作为溶血磷脂酸(LPA)受体拮抗剂的苄基化合物

作为溶血磷脂酸(LPA)受体拮抗剂的苄基化合物

发明领域

本发明涉及一系列可用于哺乳动物中的增殖或炎性疾病如癌症、纤维化或关节炎的新取代苄基化合物。本发明还包括这类化合物在哺乳动物特别是人中的增殖或炎性疾病的用途以及包含这类化合物的药物组合物。

相关领域概述

溶血磷脂是膜衍生生物活性脂质介质。溶血磷脂影响包括增殖、分化、存活、迁移、粘附、侵袭和形态发生的基本细胞功能。这些功能影响许多生物过程，包括但不限于神经形成、血管形成、伤口愈合、纤维化、免疫力、炎症和癌变。

溶血磷脂酸(LPA)是一种溶血磷脂，已经证实其通过多组特异性G蛋白偶联受体(GPCR)以自分泌和旁分泌的方式发挥作用。LPA与其同源性GPCR (LPA₁、LPA₂、LPA₃、LPA₄、LPA₅、LPA₆)的结合活化细胞内信号传递途径，从而产生多种生物学应答。LPA受体的拮抗剂可用于其中LPA起作用的疾病、病症或疾病状态，尤其是用于增殖或炎性疾病，如癌症、纤维化或关节炎。

在卵巢癌患者的腹水和血浆中检测到升高的LPA水平。已经证实LPA促进肿瘤细胞增殖、存活、迁移和侵袭。升高水平的LPA、改变的受体表达和改变的对LPA的应答可以对卵巢癌的发生、进展或结果产生贡献。LPA还潜在地涉及许多其它类型的癌症，诸如前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、头颈癌、肠癌和甲状腺癌。因此，LPA受体拮抗剂(优选亚型选择性的)应当能够降低这些作用，最可能导致癌症进展中的积极性的结果。

LPA主要经由G蛋白偶联受体，诸如EDG-2/LPA1、EDG-4/LPA2、EDG-7/LPA3、GPR23/LPA4、GPR93/LPA5、p2y5/LPA6发挥其生物学作用。特别地，EDG-4/LPA2和EDG-7/LPA3在恶性卵巢上皮细胞中一贯地增量调节，从而促进卵巢癌细胞对LPA的异常应答。这些受体切断了细胞中经由G_i、G_q,11或G_12,13途径的信号传递。改变经由这些途径的信号传递对于所有靶向GPCR的药物而言是常见的，这占据了超过一半的用于各种适应症的目前上市的药物。

由于磷脂酶PLA1和sPLA2（其将磷脂酸转化为LPA）从血小板的释放，在血液凝固过程中产生高水平的LPA。LPA被认为是用于细胞在体外的生长的血清中最有效的生长因子之一。

发明描述

本发明的目的是提供可用于哺乳动物中的增殖或炎性疾病，特别是与LPA的活动过度有关的那些，如癌症、纤维化或关节炎的新LPA受体拮抗剂，所述LPA受体拮抗剂在其活性以及其溶解度、代谢清除率和生物利用度特性方面具有优越的药理学性质。

因此，本发明提供了新的取代苄基化合物或它们的立体异构体或互变异构体或药学上可接受的盐，它们是LPA拮抗剂并且可用作药物，特别是在上述疾病的中。

化合物由式(I)定义：

 (I)，

其中：

R^1'、R^1''、R²、R³、R⁴、R^5'、R^5''独立地为H、Hal、OH、CN、NO₂、NH₂、A、NH(LA)、N(LA)₂、COOH、COO(LA)、SO₂(LA)、O(LA)、SO₂NH₂、SO₂NH(LA)、SO₂N(LA)₂，

X、Y、Z独立地为CH、C(LA)、C(Hal)或N，

Q为NR²、O或S，

LA为具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链烷基，其中一个、两个或三个H原子可被Hal代替，

R³为H或LA，

Ar为具有0、1、2、3或4个N、O和/或S原子和5、6、7、8、9或10个骨架原子的单环或双环芳香族碳环或杂环，其可为未取代的或彼此独立地被R^5'、R^5''单取代或二取代，

Hal为F、Cl、Br或I。

通常，所有出现大于一次的残基可相同或不同，即彼此独立。上文和下文，残基和参数具有式(I)规定的含义，除非另外清楚规定。

因此、本发明特别地涉及式(I)的化合物，其中至少一个所述残基具有下面指出的优选含义之一。

Hal表示氟、氯、溴或碘，特别是氟或氯。

“LA”表示具有1、2、3或4个C原子的直链或支链的线性烷基，其中1、2或3个H原子可被Hal代替，例如甲基、乙基、三氟甲基、二氟甲基、1,1,1-三氟乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。

“Ar”表示例如未取代的苯基或萘基，此外优选地，例如苯基或萘基，其各自被甲基、乙基、异丙基、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、硝基、氰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、三氟-甲基、甲磺酰基、氨基、甲基-氨基、二甲基-氨基、二乙基-氨基、羧基、甲氧基羰基单取代或二取代。

