大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用

1.本发明涉及光动力杀菌技术领域。更具体地说，本发明涉及一种大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用。

背景技术：

2.过去，虽然化学防腐剂和基于加热的传统加工方法保证了食品的保质期和安全性，但也导致了食品内部基质和营养的不理想变化，其中化学消毒剂中的氯就是一种致癌物。基于对更自然和更健康的食品的高要求。应采用新型抗菌技术，有效控制生鲜食品上的食源性微生物，同时保证其营养和品质不被破坏。
3.目前，光动力非热加工技术受到人们的青睐，常被用于果汁、肉制品、蔬菜和水果等食品的保鲜和微生物抑制/杀灭。光动力抗菌技术，光激活光敏剂(ps)和周围的氧分子，产生活性氧(ros)，以氧化应激的形式攻击微生物的细胞膜、核酸、脂质和蛋白质，从而造成微生物不可逆的死亡。ps介导的光活化细菌在光谱抗菌和避免耐药性的产生方面也显示出强大的优势，在食品保鲜中没有发现不良的化学残留物，对热敏性食品和材料的适应性也很强。一般来说，紫外线是常用的对付微生物的手段，高功率的可见光和红外线区域也能对微生物产生破坏作用。发光二极管以光源为主的光动力技术，在光照下能更好地加速微生物的灭活。目前，常用的天然光敏剂有姜黄素，这远远不够现有食品杀菌的需求，故还需探索其他天然光敏剂。

