rach, Germany)与7.5 μM肽底物MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(DNP)-Ala-Arg-NH₂ (Enzo Life Sciences, L?rach, Germany)混合在10 μl的总体积 (25 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ , 0.02 % Brij?-35, 1 % DMSO, pH 7.6)中。在添加底物之后，采用Envision多态读数器 (Perkin Elmer LAS Germany GmbH)在340 nm的激发波长和450 nm的发射波长下进行第一荧光强度测试（时间点1）。在室温下反应的孵育进行150 min之后，采用与如上所述相同的参数进行第二测试。为了分析MMP的活性，计算荧光强度的差值。所使用的全值为无抑制剂反应。所使用的药理学零值为最终浓度分别为340和160 nM的GM6001 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)。使用来自GeneData的程序Symyx Assay Explorer?或Condosseo?测定抑制值(IC50)。

实施例 36: 用于测试ADAMTS-5抑制剂的IL-1诱导的软骨破坏分析

该分析基于来自掌骨关节(MCP)的直径为4mm且厚度为1-2 mm的牛软骨外植体。在宰杀当天获得新鲜外植体。在开始实验之前，将外植体孵育在DMEM介质 + 10%皮脂 + 30 μg/ml抗坏血酸中48小时。进行预孵育以扩大分析窗口。在37℃和7.5% CO2下孵育外植体。用于全部组的复制数为n=4。

通过在无血清介质中采用IL-1α(10 ng/ml)处理外植体5天诱导软骨退化的诱导。作为阴性对照，使外植体在无血清DMEM介质中保持未处理。该对照不是基线计算的一部分，而是用于严格取决于IL1-α品质的退化度的内部参照。IL1-α诱导蛋白酶例如ADAMTS-5和MMP活性，其转而使基质退化。可以在上清液中测试基质的退化产品(GAG: 粘多糖)。由IL1-α诱导的GAG释放的水平定义为0%效果水平。作为抑制ADAMTS-5的阳性对照，其在GAG释放到介质的降低中得到反映，使用WO2007008994 (21μM)的化合物((S)-4-[(联苯-4-羰基)-氨基]-4-[2-(4-氟苯基)-1,1-二甲基乙基氨基甲酰基]-丁酸。这被视为100%效果水平。潜在的ADAMTS-5抑制剂首先以1 μM的浓度测试。降低GAG释放最高至50%的化合物以0.1μM的浓度再次测试。然后对于全剂量-响应(30 μM, 10 μM, 3 μM, 1μM, 0.3 μM, 0.1 μM, 0.03 μM, 0.01 μM)选择对GAG释放的具有效果>50%的化合物。该DRC为用于IC50计算的基础。

将IL-1α和ADAMTS-5抑制剂孵育5天，然后在上清液中测试GAG。采用木瓜蛋白酶消化外植体以测定外植体中GAG的量。

实施例 37: 软骨外植体分析

为了研究潜在组织蛋白酶D抑制剂对软骨退化的影响，使用基于牛外植体的pH-诱导的模型。其中培养外植体的介质的pH在此处匹配于关节炎膝的病理生理学pH。该pH为pH 5.5。在该先体外后体内模型中，随后研究潜在的组织蛋白酶D抑制剂其对于阻止软骨退化过程的作用。如果软骨损伤，将粘多糖(GAG)释放到细胞培养上清液中。释放的GAG的量可以借助于DMMB（二甲基亚甲基蓝盐酸盐）定量测定。如果使用二甲基亚甲基蓝盐酸盐检测硫酸化GAG，使用在633 nm下的吸收降低。由于工作也在非常低的GAG浓度下进行，甚至在采用GAG的DMMB的延长孵育之后，染料/GAG复合物没有沉淀出来，其有时在其他测试方法中在仅短时间之后发生。为了测定浓度，还使用硫酸软骨素记录校准线。所述GAG值可以用于计算IC₅₀值，即物质呈现出其作用的50%的浓度。

溶液：

孵育介质, pH 7.4:

无FBS的DMEM，添加1%的Pen/Strep和30 μg/ml的抗坏血酸，没有储存该介质。

孵育介质, pH 5.5:

无FBS的DMEM，通过添加MES 调节并使用pH计监测pH，添加1%的Pen/Strep和30 μg/ml的抗坏血酸。

用于GAG测试的溶液:

DMMB着溶液(V = 500 ml):

将8 mg的DMMB (二甲基亚甲基蓝)溶解在2.5 ml的乙醇 + 1 g的甲酸钠+ 1 ml的甲酸中，采用重蒸馏水补充至500 ml。

孵育介质: FBS (无FBS的介质)

硫酸软骨素溶液(标准曲线)

具有以下浓度的标准溶液的制备: 50 μg/ml;  25 μg/ml;  12.5 μg/ml;  6.25 μg/ml;  3.125 μg/ml; 1.56 μg/ml;  0.78 μg/ml和介质的空白对照。在实验也采用其进行的介质中进行标准溶液的制备。