“Ar”还表示苯基、邻-、间-或对-甲苯基、邻-、间-或对-乙基-苯基、邻-、间-或对-丙基-苯基、邻-、间-或对-异丙基苯基、邻-、间-或对-叔丁基-苯基、邻-、间-或对-羟基--苯基、邻-、间-或对-硝基-苯基、邻-、间-或对-氨基-苯基、邻-、间-或对-(N-甲基-氨基)-苯基、邻-、间-或对-(N-甲基-氨基-羰基)-苯基、邻-、间-或对-乙酰胺基苯基、邻-、间-或对-甲氧基--苯基、邻-、间-或对-乙氧基-苯基、邻-、间-或对-乙氧基-羰基-苯基、邻-、间-或对-(N,N-二甲基-氨基)-苯基、邻-、间-或对-(N,N-二甲基-氨基羰基)-苯基、邻-、间-或对-(N-乙基-氨基)-苯基、邻-、间-或对-(N,N-二乙基氨基)-苯基、邻-、间-或对-氟-苯基、邻-、间-或对-溴-苯基、邻-、间-或对-氯-苯基、邻-、间-或对-(甲基磺酰胺基)-苯基、邻-、间-或对-(甲基磺酰基)-苯基，还优选地表示2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二氟-苯基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二氯-苯基、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-或3,5-二溴-苯基、2,4-或2,5-二硝基苯基、2,5-或3,4-二甲氧基-苯基、3-硝基-4-氯-苯基、3-氨基-4-氯-苯基、2-氨基-3-氯-苯基、2-氨基-4-氯-苯基、2-氨基-5-氯-苯基或2-氨基-6-氯-苯基、2-硝基-4-N,N-二甲基-氨基-苯基或3-硝基-4-N,N-二甲基-氨基-苯基、2,3-二氨基-苯基、对碘-苯基、4-氟-3-氯苯基、2-氟-4-溴苯基、3-溴-6-甲氧基苯基、3-氯-6-甲氧基-苯基、3-氟-4-甲氧基-苯基、3-氨基-6-甲基-苯基。

“Ar”还优选表示2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、1-、2-或3-吡咯基、1-、2-、4-或5-咪唑基、1-、3-、4-或5-吡唑基、2-、4-或5-噁唑基、3-、4-或5-异噁唑基、2-、4-或5-噻唑基、3-、4-或5-异噻唑基、2-、3-或4-吡啶基、2-、3-或4-吡啶基甲基、2-、3-或4-吡啶基乙基、2-、4-、5-或6-嘧啶基、2-、3-、5-或6-吡嗪-1-或4-基、还优选表示1,2,3-三唑-1-、-4-或-5-基、1,2,4-三唑-1-、-3-或5-基、1-或5-四唑基、1,2,3-噁二唑-4-或-5-基、1,2,4-噁二唑-3-或-5-基、1,3,4-噁二唑-2-基、1,3,4-噻二唑-2-或-5-基、1,2,4-噻二唑-3-或-5-基、1,2,3-噻二唑-4-或-5-基、3-或4-哒嗪基、1-、2-、3-、4-、5-、6-或7-吲哚基、2-、3-、4-、5-、6-或7-吲唑基、2-、3-、4-或5-异-吲哚基、2-、6-、或8-嘌呤基、1-、2-、4-或5-苯并咪唑基、1-、3-、4-、5-、6-或7-苯并-吡唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并噁唑基、3-、4-、5-、6-或7-苯并异噁唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并噻唑基、2-、4-、5-、6-或7-苯并异噻唑基、4-、5-、6-或7-苯并-2,1,3-噁二唑基、1-、3-、4-、5-、6-、7-或8-异喹啉基、3-、4-、5-、6-、7-或8-喹啉基、2-、4-、5-、6-、7-或8-喹唑啉基、喹喔啉--2-、3-、4-或5-基、4-、5-或6-酞嗪基、2-、3-、5-、6-、7-或8-2H-苯并-1,4--噁嗪基，其各自为未取代的，或被甲基、乙基、异丙基、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、硝基、氰基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、三氟-甲基、甲磺酰基、氨基、甲基-氨基、二甲基-氨基、二乙基-氨基、羧基、甲氧基羰基单取代或二取代。

从专利文件FR70999 (CAS登记号106545-83-9)中知道化合物3-乙基-2-1[-(苯基甲基)-2-基]-1H-吲哚并且因此排除在本专利申请的权利要求之外。

在式(I)的优选实施方案中，环手性碳原子处的立体化学如式(I')所示：

(I')，

其中所有残基具有式(I)规定的含义。

另外优选的是式(I)和(I')的子式1至19的化合物，其中

在子式1中

R^1'、R^1''独立地为H、甲基、F、Cl、Br或SO₂NH₂，

在子式2中

R⁴为H或甲基，

在子式3中

R³为H或甲基，

在子式4中

Ar为苯基、呋喃基、吡啶基、噻唑基或吲唑基，

在子式5中

R^5'、R^5''独立地为H、F、甲基、乙基、甲氧基、三氟甲基、羟基或硝基，

在子式6中

R^1'、R^1''独立地为H、甲基、F、Cl、Br或SO₂NH₂，

R³为H或甲基，

R⁴为H或甲基，

Ar为苯基、呋喃基、吡啶基、噻唑基或吲唑基，

R^5'、R^5''独立地为H、F、甲基、乙基、甲氧基、三氟甲基、羟基或硝基，

在子式7中

R³为H，

在子式8中

R⁴为H，

在子式9中

Ar为苯基，

在子式10中

Q为NR²，

R²为H、甲基或异丙基，

Z为N，

在子式11中

Q为NR²，

R²为H、甲基或异丙基，

Z为CH，

在子式12中

Y为CH、C(LA)或C(Hal)，

X为N，

在子式13中

Y为CH、C(LA)或C(Hal)，

X为CH，

在子式14中

Y为CH、C-CH₃或C-F，

X为N，

在子式15中

Y为CH、C-CH₃或C-F，

X为CH，

在子式16中

Q为NH，

Z为CH，

R^1'为H，

R^1''为F，

在子式17中

Q为NH，

Y为CH，

在子式18中

Ar为苯基，

R^5'、R^5''独立地为H、F或甲基，

在子式19中

R³为H，

R⁴为H，

Ar为苯基，

R^5'、R^5''独立地为H、F或甲基，

Q为NH，

Y为CH，

并且剩余的残基具有式(I)规定的含义。

式(I)的化合物可以具有一个或多个手性中心。它们可以相应地出现在多种对映异构形式中并且可以出现在外消旋体或光学活性形式中。因此，本发明还涉及光学活性形式、对映异构体、外消旋体、非对映异构体，统称为：这些化合物的立体异构体。

