抗聚糖抗体及其用途的制作方法

抗聚糖抗体及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月17日提交的美国临时申请62/990,927、2020年6月10日提交的美国临时申请63/037,374和2020年9月4日提交的美国临时申请63/074,956的权益，这些美国临时申请中的每一个据此以引用方式全文并入。
技术领域
3.本发明涉及包括抗唾液酸路易斯a(slea)和抗唾液酸路易斯c(slec)抗体在内的抗唾液酸化聚糖抗体，以及其使用方法。
4.关于ascii文本文件的序列表的提交
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背景技术：

6.聚糖是基于碳水化合物的聚合物，该聚合物可以是游离的或附着于蛋白质(糖蛋白)或脂质(糖脂)。已知糖蛋白的聚糖参与免疫和炎症，包括糖蛋白上的唾液酸化聚糖。slea已被描述在人胰腺、结肠和胃细胞系以及结肠、胃和胰腺的腺癌中高表达。另外，研究表明，在溃疡性结肠炎患者的人结肠的发炎区域，slea上调与cd44v6一致。另外，研究已证明slea在粘膜炎症中具有功能作用，这表明调节slea可影响包括炎性肠病(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)的疾病。
7.异常糖基化也被描述为癌症的标志之一并且调节免疫应答。与在炎性肠病组织上观察到的相似，蛋白质的异常糖基化导致在恶性转化过程中肿瘤相关的碳水化合物抗原的过表达。研究已证明，肿瘤相关的碳水化合物抗原对癌症发展和进展的包括增殖、侵袭、血管生成和转移在内的各个方面都有贡献(fuster,nat rev cancer,5:526-42(2005)和dube,nat rev drug discovery,4:477-88(2005))。
8.一种类型的糖基化是唾液酸，并且它们通常被发现是n-聚糖、o-聚糖和鞘糖脂的终端分支。在唾液酸内，通过九碳主链之间的α连键产生多种多样性并且通过这些碳位置处的修饰产生二级多样性。发现的唾液酸化糖基化的实例包括slea、slec和唾液酸路易斯x(每种的聚糖结构见表1)。
9.这些聚糖都是末端唾液酸化聚糖的实例。虽然slec是slea的非岩藻糖基化前体，但slex是slea的立体异构体。一般来说，slec通常不在正常人组织上被发现，而在鼠组织上被发现。因此，结合至slea和slec两者的抗体可用于药物开发，特别是用于体内鼠疾病模型的药物开发。
10.一般来说，适于开发作为疾病和/或病症的药剂的抗体具有高特异性、选择性和亲和力。因此，抗聚糖抗体通常不适于开发作为药剂，部分是由于碳水化合物抗原具有有限的免疫原性，并且观察到的抗碳水化合物抗体的亲和力通常比对蛋白质或肽抗原有特异
性的抗体低10
3-105倍(ghassemi,glycobiology,25(9):920-952(sept 2015))。碳水化合物的总体低结合通常伴随着相对较快的k
缔合
(k
on
)和k
解离
(k
off
)速率，这导致抗聚糖抗体的kd整体较低。
11.本发明解决了对针对患有影响消化系统的病症(包括炎性肠病和消化系统癌症)的患者的聚糖表位的替代抗体疗法的需要。

技术实现要素：

12.本发明提供了抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含结合至碳水化合物抗原或其片段的可变区。
13.在一个方面，本文提供了一种结合至唾液酸路易斯a(slea)和唾液酸路易斯c(slec)的抗体或其抗原结合部分，其中此种抗体或抗原结合部分对slea的结合亲和力的kd为60μm或更小，并且对slec的结合亲和力的kd为100μm或更小。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合部分不结合至唾液酸路易斯x(slex)。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合部分是人源化抗体或人源化抗原结合部分。
14.在另一方面，本文提供了结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3具有90％-100％序列同一性的序列，并且该轻链可变区包含与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7具有90％-100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合部分不结合至slex。在一些实施方案中，该重链可变区包含含有seq id no:12的序列的cdr-h1、含有seq id no:13的序列的cdr-h2和含有seq id no:14的序列的cdr-h3；并且该轻链可变区包含含有选自由seq id no:15-17组成的组的序列的cdr-l1、含有seq id no:18的序列的cdr-l2和含有seq id no:19的序列的cdr-l3。在一些实施方案中，该重链可变区包含seq id no:3的序列，并且该轻链可变区包含选自由seq id no:5-8组成的组的序列。在一些实施方案中，该重链可变区包含seq id no:3的序列，并且该轻链可变区包含seq id no:8的序列。在一些实施方案中，该重链可变区包含seq id no:4的序列，并且该轻链可变区包含seq id no:9或10的序列。