技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用，拓宽了现有的天然光敏剂的选用范围，有利于后续研究天然光敏剂在食品领域杀菌。
5.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种活大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用。
6.优选的是，所述的光动力杀菌为食品的光动力杀菌。
7.优选的是，所述的食品为水果。
8.本发明还提供一种水果光动力杀菌方法，大黄素作为光敏剂，可见光作为光源，两者结合杀菌。
9.优选的是，具体包括如下步骤：
10.s1、浸泡液制备：将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用无菌水或饮用水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为20～30μμ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；
11.s2、水果预处理：将水果置于浸泡液中浸泡5～10min，或，将浸泡液均匀喷在水果表面；经上述处理后晾干得到处理水果，将所述处理水果置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；
12.s3、光照杀菌：在贮藏的第1、3、5天均取出所述的处理水果，并置于可见光下照射
20min。
13.优选的是，采用氙灯发射波长380～800nm的可见光对处理水果进行照射。
14.本发明至少包括以下有益效果：
15.第一、本发明通过绿植物提取的大黄素作为一种天然光敏剂，低成本无污染，具有高效的光动力抗菌性能。联合可见光的大黄素抗菌液既能有效杀灭食源性病菌和避免细菌耐药性的产生，又没有化学残留，有利于保证食品储藏的营养和品质不被破坏。
16.第二、本发明提供了一种新型的天然光敏剂，具有毒性低、副作用小、产量高等优势，可在食品中进行光动力杀菌，扩大了食品杀菌可选的方式。
17.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
18.图1为本发明的不同给药浓度的大黄素溶液对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的灭活效果，其中，concentration表示浓度，e.coli表示大肠埃希菌，s.aureus表示金黄葡萄球菌，survival fraction表示存活分数，emodin(emo)均表示大黄素，dark表示暗处理(不光照)，light表示光照，nacl表示氯化钠；
19.图2为本发明的不同ph值下的大黄素溶液对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的灭活效果，其中，control表示空白对照；
20.图3为本发明的不同光照时间下的大黄素溶液对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的灭活效果；
21.图4为本发明的金黄葡萄球菌实验组的大黄素溶液在可见光照射下产生ros的效果，其中，merge表示明场与荧光合并，dcfda表示二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(荧光)，bright表示明场；
22.图5为本发明的大肠埃希菌实验组的大黄素溶液在可见光照射下产生ros的效果；
23.图6为本发明的大黄素处理的大肠埃希菌和金黄葡萄球菌在可见光以及暗光下的形态的扫描电镜图像；
24.图7为本发明的不同处理条件下鲜切苹果的金黄葡萄球菌数量、琼脂平板照片、鲜切苹果相对重量以及不同贮藏期的视觉图像，其中，log reduction表示对数值的减少，relative weight表示相对重量。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
26.本发明研究浓度、光照时间和ph值对大黄素介导的光动力抗菌作用的影响。选择了分别代表革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的金黄葡萄球菌(s.aureus)和大肠埃希菌(e.coil)作为研究对象。为了更好地模拟自然光下的环境，摆脱了以往的蓝led，而选择了波长380-800nm的可见光区域作为光源，并讨论了天然外源大黄素在可见光照射下对食源性致病菌灭活的影响，初步评价了大黄素与可见光联合应用对鲜切苹果金黄葡萄球菌的灭活保鲜效果。具体如下：
27.1、细菌的培养
28.革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌分别以大肠埃希菌和金黄葡萄球菌为代表。首先，将最初购买的大肠埃希菌和金黄葡萄球菌在37℃的培养箱中复苏24h，然后取4～6颗菌落，转移到4ml营养肉汤中，在37℃的摇床(200r/min)中培养过夜，获得od600为0.8～1.0的最佳菌液。用营养肉汤将细菌悬液稀释到一定的od600值，然后放置(大肠埃希菌：od600＝0.3；金黄葡萄球菌：od600＝0.5)。
29.2、大黄素结合可见光抗菌效果考察
30.2.1、研究大黄素浓度对大黄素介导的光动力抗菌作用的影响
31.在乙醇(99％v/v)中制备大黄素的初始溶液(1mg/ml；2700μm)，并在黑暗中保护。用无菌生理盐水依次稀释至不同给药浓度，得到大黄素溶液。将90μl不同浓度的大黄素溶液与10μl细菌悬液混合，得到混合液，其中，混合液中乙醇的最大浓度小于5％(v/v)。将混合溶液置于37℃孵箱中30min，然后分别置于可见光下照射10min，以不进行光照处理的混合液作为暗对照。将处理过的细菌在0.9％氯化钠中连续稀释，铺在琼脂平板上，37℃培养24h，用标准平板计数法计数菌落数。相似的步骤中，以0.9％氯化钠溶液处理的细菌作为空白对照组(不含大黄素)。结果见图1。其中，采用氙灯发射波长380～800nm的可见光，针对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌，给药浓度见表1。
32.表1针对金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的大黄素的不同给药浓度表(单位：μm)
33.金黄葡萄球菌00.10.250.92.73.6 大肠埃希菌00.10.92.74.56.37.2
34.从图1中可以看出，大黄素和可见光的组合可以有效地灭活细菌，提高大黄素浓度可进一步灭活细菌。
35.2.2、研究ph值对大黄素介导的光动力抗菌作用的影响
36.在乙醇(99％v/v)中制备大黄素的初始溶液(1mg/ml；2700μm)，并在黑暗中保护。配置最终浓度为60mm的柠檬酸缓冲液用以稀释大黄素初始溶液，并通过ph测试仪制备不同ph值(1-6)的大黄素溶液。将90μl的大黄素溶液与10μl细菌悬液混合，得到混合液，其中，混合液中乙醇的最大浓度小于5％(v/v)。将混合溶液置于37℃孵箱中30min，然后分别置于可见光下照射10min，以不进行光照处理的混合液作为暗对照组。将处理过的细菌在0.9％氯化钠溶液中连续稀释，铺在琼脂平板上，37℃培养24h，用标准平板计数法计数菌落数。相似的步骤中，以0.9％氯化钠溶液处理的细菌作为空白对照组(不含大黄素)。具体结果见图2，从图2中可以看出，降低溶液的ph值可以显著提高大黄素在可见光下对大肠埃希菌大肠埃希菌和金黄葡萄球菌的抑菌活性。
37.2.3、研究光照时间对大黄素介导的光动力抗菌作用的影响。
38.在乙醇(99％v/v)中制备大黄素的初始溶液(1mg/ml；2700μm)，并在黑暗中保护。制备大黄素溶液，用无菌生理盐水依次稀释至指定的浓度。将90μl稀释后的大黄素溶液与10μl细菌悬液混合，得到混合液，其中，混合液中乙醇的最大浓度小于5％(v/v)。将混合溶液置于37℃孵箱中30min，然后分别置于可见光下照射5、10、20和30min，以不进行光照处理的混合液作为黑暗对照(0min)。将处理过的细菌在0.9％氯化钠溶液中连续稀释，铺在琼脂平板上，37℃培养24h，用标准平板计数法计数菌落数。具体结果见图3。从图3中可以看出，在可见光照射10分钟和20分钟后，2.7μm的大黄素对大肠埃希菌的杀灭率分别为90％和