由于根据本发明的化合物的外消旋体或立体异构体的药物活性可能不同，使用对映异构体可能是合乎需要的。在这些情况下，终产物或甚至中间体可以通过本领域技术人员已知的化学或物理学手段分离成对映异构体化合物或甚至在合成中原样使用。

在外消旋胺的情况下，通过与光学活性的拆分试剂的反应，从混合物形成非对映异构体。合适的拆分试剂的实例为光学活性的酸，诸如R和S形式的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸、适当地N-保护的氨基酸(例如 N-苯甲酰基脯氨酸或N-苯磺酰基脯氨酸)，或各种光学活性的樟脑磺酸。同样有利的是在光学活性的拆分试剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸、三乙酸纤维素或碳水化合物的其它衍生物或固定在硅胶上的手性地衍生的甲基丙烯酸酯聚合物)的协助下的谱法对映异构体拆分。用于该目的的适当的洗脱剂是水性或醇性溶剂混合物，诸如，例如，己烷/异丙醇/乙腈，例如以82：15：3的比例。用于拆分含有酯基团(例如乙酰基酯)的外消旋体的巧妙的方法是使用酶，特别是酯酶。

本发明的化合物可以为前药化合物的形式。"前药化合物" 表示例如通过氧化、还原、水解等（其各自在酶促或无酶参与的条件下进行）在生理条件下在活体内转化成根据本发明的生物活性的化合物的衍生物。前药的实例是这样的化合物：其中本发明的化合物中的氨基基团被酰化、烷基化或磷酸化（例如二十烷酰基氨基、丙氨酰基氨基、特戊酰氧基甲基氨基）或其中羟基基团被酰化、烷基化、磷酸化或转化成硼酸酯（例如乙酰基氧基、棕榈酰基氧基、特戊酰氧基、琥珀酰氧基、富马酰氧基、丙氨酰氧基）或其中羧基基团被酯化或酰胺化，或其中巯基基团与载体分子形成二硫键（例如肽），所述化合物将药物选择性地递送至靶和/或细胞的胞液。这些化合物可以根据公知的方法从本发明的化合物制备。前药的其它实例为这样的化合物：其中本发明的化合物中的羧酸酯被例如转化为烷基-、芳基-、胆碱-、氨基、酰基氧基甲基酯、亚麻酰基-酯。

在本发明的化合物或其前药可出现互变异构（例如酮-烯醇互变异构）的情况下，各形式（例如酮或烯醇形式）单独地或一起作为以任何比例存在的混合物地要求保护。这一点同样适用于立体异构体，例如，对映异构体、顺式/反式异构体、构象异构体（conformers）等。如果需要的话，异构体可以通过本领域已知的方法分离，例如通过液相谱法。这一点同样适用于对映异构体，例如，通过使用使用手性固定相。此外，对映异构体可以通过将它们转化为非对映异构体来分离，即与对映异构纯的辅助性化合物偶联，然后分离所得非对映异构体并裂解所述辅助性残基。可替换地，本发明的化合物的任何对映异构体可以使用光学纯的起始原料从立体选择性合成获得。

本发明的化合物可以为药学上可接受的盐, 药学上可接受的溶剂合物，或药学上可接受的盐的药学上可接受的溶剂合物的形式。

术语"药学上可接受的盐"是指从药学上可接受的碱或酸制备的盐，包括无机碱或酸和有机碱或酸。在其中本发明的化合物含有一个或多个酸性或碱性基团的情况下，本发明还包括其相应的药学上可接受的盐。因此，含有酸性基团的本发明的化合物可以以盐的形式存在，并且可以根据本发明来使用，例如，作为碱金属盐、碱土金属盐或作为铵盐。这样的盐的更具体的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺诸如例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸成的盐。含有一个或多个碱性基团（即可以被质子化的基团）的本发明的化合物可以以盐的形式存在，并且可以根据本发明以其与无机或有机酸的加成盐的形式来使用。合适的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、特戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸和本领域技术人员已知的其它酸。如果本发明的化合物在分子中同时含有酸性和碱性基团，除提及的盐形式以外，本发明还包括内盐或甜菜碱(两性离子)。各种盐可以通过本领域技术人员已知的常规方法来获得，例如通过将这些与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中接触，或通过与其它盐的阴离子交换或阳离子交换。本发明还包括本发明的化合物的所有这样的盐：由于其低的生理学相容性，而不直接地适合用于药物中，但其可以被例如用作化学反应的中间体或用于制备药学上可接受的盐。

术语“药学上可接受的溶剂合物”表示与药学上可接受的溶剂的加成形式，其含有化学计量的或非化学计量的量的溶剂。一些化合物具有在结晶固态中捕获固定摩尔比的溶剂分子的倾向，由此形成溶剂合物。如果溶剂是水，则形成的溶剂合物是水合物，例如单-或二-水合物。如果溶剂是醇，则形成的溶剂合物是醇合物，例如甲醇合物或乙醇合物。如果溶剂是醚，则形成的溶剂合物是醚合物，例如乙醚合物。

因此，下述项目同样与本发明相一致：

a) 化合物的所有立体异构体或互变异构体，包括其所有比例的混合物，

b) 化合物的前药，或这些前药的立体异构体或互变异构体，

c) 化合物和 (a)和(b)下提及的项目的药学上可接受的盐，

d) 化合物和 (a)、(b)和(c)下提及的项目的药学上可接受的溶剂合物。

应当理解，对上面和下面化合物的所有提及意图包括这些项目，特别是化合物的药学上可接受的溶剂合物，或其药学上可接受的盐的药学上可接受的溶剂合物。

此外，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的化合物、或其立体异构体或互变异构体、或上述各项的药学上可接受的盐，包括其所有比例的混合物，以及药学上可接受的载体。

"药物组合物"表示一种或多种活性成分，以及构成载体的一种或多种惰性成分，以及由任意两种或更多种所述成分的组合、络合或聚集，或一种或多种所述成分的解离，或一种或多种所述成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接地产生的任何产品。相应地，本发明的药物组合物涵盖了通过混合本发明的化合物和药学上可接受的载体制备的任何组合物。