15.在另一方面，本文提供了一种结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其中该重链可变区包含与seq id no:3具有90％-100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合部分包含轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自由seq id no:5-11组成的组的序列具有90％-100％序列同一性的序列。
16.在另一方面，本文提供了一种结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含含有seq id no:12的序列的cdr-h1、含有seq id no:13的序列的cdr-h2和含有seq id no:14的序列的cdr-h3；并且其中该轻链可变区包含含有选自由seq id no:15-17组成的组的序列的cdr-l1、含有seq id no:18的序列的cdr-l2和含有seq id no:19的序列的cdr-l3。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合部分包含表6中所示的单一抗体的重链可变区和轻链可变区。
17.在另一方面，本文提供了一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码根据以上实施方案中任一个实施方案的抗体或其抗原结合部分。在另一方面，本文提供了一种
载体，该载体包含根据以上实施方案中任一个实施方案的一种或多种多核苷酸。在另一方面，本文提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据以上实施方案中任一个实施方案的一种或多种多核苷酸或根据以上实施方案中任一个实施方案的载体。在另一方面，本文提供了一种产生抗体的方法，该方法包括培养根据以上实施方案中任一个实施方案的宿主细胞以使得产生抗体。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞回收抗体。在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据以上实施方案中任一个实施方案的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
18.在另一方面，本文提供了一种或改善消化疾病或病症的症状的方法，其中所述方法包括向患有所述消化疾病或病症的个体施用有效量的本文所述的抗体、抗原结合部分或药物组合物。在一些实施方案中，该消化疾病或病症选自炎性肠病、肠易激综合征、胰腺癌或结肠癌。在一些实施方案中，该消化疾病或病症是炎性肠病。在一些实施方案中，该炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，该个体是人。
附图说明
19.图1a是在用人igg对照或抗体克隆4772后0和24小时时使用t84细胞的体外划痕伤口测定的显微图像。图1b例示了在24小时后观察到的伤口愈合活性的差异。
20.图2a是急性dss诱导的结肠炎模型的方案的示意图。图2b例示了原始(未被，无dss)、pbs(在第1天和第3天给药，dss)、人igg(在第1天和第3天给药，dss)和抗体克隆4772(在第1天和第3天给药，dss)的小鼠第10天的粪便稠度。图2c例示了以初始体重的百分比表示的原始(未，无dss)、pbs(在第1天和第3天，dss)、人igg(在第1天和第3天，dss)和抗体克隆4772(在第1天和第3天给药，dss)的小鼠的体重变化。图2d例示了根据原始的小鼠(未，无dss)、pbs的小鼠(在第1天和第3天给药，dss)、人igg的小鼠(在第1天和第3天给药，dss)和抗体克隆4772的小鼠(在第1天和第3天给药，dss)的终末处死后的小鼠肠组织的组织学的炎症严重程度。图2e例示了在原始的小鼠(未，无dss)、pbs的小鼠(在第1天和第3天给药，dss)和4772的小鼠(在第1天和第3天给药，dss)的终末处死后存在于小鼠组织的远端结肠切片中的多形核细胞(pmn)百分比。
具体实施方式
21.如本文所用，冠词“一个/种”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法对象。例如，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
22.术语“抗体”旨在涵盖衍生自本发明抗体的抗体、其片段、特定部分和变体，包括单链抗体及其片段。抗体包括抗体片段、抗体变体、单克隆抗体、多克隆抗体和重组抗体。抗体可以在小鼠、大鼠、兔子或人中产生。
23.抗体可以是全长抗体或者可以包括该抗体的具有抗原部分的(一个或多个)片段(包括但不限于fab、fab'和f(ab')2、facb、pfc1、fd、dab片段)、分离的cdr、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的双特异性抗体和多特异性抗体。
24.在一些实施方案中，抗体包含抗体的恒定区的全部或一部分。恒定区是选自iga(例如，iga1或iga2)、igd、ige、igg(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)、igm的同种型。如本文所