99％，0.25μm的大黄素对金黄葡萄球菌的杀灭率也同样接近为90％和99％。
39.2.4、细胞内氧化应激分析
40.利用荧光染探针dcfh-da分析了大肠埃希菌和金黄葡萄球菌对大黄素在可见光下的氧化应激反应。将大肠埃希菌和金黄葡萄球菌的菌液过夜培养，然后用0.9％氯化钠溶液调节至od600＝0.5，得到菌悬液，将2ml菌悬液放入离心机中，以8000r/min的速度离心1min。收集细菌，用pbs洗涤两次，加入200μl的大黄素溶液，37℃孵育30min，可见光照射10min，以不进行光照处理的混合液作为暗对照。处理后的细菌用pbs洗涤，加入20μm的dcfh-da，在37℃黑暗中培养30min，再用pbs洗涤收集细菌，再悬浮在200μl的0.9％氯化钠溶液中。将10μl的菌悬液滴入玻璃底培养皿中，在488nm激发波长的荧光倒置显微镜下观察绿荧光。同样的步骤中，以0.9％氯化钠处理的细菌作为空白对照组(不含大黄素)。具体结果见图4～5，从图4～5中可以看出，大黄素与经可见光处理的大肠埃希菌和金黄葡萄球菌的组合均能在细胞内产生ros，而在黑暗中经大黄素处理的两种细菌均未产生绿荧光，这与空白对照组的细菌一致，表明大黄素仅在可见光激发下诱导细菌细胞产生ros，从而导致细菌细胞膜的损伤。
41.2.5、细菌形态变化观察
42.使用扫描电子显微镜观察细菌表面细菌形态变化的扫描电子显微镜图像。分别将大黄素溶液与大肠埃希菌或金黄葡萄球菌溶液混合(大肠埃希菌中的大黄素溶液最终浓度为7.2μm；金黄葡萄球菌中的大黄素溶液最终浓度为3.6μm)，混合溶液置于37℃孵箱中30min，然后分别置于可见光下照射10min，以不进行光照处理的混合液作为暗对照。处理后的菌液通过离心收集菌体，然后向菌体中加入40倍体积的gluta固定液，然后放置在4℃的冰箱中过夜，以保持细菌的表面形态，得到固定的细菌。固定后的细菌用0.01mol/l的pbs缓冲液洗涤2次，然后用30％、50％、70％、80％和90％乙醇脱水1次，用100％乙醇脱水2次，得到菌体。然后将菌体分散在叔丁醇中，取10μl的悬浮液滴至玻片上。最后，将细菌冷冻干燥，溅射镀金，并放置在扫描电子显微镜下观察。整个实验的离心速度为5000r/min，梯度脱水间隔为15min。同样的步骤中，以0.9％氯化钠处理的细菌作为空白对照组(不含大黄素)。
43.结果见图6，从图6中可以看出，可见光和大黄素的结合导致了大肠埃希菌和金黄葡萄球菌严重的形态缺陷和整体外观的变化，如细胞收缩和扁平现象，以及大量细菌体内裂解的积累。因此，细胞膜的破坏可能是大黄素和光的共同作用导致大肠埃希菌和金黄葡萄球菌失活的机制。
44.3、大黄素与可见光联合应用对鲜切苹果金黄葡萄球菌的保鲜效果
45.选择大小相似、没有外部表面缺陷的苹果，在生理盐水中浸泡10min，然后取出，无菌中剥皮去核，切成16个方块(约10克/块，总约160克)，得到鲜切苹果。将过夜培养的金黄葡萄球菌在无菌盐水中稀释至od600＝0.8。将鲜切苹果放入1l的金黄葡萄球菌溶液中浸泡5min，取出后置于无菌超净台面上自然干燥20min，使金黄葡萄球菌附着在苹果表面。随后，将附着有细菌的苹果在1l的0.9％生理盐水(对照组)或大黄素溶液(20μm)中浸泡5min，然后取出后置于无菌超净台面上自然干燥20min。处理后的苹果转至4℃中储存5天，并依次在储藏中的第1天、第3天和第5天暴露在可见光下20min，苹果的正面和背面各照射10分钟确保均匀，以不进行光照处理的苹果作为暗对照。在每次光照结束后，直接取苹果(约20g)转移至注射器中挤出苹果汁(约4ml)，并从中取30μl的苹果汁涂抹在琼脂平板上，
37℃孵育24h后计数菌落总数，同时记录不同实验组(0.9％氯化钠黑暗中处理、大黄素黑暗中处理、0.9％氯化钠光照中处理和大黄素光照中处理)在贮藏过程中的重量变化和外观。实验结果见图7，从图7中可以看出，大黄素的光动力抗菌活性可以有效降低鲜切苹果贮藏过程中金黄葡萄球菌的含量。此外，不同处理条件的苹果在贮藏五天后不会影响苹果的重量和视觉质量。
46.《实施例1》
47.本发明提供一种水果的光动力杀菌方法，具体包括如下步骤：
48.s1、浸泡液制备：将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用无菌水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为25μμ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；所述食品用乙醇可以是食品添加剂乙醇或食用酒精等；
49.s2、苹果预处理：将苹果置于浸泡液中浸泡5min后晾干(置于常温下风干)，得到处理苹果，将处理苹果置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；
50.s3、光照杀菌：在贮藏的第1、3、5天均取出处理苹果，置于可见光下照射20min(正面背面均照射10min)，然后放入保鲜盒中，继续置于4℃贮藏；其中，采用氙灯发射波长380～800nm的可见光对处理水果进行照射。
51.贮藏30天后，取出苹果，按照gb 4789.2-2016检测苹果表皮的菌落总数，同时测量失重率，菌落总数显示小于30cfu/g，失重率为6.15
±
0.98％。
52.《实施例2》
53.本发明提供一种水果的光动力杀菌方法，具体包括如下步骤：
54.s1、浸泡液制备：将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用饮用水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为30μμ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；所述食品用乙醇可以是食品添加剂乙醇或食用酒精等；
55.s2、梨子预处理：将水果置于浸泡液中浸泡10min后晾干(置于常温下风干)，得到处理梨子，将处理梨子置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；
56.s3、光照杀菌：在贮藏的第1、3、5天均取出处理梨子，置于可见光下照射20min(正面背面均照射10min)，然后放入保鲜盒中，继续置于4℃贮藏；其中，采用氙灯发射波长380～800nm的可见光对处理水果进行照射。
57.贮藏30天后，取出梨子，按照gb 4789.2-2016检测梨子表皮菌落总数，同时测量失重率，菌落总数显示小于30cfu/g，失重率为5.45
±
1.05％。
58.《实施例3》
59.本发明提供一种水果的光动力杀菌方法，具体包括如下步骤：
60.s1、浸泡液制备：将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用饮用水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为20μμ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；所述食品用乙醇可以是食品添加剂乙醇或食用酒精等；
61.s2、李子预处理：将所述浸泡液装入喷壶，然后将浸泡液均匀喷在水果表面后晾干(置于常温下风干)，得到处理李子，将处理李子置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；其中，向李子表面喷浸泡液时，分多次均匀的喷涂在李子表面；
62.s3、光照杀菌：在贮藏的第1、3、5天均取出处理李子，置于可见光下照射20min(正面背面均照射10min)，然后放入保鲜盒中，继续置于4℃贮藏；其中，采用氙灯发射波长380
～800nm的可见光对处理水果进行照射。
63.贮藏14天后，取出李子，按照gb 4789.2-2016检测李子表皮菌落总数，同时测量失重率，菌落总数显示小于30cfu/g，失重率为6.26
±
1.14％。
64.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