本发明的药物组合物可以额外地包含一种或多种其它化合物作为活性成分，诸如一种或多种额外的本发明的化合物，或其它LPA拮抗剂。

所述药物组合物包括适合于口服、直肠、局部、胃肠外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、眼部(经眼)、肺部(经鼻或口腔吸入)或经鼻给药的组合物，尽管在任何给定的情况下最适合的途径将取决于被的疾病状态的性质和严重程度以及活性成分的性质。它们可以便利地以单位剂型的形式呈现以及通过药物领域公知的任意方法来制备。

在一个实施方案中，所述化合物和药物组合物用于癌症，诸如脑癌、肺癌、结肠癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、直肠癌、食管癌、睾丸癌、妇科癌症、甲状腺癌、黑素瘤、血液恶性肿瘤诸如急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、骨髓细胞白血病、神经胶质瘤、卡波西肉瘤或任意其它类型的实体瘤或液体瘤。优选地，待的癌症选自恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、肠癌和甲状腺癌。

本发明还涉及根据本发明的化合物在制备用于哺乳动物中的与LPA的活动过度相关的增殖或炎性疾病以及由LPA调节的疾病，或由异常增殖介导的病症（诸如癌症）的药物中的用途。

本发明还涉及用于抑制哺乳动物中的异常细胞生长的化合物或药物组合物，所述药物组合物包括一定量的本发明的化合物，以及一定量的其它抗癌剂，其中化合物和其它抗癌剂的量加在一起有效地用于抑制异常细胞生长。许多抗癌剂是目前本领域已知的。在一个实施方案中，抗癌剂是选自下述的化疗剂：有机分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入性的抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物学反应修饰剂、抗激素类、血管生成抑制剂、整联蛋白拮抗剂、诸如西仑吉肽和抗雄激素。在另一个实施方案中，抗癌剂是选自以下的抗体：贝伐单抗、CD40-特异性抗体、chTNT-1/B、地诺单抗、zanolimumab、IGF1R-特异性抗体、林妥珠单抗、依决洛单抗、WX G250、利妥昔单抗、ticilimumab、曲妥单抗和西妥昔单抗。在另一个实施方案中，抗癌剂是蛋白激酶，诸如Akt、Axl、Aurora A、Aurora B、dyrk2、epha2、fgfr3、igf1r、IKK2、JNK3、Vegfr1、Vegfr2、Vegfr3 (也被称为Flt-4)、KDR、MEK、MET、Plk1、RSK1、Src、TrkA、Zap70、cKit、bRaf、EGFR、Jak2、PI3K、NPM-Alk、c-Abl、BTK、FAK、PDGFR、TAK1、LimK、Flt-3、PDK1和Erk的抑制剂。

本发明还涉及一种抑制哺乳动物中的异常细胞生长或过度增殖病症的方法，所述方法包括给哺乳动物施用一定量的本发明的化合物或药物组合物，以及辐射的组合，其中化合物或药物组合物的量与辐射的组合有效地抑制哺乳动物中的异常细胞生长或增殖病症。施用辐射的技术是本领域已知的，并且这些技术可以用于与本文中所述的联合疗法。在该联合疗法中，本发明的化合物或药物组合物的给药可以如本文所述来确定。据信本发明的化合物可以使得异常细胞对采用用于杀死和/或抑制这样的细胞的生长的目的的辐射的更敏感。

相应地，本发明还涉及用于使哺乳动物中的异常细胞对采用辐射的敏感的方法，所述方法包括给哺乳动物施用一定量的本发明的化合物或药物组合物，其量有效地使异常细胞对采用辐射的敏感。在该方法中的化合物的量可以根据用于确定本文中所述的这样的化合物的有效量的手段来确定。

在特定的用途中，根据常规药物配混技术，本发明的化合物可以作为均匀掺合物中的活性成分与药物载体结合。所述载体可以采用各种形式，这取决于期望用于给药的制剂的形式，例如口服或胃肠外(包括静脉内)。在用于口服剂型的组合物的制备中，可以采用任何常规的药物介质，诸如，例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着剂等。在口服液体制剂的情况下，可以采用任何常规的药物介质，诸如，例如，混悬剂、酏剂和溶液剂；或者载体，诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。在口服固体制剂的情况下，所述组合物可以采取以下形式，诸如，例如，粉剂、硬和软胶囊剂和片剂，其中固体口服制剂相对于液体制剂而言是优选的。

因为其给药的容易性，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服单位剂型，在这种情况下明显地采用了固体药物载体。如果需要的话，片剂可以通过标准的水性或非水性技术包衣。这样的组合物和制剂应当含有至少0.1%的活性化合物。活性化合物在这些组合物中的百分比当然可以发生变化，并且便利地为单位重量的约2%至约60%。活性化合物在这样的上有用的组合物中的量使得将会得到有效剂量。活性化合物也可以作为例如液体滴剂或喷雾剂鼻内给药。

片剂、丸剂、胶囊剂等也可以含有粘合剂诸如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；和甜味剂诸如蔗糖、乳糖或糖精。当单位剂型是胶囊剂时，除上述类型的物质之外，其还可以含有液体载体诸如脂肪油。

各种其它物质可以作为包衣存在或用于修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂可以用虫胶、糖或这两者来包衣。糖浆剂或酏剂除活性成分以外还可以含有蔗糖作为甜味剂、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为防腐剂、染料和调味剂诸如樱桃或橙子香料。

本发明的化合物也可以胃肠外地给药。这些活性化合物的溶液或混悬液可以适当地与表面活性剂诸如羟基-丙基纤维素混合而在水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇类及其在油中的混合物中制备。在贮存和使用的常规情况下，这些制剂含有防腐剂来防止微生物的生长。

适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须为无菌的并且必须为流动性的（达到存在容易注射的程度）。其在制造和贮存的条件下必须是稳定的，并且必须被保藏以对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散体介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当的混合物和植物油。