用，抗体的“恒定区”包括天然恒定区、同种异型或天然变体，诸如人igg1中的d356e和l358m或a431g。参见例如jefferies和lefranc,mabs,1(4):332-338(2009年7月-8月)。
25.如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域可获得的或已知的任何手段衍生自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)。本发明的单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，该技术包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。
26.如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(诸如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。
27.非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的框架区。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的。
28.如本文所用，“有效量”是指足以减轻消化系统疾病(包括炎性肠病或消化系统癌症)的症状和体征的抗体或药物组合物的剂量。炎性肠病的此类症状包括腹泻、体重减轻、血性腹泻、血便、疼痛、贫血、疲劳、直肠出血和腹部绞痛。消化系统癌症的症状包括体重减轻、疼痛和可检测到的肿块(临床上为可触及的肿块或放射学上或通过其他成像技术可检测到的肿块)。术语“有效量”和“有效量”可互换使用。在一些实施方案中，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合来实现。因此，可以在施用一种或多种化学剂或其他有效剂的情形下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他剂联合，可实现或实现了合乎需要的结果，那么单一剂可被视为以有效量被给予。虽然个体需要不同，但确定每种组分的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。典型的剂量包括0.1至100mg/kg/体重。优选的剂量包括1至100mg/kg/体重。最优选的剂量包括10至100mg/kg/体重。
29.术语“受试者”或“个体”可以指患有消化系统疾病的脊椎动物，诸如患有炎性肠病或消化系统癌症的脊椎动物。受试者包括所有温血动物，诸如哺乳动物，诸如啮齿动物，优选灵长类动物或非人类灵长类动物，更优选人。术语受试者包括家养动物(诸如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如小鼠、兔子、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。因此，本文考虑了兽医用途和医药或药物制剂。
30.本领域技术人员将认识到抗体本质上是“模块化的(modular)”。在整个公开内容中，描述了构成本发明的抗体的各种“模块”的各种具体实施方案。作为具体的非限制性实例，描述了可变重链cdr、可变重链、可变轻链cdr和可变轻链的各种实施方案。意图所有的特定实施方案可以彼此组合，如同每个特定组合被单独地明确描述一样。
31.本发明的人源化抗体可以包含下表1的重链可变区并且另外可以包含来自下表2的轻链可变区。可以使用本领域熟知的方法将此类可变区掺入到人igg1主链中。
32.[0033][0034]
在其他实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含选自下表3和表4的重链和轻链cdr序列：
[0035][0036]
本发明包括特异性地结合至slea和slec但不结合至唾液酸路易斯x(slex)的抗体和片段、包含抗体的组合物、编码抗slea/slec但不抗slex抗体的多核苷酸、编码此类抗体的多核苷酸、可用于制备此类抗体和结合片段的方法和组合物，以及使用它们的各种方法。
slea、slec和slex的聚糖结构示于下表5中。
[0037]
表5.唾液酸路易斯a、唾液酸路易斯c和唾液酸路易斯x的聚糖结构
[0038]
聚糖名称聚糖结构唾液酸路易斯a(slea)neuacα2,3galβ1,3[fucα1,4]glcnac唾液酸路易斯c(slec)neuacα2,3galβ1,3glcnac唾液酸路易斯x(slex)neuacα2,3galβ1,4[fucα1,3]glcnac
[0039]
抗碳水化合物/聚糖的抗体可能由于其通常较低的结合亲和力而不适合于药物开发。确定抗体的结合亲和力的方法是本领域已知的。一般来说，对特定靶标或底物的结合亲和力由用于产生平衡解离常数(kd)的缔合速率(on rate)(ka(m-1
s-1
))和解离速率(off rate)(kd(s-1
))之间的关系确定。kd越低，亲和力越高。用于确定抗体的亲和力的方法的实例包括利用octet系统(fort
é