技术特征：

1.大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用。2.如权利要求1所述的大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用，其特征在于，所述的光动力杀菌为食品的光动力杀菌。3.如权利要求2所述的大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用，其特征在于，所述的食品为水果。4.水果光动力杀菌方法，其特征在于，大黄素作为光敏剂，可见光作为光源，两者结合杀菌。5.如权利要求4所述的水果光动力杀菌方法，其特征在于，具体包括如下步骤：s1、浸泡液制备：将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用无菌水或饮用水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为20～30μμ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；s2、水果预处理：将水果置于浸泡液中浸泡5～10min，或，将浸泡液均匀喷在水果表面；经上述处理后晾干得到处理水果，将所述处理水果置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；s3、光照杀菌：在贮藏的第1、3、5天均取出所述的处理水果，并置于可见光下照射20min。6.如权利要求5所述的水果光动力杀菌方法，其特征在于，采用氙灯发射波长380～800nm的可见光对处理水果进行照射。

技术总结

本发明公开了一种大黄素作为光敏剂在光动力杀菌中的应用，且公开了一种水果光动力杀菌方法，包括：S1、将大黄素与食品用乙醇混合均匀以溶解大黄素，得混合液，然后利用无菌水或饮用水将所述混合液稀释至大黄素的物质的量浓度为20～30μΜ，得浸泡液，其中浸泡液中乙醇的质量分数不高于5％；S2、将水果置于浸泡液中浸泡5～10min，或，将浸泡液均匀喷在水果表面；经上述处理后晾干得到处理水果，将所述处理水果置于保鲜盒中，置于4℃贮藏；S3、在贮藏的第1、3、5天均取出所述的处理水果，并置于可见光下照射20min。本发明拓宽了现有的天然光敏剂的选用范围，有利于后续研究天然光敏剂在食品领域杀菌。食品领域杀菌。食品领域杀菌。