任何适当的给药途径都可以用于给哺乳动物（尤其是人）提供有效剂量的本发明的化合物。例如，可以采用口服、直肠、局部、胃肠外、眼部、肺部、鼻部等。剂型包括片剂、糖锭、分散体、混悬液、溶液、胶囊、乳膏、软膏、气雾剂等。优选地，本发明的化合物口服给药。

所采用的活性成分的有效剂量可以变化，这取决于所采用的特定化合物，给药方式，被的疾病状态和被的疾病状态的严重程度。这样的剂量可以通过本领域技术人员容易地确定。

当或预防本发明的化合物适用的癌症、炎症或其它增殖疾病时，当本发明的化合物以约0.01毫克至约100毫克/千克体重的每日剂量给药，优选作为单一的每日剂量给药时，通常获得令人满意的结果。对于大多数大型哺乳动物而言，总每日剂量为约0.1毫克至约1000毫克，优选约0.2毫克至约50毫克。在70 kg成人的情况下，总每日剂量将通常为约0.2毫克至约200毫克。该剂量方案可以被调整以提供最佳的应答。

本发明也涉及套盒(试剂盒)，其由以下单独的包装组成：

a) 有效量的根据本发明的化合物或其立体异构体或互变异构体、或上述各项的药学上可接受的盐，包括其所有比例的混合物，和

b) 有效量的其它药物活性成分。

所述套盒包括合适的容器，诸如盒子、单独的瓶子、袋子或安瓿。

例如，所述套盒可以包含单独的安瓿，其各自含有有效量的溶解或冻干形式的根据本发明的化合物和有效量的其它药物活性成分。

实验部分

在本申请中可能出现的一些缩写如下所述：

缩写

名称  

ACN 乙腈

ATP 三磷酸腺苷

b 宽峰

d 二重峰

DMSO 二甲亚砜

DTT 二硫苏糖醇

EDTA 乙二胺四乙酸

equiv. 当量

Et 乙基

h 小时

HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HPLC 高压液相谱

LC/MS 与质谱偶联的液相谱

m 多重峰

M 分子离子

m/z 质荷比

Me 甲基

min 分钟

MS 质谱

N 当量(浓度单位)

NMR 核磁共振

PG 保护基团

psi 磅每平方英寸

q 四重峰(或四重峰)

Rf 保留因子

RT 室温

Rt. 保留时间

s 单峰

Tert 三重峰

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

UV 紫外

VIS 可见

DMEM 杜尔伯科改良伊格尔培养基

FCS 胎牛血清

PBS 磷酸盐缓冲盐水

HBBS 汉克氏平衡盐溶液

BSA 牛血清白蛋白

本发明的化合物可以根据下述的方案和实施例的方法使用适当的材料来制备，且进一步通过下述具体实施例来例示。

此外，通过使用本文中所述的方法，以及本领域中的常规技术，可以容易地制备本文中要求保护的额外的本发明的化合物。然而，实施例中例示的化合物不应被理解为是构成本发明所考虑的唯一种类（genus）。实施例进一步详细例示了本发明的化合物的制备。本领域技术人员将会容易地理解，下述制备方法的条件和过程的已知变化可以用于制备这些化合物。

本发明的化合物通常以其药学上可接受的盐（诸如上面所述的那些）的形式分离。对应于分离的盐的胺游离碱可以通过如下来生成：用适当的碱中和（所述碱诸如碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠和氢氧化钾的水溶液），并将释放的胺-游离碱萃取到有机溶剂中，随后蒸发。以这种方式分离的胺-游离碱可以通过如下进一步被转化成另一种药学上可接受的盐：溶解在有机溶剂中，随后加入适当的酸和随后进行蒸发、沉淀或结晶。

通过参考下述实施例中描述的具体实施方案，本发明将得以例示，但不限于此。除非方案中另有指示，否则变量具有与上述相同的含义。

除非另有指明，否则所有起始原料都是从商业供应者那里得到并且未经进一步纯化地使用。除非另有指明，所有温度都是以℃表达并且所有反应都是在室温进行。化合物通过硅胶谱或制备型HPLC来纯化。

本发明还涉及用于制备式(I)化合物的方法，其中通过胺化使式(III)化合物

 (III)，

与式(II)化合物反应

 (II)，

其中R^6'为离去基团且R^6''为H，

或R^6'和R^6''一起形成离去基团，

以产生式(I)化合物。

在胺化反应为亲核取代的情况下，R^6'优选为Hal如Cl或Br。在胺化反应为还原胺化的情况下，R^6'和R^6''一起形成离去基团，其优选为羰基氧。

实施例

下面提供的工作实施例意图例示本发明的特定实施方案，并且不意图以任何方式限制说明书或权力要求书的范围。

化学合成

在该部分中，提供许多式(I)的代表性实施例化合物及其合成中间体的实验细节。

2-[1-(3-甲基-苄基)--2-基]-1H-吲哚 (实施例化合物2)的合成

a. 将2-乙酰基吡啶1 (5.99 g, 40.9 mmol)溶于无水乙醇 (50 mL)，添加苯肼 (8.85 g, 81.8 mmol)并将溶液回流30 min。在冷却至室温后，通过过滤收集获得的沉淀，使用冷乙醇洗涤并在减压下干燥。淡白固体被确定为产率为92.4 % (8.67 g, 37.8 mmol)的化合物2并且不经进一步纯化而使用。

b. 在厚壁烧杯中将腙2 (7.74 g, 36.6 mmol)与多聚磷酸 (43.5 g)混合并在110℃下加热1.5 h。在冷却后，使用10% NaOH碱化混合物并使用二氯甲烷萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并蒸发至干燥。使用己烷:二氯甲烷1:1作为洗脱剂体系通过硅胶上的快速谱纯化剩余物以产生确定为化合物3 (5.31 g, 27.3 mmol, 75%)的无固体。