bio)或biacore系统(ge healthcare)或确定缔合常数和解离常数的其他系统仪器的测定。因此，本发明包括具有对slea的kd为约500μm或更小的结合亲和力以及对slec的kd为约500μm或更小的结合亲和力并且不具有与slex结合的抗体。在非限制性实例中，本发明的抗体包含对slea的kd为100μm或更小、90μm或更小、80μm或更小、70μm或更小、60μm或更小、50μm或更小、40μm或更小、30μm或更小、20μm或更小、10μm或更小、1μm或更小或0.1μm或更小的结合亲和力，以及对slec的kd为100μm或更小、90μm或更小、80μm或更小、70μm或更小、60μm或更小、50μm或更小、40μm或更小、30μm或更小、20μm或更小、10μm或更小、1μm或更小或0.1μm或更小的结合亲和力，并且不包含与slex的结合。在一个实施方案中，可用于本发明的抗体对它们的聚糖靶标具有对slea的kd为41μm或更小、对slec的kd为70μm或更小的结合亲和力，并且不具有与唾液酸路易斯x(slex)的结合。在一些实施方案中，如果本公开的抗体对特定靶标(例如，slex)的结合亲和力的kd为约1mm或更高，则该抗体不结合至该靶标。
[0040]
本发明的抗体也可用于辅助个体的疾病诊断(诸如癌症诊断)的方法中。此类癌症包括消化系统的癌症，诸如胰腺癌或结肠癌。此类方法包括使用本发明的抗体来确定个体或个体特定组织中slea和/或slec结合的水平。如本文所用，用于“辅助诊断”的方法意指这些方法有助于作出关于分类或性质或癌症的临床确定，并且对于最终诊断可能是或可能不是结论性的。因此，辅助癌症诊断的方法可以包括检测来自个体的生物样品中slea和/或slec的水平以及/或者确定样品中slea和/或slec的水平的步骤。识别表位或其一部分的抗体也可被用于创建用于检测体液中释放的抗原决定簇的诊断免疫测定，该体液包括但不限于血液、唾液、尿液、肺液或腹水。类似地，此类使用本发明抗体的免疫测定可被用于监测和/或疾病缓解的功效。在此类情况下，对本发明的抗体有反应性的抗原决定簇的存在和/或水平可用作用于监测疾病活性和/或进展的生物标志物。
[0041]
在一些实施方案中，本公开的抗体还可被用于检测个体或个体的特定组织中slea和/或slec的存在以及/或者测量个体或个体的特定组织中slea和/或slec的水平的方法中。
[0042]
本公开的某些方面涉及编码本公开的抗体的多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)和/或载体(例如，表达载体)，以及包含该多核苷酸或载体的宿主细胞(例如，分离的宿主细胞)。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核宿主细胞，诸如细菌宿主细胞(例如大肠杆菌(e.coli))。合适的原核宿主细胞包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物
体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(escherichia)(例如大肠埃希氏菌)、肠杆菌属(enterobacter)、欧文氏菌属(erwinia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙门氏菌属(salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(serratia)(例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans))和志贺氏菌属(shigella)等。在一些实施方案中，宿主细胞是真核宿主细胞，诸如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞。例如，丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(common baker's yeast)是低等真核宿主微生物中最常用的。适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。脊椎动物或哺乳动物细胞的实例包括例如由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)；人胚胎肾系(亚克隆用于以悬浮培养生长的293或293细胞，graham等人,j.gen virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)(tm4,mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；水牛大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；人肝癌细胞系(hep g2)；中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如ns0和sp2/0。
[0043]
本公开的其他方面涉及使用本公开的宿主细胞的生产方法。可以使用重组方法产生抗体或其抗原结合部分。对于抗体或抗原结合部分的重组产生，分离出编码该抗体/部分的核酸并且将其插入到载体中以用于进一步克隆(dna的扩增)或用于表达。编码该抗体的dna可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合编码该抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0044]
本发明的抗体可被用于患有消化系统疾病或病症的个体的目的。此类疾病包括但不限于炎性肠病(例如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肠易激综合征和消化系统癌症(包括胰腺癌和结肠癌)。