1.) 程序：pH-诱导的牛外植体的软骨退化

首先制备牛外植体。在96-孔板中进行软骨退化的诱导。每孔孵育一个外植体。在各情况下，添加200 μl的无FBS的DMEM (孵育介质pH 5.5) + 30 μg/ml抗坏血酸。作为阴性对照，在pH 7.4 (无FBS)下孵育外植体(n = 4)。该对照不包括在数据计算中，但代替地确保该pH改变具有对于GAG的释放的期望的效果。在这点上，添加待测试的物质。进行无预孵育的外植体。在孵育器中在37℃和7.5% CO₂下采用对应的物质培养外植体3天。

2.) 孵育程序

为了研究组织蛋白酶D抑制剂对GAG（粘多糖）释放的影响，该物质以期望的浓度使用并培养3天。待测试的化合物在第一实验中以1 μM的浓度和1%的DMSO测试。在接下来的实验中以100 nM和1%的DMSO测试对GAG释放具有> 50%效果（这对应于在Assay Explorer中对照的< 50%）的物质。在浓度/效果关系中测试对GAG在这些条件下的释放具有> 50%效果（这对应于在Assay Explorer中对照的< 50%）的物质。以如下浓度研究所述化合物：30 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM, 0.3 μM, 0.1 μM, 0.03 μM, 0.01 μM。

所使用的阳性对照为具有0.01 μM浓度的胃酶抑素A。分析窗口由定义为0%效果的对照(pH 5.5)和定义为100%效果的对照pH 5.5 + 0.01 μM胃酶抑素A定义。在孵育3天之后，收集细胞培养物上清液并在-20℃下储存或直接测试。通过光度测定对释放的GAG的量进行测试。

基于阳性对照(pH 5.5 + 0.01 μM胃酶抑素A)和阴性对照(pH 5.5)以%计的各物质的效果(1值)对于1 μM和100 nM的浓度报道。所述值代表4次复制的平均值。在测定浓度/效果关系中，IC₅₀值报道至数据库(Assay Explorer)。

4.) 测量

直接测量细胞培养上清液(200 μl)或储存在-20℃下。为了确保精确测定GAG的浓度（μg/ml，上清液中的GAG），测量值必须位于标准曲线的线性区域中。为了确保这方面，常规地引入各个稀释液(1/5, 1/10, 1/20, 1/40)。采用介质配制稀释液，并自动引入(Hamilton)384-孔板(15 μl)中。同样自动地（或使用多通道移液管）添加60 μl的DMMB溶液。发生快速颜反应，其随后使用板读数器(例如Envision)在633 nm下测量。根据存在的样品的量，进行至少一个双测定。

通过MTP读数器提供所述数据作为csv或xls文件，并基于该模式(xls)作为原始数据储存或用于计算特定化合物的百分比效果。

5.) 品质对照

作为用于诱导pH-诱导的软骨退化的对照，在pH 7.4下孵育4个外植体。这对应于软骨的生理学pH，并且因此在此处预期没有对GAG释放的效果。这些GAG值（上清液的μg/ml）因此总是明显低于在pH 5.5下孵育的GAG值。

另一对照，两个都用于检测实验，但对于限定分析窗口也是重要的，为胃酶抑素对照(pH 5.5 + 0.01 μM胃酶抑素A)。该物质非特异性地阻断大部分蛋白酶的活性，并因此测定化合物的最大可能的效果。

(1)   Klompmakers, A. & Hendriks, T. (1986) Anal. Biochem. 153, 80-84, Spectrophotometric Determination of Sulfated Glycosaminoglycans。

(2)  Groves, P.J. 等人 (1997) Anal. Biochem. 245, 247-248

Polyvinyl alcohol-stabilised binding of sulfated GAGs to dimethylmethylene blue。

6.) 结果

使用该分析测定来自实施例1中表的一些化合物的IC₅₀值并在实施例1中的表中示出。

实施例 38: 在动物中抗痛觉过敏效果的研究

为了诱导炎性反应，在关节内一侧将角叉菜胶溶液(CAR, 1%, 50 μl)注入大鼠膝关节。未注入侧用于对照目的。使用每组六个动物。通过测微螺旋测定阈值（在膝关节上的中间侧），并通过直接红外光源通过Hargreaves方法(Hargreaves 等人, 1988)在脚底测定热痛觉过敏。由于炎症位点（膝关节）不同于测量位点（爪底），在此处使用术语次级热痛觉过敏，其机制对于发现有效镇痛药是重要的。

热痛觉过敏的实验描述 (Hargreaves测试): 将实验动物置于石英片上的塑料室中。在测试之前，首先给实验动物约5 – 15分钟时间以使其自身熟悉环境。一旦实验动物不再移动如此频繁，在熟悉阶段之后(探测阶段结尾)，红外光源，其聚焦在玻璃底平面，直接位于待刺激的后爪下。然后，通过按动按钮开始实验：红外光导致后爪的皮肤温度的升高。当已经达到预先设定的最大温度时，通过实验动物抬起后爪（作为达到疼痛阈值的表达）或通过红外光源的自动断开终止实验。只要实验动物静坐，就记录由爪反射的光。爪收回中断该反射，之后断开红外光源并记录从开启至断开的时间。以这样一种方式校准仪器从而使红外光源将皮肤温度在10 s内升高至约45℃(Hargreaves 等人 1988)。由出于此目的由Ugo Basile制造的仪器用于该测试。