c. 将化合物3 (5.16 g, 26.6 mmol)溶于无水甲醇 (100 mL)，添加0.2 ml乙酸和10%Pd/C。在50℃下在H₂ (80 atm)下，在高压釜中氢化混合物。在搅拌12 h后，另外添加1g Pd/C和0.2 ml 乙酸并在50℃下在H₂ (80 atm)下将混合物氢化12 h。在冷却后，通过硅藻土过滤反应混合物并在减压下浓缩。通过硅胶上的快速谱(己烷:二氯甲烷1:1)，随后从乙醚中结晶纯化粗产物。获得无固体形式的化合物4 (5.14 g, 25.7 mmol, 96%)。

d. 在室温下，向化合物4 (200 mg, 1.00 mmol)的二氯甲烷 (5 mL)溶液添加3-甲基苯甲醛 (120 mg, 1.00 mmol)并将搅拌持续15 min。在室温下，向该溶液添加三乙酰氧基硼氢化钠 (300 mg, 1.42 mmol)并将搅拌持续12 h。将水加入至反应并使用二氯甲烷萃取水层。在硫酸钠上干燥有机层，过滤并在减压下浓缩。使用二氯甲烷:甲醇作为洗脱剂体系（甲醇梯度为从0%至0.5%）通过快速谱分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物5 (228 mg, 0.75 mmol, 75%)。

替代步骤：在室温下，向化合物4 (100 mg, 0.50 mmol)的乙腈 (5 mL)溶液添加碳酸钾 (69.1 mg, 0.50 mmol)和3-甲基溴苄 (92.5 mg, 0.50 mmol)并将搅拌在80℃下持续15 h。将水和乙酸乙酯加入至反应并分离水层，使用乙酸乙酯萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下浓缩。通过快速谱 (二氯甲烷:甲醇)分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物5 (82.6 mg, 0.24 mmol, 48%)。

根据该步骤，合成下列实施例化合物，如表1所示：1-10、13-25、42-44、54-60、63、65-71、73、82、84-86、107-112、124、125、132、136-139和143。

与步骤d相似，通过使相应的衍生物与1-(4-氟苯基)-乙酮反应制备实施例72化合物。

为了合成实施例化合物75，1-吡啶-2-基-丙烷-1-酮代替2-乙酰基吡啶用于步骤a。根据步骤b-d进行下列步骤。

5-氟-2-[1-(4-氟-苄基)-6-甲基--2-基]-1H-吲哚 (实施例化合物36)的合成

e. 将2-乙酰基-6-甲基吡啶6 (10.0 g, 99%, 73.2 mmol)溶于无水乙醇 (100 mL)，添加4-氟-苯肼 (25.1 g, 95%, 147 mmol)并将溶液回流30 min。在冷却至室温后，通过过滤收集获得的沉淀，使用冷乙醇洗涤。将剩余物再溶于饱和碳酸钠溶液并使用二氯甲烷萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下蒸发至干燥。淡白固体被确定为产率为92.5 % (16.5 g, 67.8 mmol)的化合物7并且不经进一步纯化而使用。

f. 在厚壁烧杯中将腙7 (16.5 g, 67.5 mmol)与多聚磷酸 (42.0 g, 99%, 424 mmol)混合并在110℃下加热1.5 h。在冷却后，使用10% NaOH碱化混合物并使用二氯甲烷萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并蒸发至干燥。使用己烷:二氯甲烷3:2作为洗脱剂体系通过硅胶上的快速谱纯化剩余物以产生确定为化合物8 (5.62 g, 95%, 24.8 mmol, 37%)的无固体。

g. 将化合物8 (1.59 g, 95%, 6.68 mmol)溶于无水甲醇 (25 mL)，添加0.2 ml乙酸和10%Pd/C。在50℃下在H₂ (76 atm)下，在高压釜中氢化混合物12 h。在冷却后，通过硅藻土过滤反应混合物并在减压下浓缩。通过硅胶上的快速谱 (己烷:二氯甲烷1:1)，随后从乙醚中结晶纯化粗产物。获得无固体形式的化合物9 (0.77 g, 3.31 mmol, 50%)。

h. 在室温下，向化合物9 (105 mg, 0.45 mmol)的二氯甲烷(4 mL)溶液添加4-氟苯甲醛 (71 mg, 95%, 0.54 mmol)并将搅拌持续15 min。在室温下，向该溶液添加三乙酰氧基硼氢化钠 (300 mg, 1.42 mmol)并在50℃下将搅拌持续12 h。此外，添加1.2 eq的乙醛和2 eq的NaBH(OAc)₃并将反应混合物在室温下搅拌3 h，然后在50℃下搅拌3天。将水加入至反应并使用二氯甲烷萃取水层。在硫酸钠上干燥有机层，过滤并在减压下浓缩。使用二氯甲烷:甲醇作为洗脱剂体系（甲醇梯度为从0%至0.5%）通过快速谱分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物10 (72 mg, 0.21 mmol, 47%)。

根据该步骤，由2-乙酰基-5-甲基吡啶、2-乙酰基-4-甲基吡啶和2-乙酰基-3-甲基吡啶开始合成下列实施例化合物，如表1所示：实施例26-41、45、46、61、62、64、68、74、76、79-81、83、87。

6-氯-2-[1-(3,4-二甲基-苄基)--2-基]-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶 (实施例化合物128)

i. 将5-氯-2,3-二氨基吡啶 (300 mg, 98%, 2.05 mmol)和1-叔丁氧基羰基-2-甲酸 (540 mg, 2.36 mmol)溶于多聚磷酸 (1.5 mL)并在160℃下搅拌18 h。将混合物倾倒在冰上并使用乙酸乙酯/丁醇萃取两次。使用MgSO₄干燥合并的有机层，过滤并蒸发至干燥。剩余物被确认为化合物11并且不经进一步纯化而使用(462 mg, 1.95 mmol, 95%)。

j. 在室温下，向化合物11 (100 mg, 0.42 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺 (2 mL)溶液添加碳酸钾 (70 mg, 0.51 mmol)和3,4-二甲基氯苄 (95 mg, 70%纯度, 0.43 mmol)并在室温下将搅拌持续15 h。将水和乙酸乙酯加入至反应并分离水层，使用乙酸乙酯萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下浓缩。通过快速谱 (二氯甲烷:甲醇)分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物12 (85.0 mg, 0.24 mmol, 57%)。

k. 将化合物12 (50 mg)溶于乙醇 (5 mL)并使用具有20 μm材料的 5 × 50cm Chiralpak AD-柱的手性HPLC分离为对映异构体，流速为120mL/min，溶剂为正庚烷/乙醇70/30 (参见表1中的实施例140、141)。获得18.1 mg的13a和19,3 mg的13b。