[0045]
在一些实施方案中，本发明的抗体可以被单独地用于或改善一种或多种疾病症状。在其他实施方案中，本发明的抗体可以与其他剂或药剂组合使用以或改善一种或多种疾病症状。
[0046]
本发明的抗体或其片段的各种制剂可被用于施用。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以以纯的形式施用。除了药理学活性剂之外，本发明的组合物还可以含有合适的药学上可接受的载体，该载体包括本领域熟知的赋形剂和助剂，该赋形剂和助剂是使药理学有效物质容易施用或者使活性化合物容易加工成可以在药学上用于递送至作用部位的制品的相对惰性的物质。例如，赋形剂可以赋予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、包封剂、缓冲剂和皮肤渗透促进剂。
[0047]
适于肠胃外施用的制剂包括呈水溶性形式(例如水溶性盐)的活性化合物的水溶
液。此外，可以施用作为适当的油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，该物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体也可被用于包封用于递送到细胞中的剂。
[0048]
根据本发明的用于全身施用的药物制剂可以被配制用于肠内、肠胃外或局部施用。实际上，所有三种类型的制剂都可以同时使用以实现活性成分的全身施用。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂在remington,the science and practice of pharmacy,第20版,mack publishing(2000)中进行了阐述。
[0049]
适于口服施用的制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂，以及它们的控释形式。
[0050]
一般来说，这些剂被配制用于通过注射(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)施用，但是也可以使用其他施用形式(例如，口服、粘膜等)。因此，本发明的抗体优选与药学上可接受的媒介物诸如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液等组合。
[0051]
具体的给药方案，即剂量、时间和重复，将取决于具体的个体和个体的病史。通常，施用至少约0.1mg/kg体重，或更优选至少约1mg/kg体重，或至少约5mg/kg体重，甚至更优选至少约10mg/kg体重或至少约20mg/kg体重的剂量。
[0052]
在一些实施方案中，将在过程中施用一剂或多剂本发明的抗体或其片段。经验上的考虑，诸如半衰期，通常有助于确定剂量。与人免疫系统相容的抗体，诸如人源化抗体或全人抗体可被用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用频率可以在疗法过程中确定和调整，并且可以基于疾病的一种或多种临床症状的减轻。替代地，本发明抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
[0053]
提供以下实施例是为了说明本发明而不是限制本发明。
[0054]
实施例
[0055]
实施例1.人源化抗体克隆的产生
[0056]
合成具有包含来自上表1的重链可变区之一的重链可变区和包含来自上表2的轻链可变区之一的轻链可变区的人源化抗体并将其掺入到igg1主链中。合成的被掺入到igg1主链中的重链可变区和轻链可变区对是下表6中的那些。
[0057][0058]
通过将质粒转染到哺乳动物细胞中来产生具有以上重链可变区和轻链可变区对的组合的人源化抗体，并使用亲和谱法对该人源化抗体进行纯化。
[0059]
在表6中的九种人源化抗体克隆中，有两种抗体克隆(4764和4767)表现出弱表达，导致纯化后抗体少于1mg。这两种克隆的生产水平被认为对于实际生产细胞系优化而言太低。然后筛选剩余的七种克隆对slea、slec和slex的结合亲和力。
[0060]
实施例2.对唾液酸路易斯a(slea)和唾液酸路易斯c(slec)的结合亲和力
[0061]
使用利用cm7传感器芯片的biocore t100 spr生物传感器利用pbs-p(0.005％tween-20)运行缓冲液在25摄氏度下对来自实施例1的人源化抗体与slea和slec的结合亲和力进行体外评估。在nhs/edc活化的表面上，将抗体在10mm醋酸钠ph 5.0中以50ug/ml偶联至～30,000ru。参考表面被活化并被封闭以用作对照。将碳水化合物样品(slea、slec和唾液酸路易斯x(均来自dextra labs))溶解在pbs-p运行缓冲液中，直至储备浓度为10mm。然后将每种溶液制备成2倍稀释系列，直至300μm，并在抗体表面上测试每种浓度系列。通过减去来自参考表面和缓冲液注入的信号来处理响应数据。在25摄氏度下测定结合常数。
[0062]
我们使用上述方法测试了brazil,j immunol 191:4804-4817(2013)中描述的鼠抗体(gm35)对slea、slec和slex的结合亲和力。该抗体的结果未显示出与slex的结合，显示出的对slea的kd为41.5μm至46.8μm，并且对slec的kd为68.8μm至78.2μm。比较而言，另一种测试的抗体是ns19-9(dako,carpenteria,ca)(其是一种已知结合至slea而不表现出与slex的结合的抗体)，该抗体对slea的kd为39.5μm，并且对slec的kd为1.5mm。