CAR购自Sigma-Aldrich。在CAR之前进行关节内给于特定组织蛋白酶D抑制剂化合物No. 23 (从实施例 1, 表1, (S)-2-[(2S,3S)-2-((3S,4S)-3-氨基-4-{(S)-3-甲基-2-[(S)-4-甲基-2-(3-甲基丁酰胺基)戊酰胺基]丁酰胺基}-5-苯基戊酰胺基)-3-甲基戊酰胺基]-3-甲基丁酸)30分钟。10 μg/关节的量的去炎松(TAC)用作阳性参照，溶剂(媒介物)用作阴性对照。痛觉过敏通过发炎和未发炎爪之间的休药期的差值证实。

结果：TAC能够降低CAR-诱导的肿胀，但特异性DDR2抑制剂不能。相比之下，特异性DDR2抑制剂能够降低作为剂量函数的热痛觉过敏的程度。评价：已经示出本发明化合物起到抗痛觉过敏作用。这可以假设为由于本发明化合物没有展现出对炎性肿胀和因此对痛觉过敏触发有影响。其可以因此假设为本发明化合物在人体中产生疼痛降低作用。

实施例 39: 根据本发明化合物在牛滑液中的稳定性

牛滑液的提取：

在制备牛外植体（对于扩散盒或其他分析）中，使用奶牛蹄（掌骨关节）或奶牛膝。可以从两个关节获得滑液。至此，使用10 ml注射器和套管从打开的关节小心地移出滑液并转移到制备的2 ml Eppendorf容器中。根据动物（可以获得奶牛证件）标记Eppendorf容器。在此必须确保血液在准备关节期间不进入关节间隙。如果这是该情况，则滑液变成红并且结果必须丢弃。滑液基本上是高粘度的并且在颜上是微黄透明的。证实滑液的移出和宏观分析。

在SF中物质的稳定性测试的批料：

为了检测单个化合物的稳定性，混合一池的四个不同牛滑液。至此，使用约1 ml/SF。在5 ml玻璃容器中直接制备混合物。充分混合SF，但要小心。应该没有气泡或泡沫形成。至此，以最低速度使用涡流单元。待测试的化合物以1 μM的初始浓度测试（除非另有要求）。在添加所述物质之后，再次充分和小心地混合批料。对于视觉监控，为所有SF批料拍照，并将照片归档到用于相应实验的eLabBio文档中。图1以实施例方式示出这类型的照片文件。在37℃和7.5% CO₂下将批料在孵育器中孵育48小时。

取样：

在预同意的时间之后进行取样（除非另外要求，见下文）。每次从混合物移出200 μl的SF并直接转移到0.5 ml “低结合” Eppendorf容器中。使用“低结合” Eppendorf容器从而使物质与容器塑料的相互作用最小化。已经将200 μl乙腈引入Eppendorf容器中，从而此后形成SF的1 + 1混合物。这简化了随后的分析，但蛋白的沉淀可能在添加SF之后立即发生。这应该在程序中注意到。0 h样品在添加所述物质之后立即取样。在稳定性计算中这对应于100%值。理想地，使用的浓度应该在此处恢复。可以在-20℃下冷冻样品。

所使用的阴性对照为不含物质的SF。所使用的阳性对照为含有1 μM物质的SF。这对应于0 h值并因此为100%稳定性。

在-20℃下将样品储存在“低结合” Eppendorf容器中。随后定量测量所述样品。

数据处理：

在图中将测试的浓度(ng/ml)对时间绘线(GraphPad Prism?)。在此测定物质的百分比稳定性。所使用的100%值为在时间0 h下在SF中的初始值。在各实验次数下在eLabBio中储存数据并报道在MSR数据库中（作为在相应的孵育时间之后的百分比稳定性）。

结果：

测试的全部化合物都保持稳定(参见实施例 1中的表)。化合物稳定性定义成48h 之后>80%化合物恢复。

实施例 40: 注射小瓶

使用2 N盐酸将100 g的式I化合物和5 g磷酸氢二钠在3 l重蒸馏水中的溶液调节至pH 6.5，在无菌条件下过滤，转移到注射小瓶中，在无菌条件下冻干并在无菌条件下密封。各注射小瓶含有5 mg的式I化合物。

实施例 41: 溶液

从在940 ml的重蒸馏水中的1 g式I化合物、9.38 g的NaH₂PO₄  2 H₂O、28.48 g的Na₂HPO₄· 12 H₂O和0.1 g苯扎氯铵制备溶液。将pH调节成6.8，并将溶液补充至1 l并通过辐射杀菌。该溶液可以滴眼液形式使用。

实施例 42: 软膏

在无菌条件下将500 mg的式I化合物与99.5 g的凡士林混合。

实施例 43: 安瓿

在无菌条件下将1 kg的式I化合物在60 l重蒸馏水中的溶液过滤，转移到安瓿中，在无菌条件下冻干并在无菌条件下密封。各安瓿含有10 mg的式I化合物。