根据该步骤，还使用2,3-二氨基吡嗪合成下列实施例化合物，如表1所示：实施例128、130、133、134、144。

6-氯-5-甲基-2-[1-(3-甲基-苄基)--2-基]-1H-苯并咪唑 (实施例化合物106)的合成

l.   将4-氯-5-甲基苯-1,2-二胺 (2.00 g, 95%, 12.1 mmol)和1-叔丁氧基羰基-2-甲酸 (2.78 g, 12.1 mmol)溶于多聚磷酸 (11.9 g, 121 mmol)并在170℃下搅拌12 h。将混合物倾倒在冰上并使用乙酸乙酯/丁醇萃取两次。使用MgSO₄干燥合并的有机层，过滤并蒸发至干燥。剩余物被确认为化合物14并且不经进一步纯化而使用(2.00 g, 8.01 mmol, 66%)。

m. 在室温下，向化合物14 (350 mg, 1.40 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺 (4 mL)溶液添加碳酸钾 (193 mg, 1.40 mmol)和3-甲基氯苄 (197 mg, 1.40 mmol)并在室温下将搅拌持续15 h。将水和乙酸乙酯加入至反应并分离水层，使用乙酸乙酯萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下浓缩。通过快速谱 (二氯甲烷:甲醇)分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物15 (208 mg, 0.59 mmol, 42%)。

根据步骤k，能将外消旋混合物分离为对映异构体。

根据该步骤，合成下列实施例化合物，如表1所示：实施例47、49、51、88-106、113-123、126-131、135、142。

2-[1-(4-氟-苄基)--2-基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶 (实施例化合物144)的合成

n. 在100℃下的真空干燥箱中将3-碘代2-氨基吡啶 (1.00 g, 99%, 4.54 mmol)、氯化锂 (289 mg, 6.81 mmol)和碳酸钠 (1.93 g, 18.2 mmol)干燥1 h。用氩气充满反应容器并冷却至室温。向混合物添加干燥脱气的N,N-二甲基甲酰胺 (25 mL)、2-乙炔基吡啶 (563 mg, 5.45 mmol)和催化剂Pd(dppf)Cl₂*CH₂Cl₂ (371 mg, 0.54 mmol)并在100℃下将搅拌持续18 h。在冷却至室温后，添加水并使用乙酸乙酯将混合物萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在真空下将溶剂蒸发至干燥。使用梯度为环己烷:乙酸乙酯1:1至100% 乙酸乙酯作为洗脱剂体系通过硅胶上的快速谱纯化剩余物以产生确定为化合物16的无固体 (555 mg, 2.85 mmol, 63%)。

o. 将化合物16 (545 mg, 2.79 mmol)溶于干燥的THF (25 mL)并在5 min内以小份添加氢化钠 (60%于矿物油中, 366 mg, 9.20 mmol, 使用干燥己烷洗涤两次)。在密封容器中将混合物在80℃下搅拌2 d。将混合物倾倒在冰上并使用乙酸乙酯萃取3次。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取物，过滤并蒸发至干燥。使用梯度为环己烷:乙酸乙酯1:1至100% 乙酸乙酯作为洗脱剂体系通过硅胶上的快速谱纯化剩余物以产生被确认为化合物17的无固体 (311 mg, 1.59 mmol, 57%)。

p. 将化合物17 (311 mg, 1.59 mmol)溶于无水甲醇/乙酸 (10 mL, 1:1)并添加10% Pd/C (0.30 g)。在室温下在H₂ (1 atm)下，在高压釜中氢化混合物。在搅拌18 h后，另外添加1g Pd/C并在室温下将混合物氢化另外40 h。在冷却后，通过硅藻土过滤反应混合物并在减压下浓缩。通过硅胶上的快速谱 (二氯甲烷:甲醇)纯化粗产物。获得无固体形式的化合物18 (92.1 mg,  0.46 mmol, 29%)。

q. 在室温下，向化合物18 (46.0 mg, 0.23 mmol)的乙腈 (2.5 mL)溶液添加碳酸钾 (31.6 mg, 0.23 mmol)和4-氟溴苄 (43.5 mg, 0.23 mmol)并在80℃下将搅拌持续15 h。将水和乙酸乙酯加入至反应并分离水层，使用乙酸乙酯萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下浓缩。通过快速谱 (二氯甲烷:甲醇)分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物19 (21.8 mg, 0.07 mmol, 31%)。

2-[1-(3,4-二甲基-苄基)-4-异丙基-哌嗪-2-基]-1H-苯并咪唑 (实施例化合物53)的合成

r. 在室温下，向商购的2-(4-异丙基-哌嗪-2-基)-1H-苯并咪唑 (14.7 mg, 0.06 mmol)的乙腈 (2.5 mL)添加碳酸钾 (9 mg, 0.06 mmol)和3,4-二甲基氯苄 (13.9 mg, 70%, 0.06 mmol)并在室温下将搅拌持续15 h。将水和乙酸乙酯加入至反应并分离水层，使用乙酸乙酯萃取两次。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并在减压下浓缩。通过快速谱 (乙酸乙酯:甲醇)分离纯产物。获得无固体形式的最终化合物20 (7.8 mg, 0.02 mmol, 36%)。