[0063]
实施例3.人源化抗体克隆对唾液酸路易斯a(slea)和唾液酸路易斯c(slec)的结合亲和力
[0064]
测试了来自实施例1的人源化抗体克隆中的七种人源化抗体克隆对slea、slec和slea的结合亲和力。使用的方法类似于上面实施例2中描述的方法，不同之处在于slex仅在300μm的一种浓度下使用。该七种人源化抗体克隆中每一种人源化抗体克隆对slea和slec的平均结合kd示于下表7中。
[0065][0066]
在300μm碳水化合物浓度的三个独立运行中，以上抗体克隆均未显示出与slex的结合。根据上述结合亲和力数据，具有hvch3可变区的人源化抗体克隆对slea和slec的亲和力最高。
[0067]
实施例4.体外伤口愈合活性
[0068]
在体外划痕伤口试验中测试了人源化抗体的伤口愈合作用机制。人结肠上皮细胞t84(ccl-248,atcc,manassas,virginia)在6孔板中生长至汇合。使用移液管尖端在每种条件下制作划痕伤口，并用10ug/ml人igg(higg)对照(sigma-aldrich)或10ug/ml上面实施例3的人源化抗体处理细胞。在处理后24小时后通过目视检查以及基于imagej的图像分析测量划痕伤口的尺寸来测量伤口愈合活性。与higg对照相比，人源化抗体表现出更大的伤口愈合活性。作为非限制性实例，实施例3的人源化抗体克隆之一，克隆4772的伤口愈合活性示于图1a至图1b中。图1a和图1b中所见的伤口愈合活性的增加表明包括抗体克隆4772在内的实施例3的人源化抗体可有效包括炎性肠病在内的消化系统病症。
[0069]
实施例5.在dss诱导的结肠炎的急性模型中的体内功效
[0070]
在葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的结肠炎的体内小鼠急性模型中测试了抗体克隆4772的功效。在研究第-1天，根据体重将所有动物随机分组。体重在18-22g之间的动物将被录入研究。从研究第0天开始，被录入研究中但不属于“原始”组的所有10周龄雄性c57bl/6小鼠自由接受溶解在无菌水中的2.5％葡聚糖硫酸钠(dss)7天。在研究的第3天更新dss水。在所有测量完成后的研究第7天，所有动物都被换成仅供饮用的水。“原始”组的小鼠仅自由接受酸化水，未接受试验制品。
[0071]
在两个分开的日子里经由腹膜内(ip)注射给接受抗体克隆4772或人igg的动物注射适当的药物，该注射在研究的第1天和第3天以10mg/kg体重(4772)或25mg/kg体重(人igg)进行。被指定接受pbs的组中的小鼠在第1天和第3天接受pbs ip注射。
[0072]
从研究第-1天开始每天测量体重，并在第0、2、4、6、8、9、10和13天执行粪便稠度评分。该研究的结果示于图2a至图2e中。图2a示出了研究方法的示意图。图2b例示了在第10天测量的粪便稠度的结果。如图所示，与pbs和higg对照相比，接受抗体克隆4772的小鼠具有更好的粪便稠度(在y轴上较低)。类似地，在图2b中，与pbs和higg对照相比，用抗体克隆4772处理的小鼠体重减轻较少。粪便稠度和体重减轻是指示包括炎性肠病在内的消化系统疾病的症状的两个因素。这些数据表明包括抗体克隆4772在内的实施例3的人源化抗体可有效包括炎性肠病在内的消化系统病症。
[0073]
对终末处死后收集的肠组织样品的炎症(坏死、糜烂、增生)严重程度、多形核嗜中性粒细胞(pmn)浸润百分比和在结肠组织中观察到的水肿进行评分。如图2d所示，与pbs和higg对照相比，接受抗体克隆4772的小鼠表现出较少的炎症迹象。另外，与用pbs处理的小鼠相比，接受抗体克隆4772的小鼠的远端结肠中的pmn浸润减少了超过50％(图2e)。这些数据表明包括抗体克隆4772在内的实施例3的人源化抗体可减少dss诱导的创伤后肠组织的炎症，并且可有效包括炎性肠病在内的消化系统病症。
[0074]
序列表
[0075]
seq id no:1；hvch1的氨基酸序列
[0076]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstnamswvrqapgkglewvsrlrpksdnyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgtgfwgqgttvtvss
[0077]
seq id no：2；hvch2的氨基酸序列
[0078]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstnamswvrqapgkglewvarlrpksdnyatyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvtgtgfwgqgttltvss
[0079]
seq id no：3；hvch3的氨基酸序列
[0080]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstnamswvrqapgkglewvarlrpksdnyatyyadsvkgrftisrddskntlylqmnslraedtavyycvtgtgfwgqgttltvss
[0081]
seq id no：4；hvch4的氨基酸序列