根据该步骤，商购的2-苯并呋喃-2-基-也能与实施例化合物48和50反应，并且2--2-基-苯并噻唑与实施例化合物52反应。

生物活性

1.LPA活性的生物化学酶测定

所述测定检测细胞内钙，其在LPA2受体被其配体LPA活化后由细胞生成。该瞬时钙动员可以使用商业钙检测试剂盒(例如，来自Molecular Devices)来监测。这样的试剂盒的主要组分是一种染料，当存在钙时其发荧光——在向测试孔中加入配体后的瞬时荧光信号是结果。读数器如FLIPR (Molecular Devices)可以用于监测这样的瞬时“Ca-流”信号。

根据峰最大值减去基线，计算所述信号。

为LPA的拮抗剂的化合物导致细胞内钙的动员减少并且因此导致较低的信号。在微量培养板(384孔/板)中进行该测定。

试剂

细胞培养物

细胞系                         U2OS，表达LPA2R的重组体

McCoy氏培养基                 Invitrogen # 26600-021

DMEM                         Gibco #41965

青霉素/链霉素                    Gibco #15140

FCS                             PAA # A15-043

Geniticin                       Invitrogen #10131-027

PBS                             Gibco

HEPES                         Gibco #15630-056

HyQ-Tase                            HyClone #SV30030.01

测定

10 x HBSS                           Gibco #14065

1 M HEPES                         Merck #1.10110

NaCl                                   Merck #1.06404

KCl                              Merck #1.04936

MgSO₄ x 7H₂O                    Merck #1.05886

CaCl₂ x 2H₂O                       Merck #1.02382

D(+)-葡萄糖 x 1H₂O                  Merck #1.04074

BSA，无脂肪酸                  Roche #10 77 58 35 001

配体(LPA)，1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸酯, Avanti #857130P

丙磺舒，水溶性的                     Invitrogen #P36400

检测溶液 (钙染料)                    Bulk 药盒 (Molecular Devices #R8141)

微量培养板384孔黑，透明底 Falcon # 353692

细胞培养/繁殖

培养基                         McCoy氏培养基, 10% FCS, 1mg/ml Geniticin

培养条件                            37℃, 5% CO₂ 在T75烧瓶中

收获                                   用PBS洗涤

用1 mL HyQ-Tase/烧瓶剥离

温育5 min

加入10 mL培养基

离心

用10 mL培养基重新悬浮

LPA2R-钙流测定方案

根据下述程序运行测定：

50 uL      接种细胞(10000个细胞/孔，在DMEM缓冲液中)

在37℃、10% CO₂温育24h

抽吸培养基

50 uL    加入钙染料1x HBSS/HEPES缓冲液

在37℃温育1h (?加载“)

在RT平衡10 min

5 uL       在HEPES缓冲液中加入化合物

在1000 rpm振摇10秒

在RT温育15 min

20 uL      加入LPA (在FLIPR Tetra中)至Krebs-缓冲液/BSA中 &测量

将细胞接种于DMEM缓冲液(DMEM，10% FCS，10 mM HEPES，1% Pen/Strep)中。

在 HBSS/HEPES缓冲液 (100 mL 10x HBSS + 20 mL 1M HEPES + 880 mL 水，pH 7.4)中进行染料加载。

将LPA加入至Krebs/BSA缓冲液 (120 mM NaCl，5 mM KCl，0,62 mM MgSO₄，1,8 mM CaCl₂，10 mM HEPES，6 mM D(+)-葡萄糖，0.2% BSA，pH 7.4)中。

将化合物在HEPES缓冲液 (20 mM, pH 7.4)中预稀释，由此在测定中最终的DMSO含量保持在1%。对化合物进行预稀释以在微量培养板上生成剂量响应系列。剂量响应系列由以下组成：每种化合物从最终30 uM至最终1 nM的10个浓度。从所有化合物孔中得到的信号都以%活性的形式参照对照孔(除了化合物孔外，其也加载到每个板上)。

从这些 %活性值- 以及相应的化合物浓度 -使用标准拟合程序，诸如Graphpad Prism，对每种化合物拟合IC50值。在这里使用方法“log(抑制剂) vs. 响应 – 变斜率”。

读数器设置(FLIPR Tetra)

激发波长：    470_495

发射波长：    515_575

增益(Gain)：         50

Exp.时间：    0,4

Exc.强度：    80

READ(采用TF)

第一读数间隔：           1,00 s

第一读数数量：    240

分配之前的读数：       10

第二读数间隔：    1,00 s

第二读数数量：    0

保存图像：           否。

为了评估化合物对LPA2R的抑制潜力，确定了IC₅₀-值，如下面的表1所示，其中使用了下述分类：

IC₅₀ <  0.5 μM             “++++”

0.5 μM ≤ IC₅₀ ≤ 5 μM          “+++”

5 μM < IC₅₀ ≤ 15 μM           “++”

IC₅₀ > 15 μM            “+”。

表1

（1）HPLC方法(非极性)

溶剂A：水 + 0.1% TFA

溶剂B：乙腈 + 0.08% TFA

流速： 1.5 ml/min

梯度：   0.0 min 20% B

5.0 min 100% B

5.5 min 100% B

6.0 min 20% B

6.5 min 20% B

柱：Chromolith Performance RP18e 100-3

（2）HPLC方法(极性)

溶剂A：水 + 0.05%甲酸

溶剂B：乙腈 + 0.04%甲酸

流速：2,4 ml/min，波长：220 nm

梯度：0.0 min 4% B

2.8 min 100% B

3.3 min 100% B

3.4 min 4% B

柱：Chromolith Speed ROD RP18e 50-4.6 mm

（3）HPLC/MS

溶剂A：水 + 0.1% TFA

溶剂B：乙腈 + 0.1% TFA

流速：2 ml/min，波长：254 nm

梯度：   0 min 5% B

8 min 100% B

8.1 min 10% B

柱：Chromolith Speed ROD RP18e 50-4.6 mm

（4）有意省略实施例编号11、12、43、53、77、78和80。