[0082]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfstnamswvrqapgkglewvarlrpksdnyatyyadsvkgrftisrddststlylqmnslraedtavyycvtgtgfwgqgttltvss
[0083]
seq id no:5；lich1的氨基酸序列
[0084]
divmtqspdslavslgeratinckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndytspytfgqgtkleik
[0085]
seq id no：6；lich2的氨基酸序列
[0086]
divmtqspdslavslgervtmnckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltissvqaedvavyycqndytspytfgqgtkleik
[0087]
seq id no：7；lich3的氨基酸序列
[0088]
divmtqspdslavslgeratinckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppkllfywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndytspytfgqgtkleik
[0089]
seq id no:8；lich4的氨基酸序列
[0090]
divmtqspdslavslgervtmnckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppkllfywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltissvqaedvavyycqndytspytfgqgtkleik
[0091]
seq id no：9；lich5的氨基酸序列
[0092]
divmtqspdslavslgervtmnckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppkllfywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndytspytfgqgtkleik
[0093]
seq id no：10；lich6的氨基酸序列
[0094]
divmtqspdslavslgervtmnckssqsllqsgnqknyltwyqqkpgqppkllfywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndytspytfgqgtkleik
[0095]
seq id no：11；lich7的氨基酸序列
[0096]
divmtqspdslavslgervtmnckssqsllssgnqknyltwyqqkpgqppkllfywtstresgvpdrfs
gsgsgtdftltissvqaedlavyycqndytspytfgqgtkleik
[0097]
seq id no:12；重链cdr-1的氨基酸序列
[0098]
gftfstnams
[0099]
seq id no：13；重链cdr-2的氨基酸序列
[0100]
rlrpksdnyaty
[0101]
seq id no：14；重链cdr-3的氨基酸序列
[0102]
vtgtgf
[0103]
seq id no:15；轻链cdr-1的氨基酸序列
[0104]
kssqsllnsgnqknylt
[0105]
seq id no：16；轻链cdr-1b的氨基酸序列
[0106]
kssqsllqsgnqknylt
[0107]
seq id no：17；轻链cdr-1c的氨基酸序列
[0108]
kssqsllssgnqknylt
[0109]
seq id no：18；轻链cdr-2的氨基酸序列
[0110]
wtstres
[0111]
seq id no：19；轻链cdr-3的氨基酸序列
[0112]
qndytspyt。

技术特征：

1.一种结合至唾液酸路易斯a(slea)和唾液酸路易斯c(slec)的抗体或其抗原结合部分，其中此种抗体或抗原结合部分对slea的结合亲和力的k
d
为60μm或更小，并且对slec的结合亲和力的k
d
为100μm或更小。2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分不结合至唾液酸路易斯x(slex)。3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是人源化抗体或人源化抗原结合部分。4.一种结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4具有90％-100％序列同一性的序列；并且所述轻链可变区包含与seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10或seq id no:11具有90％-100％序列同一性的序列。5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分不结合至slex。6.如权利要求4或权利要求5所述的抗体或抗原结合部分，其中所述重链可变区包含含有seq id no:12的序列的cdr-h1、含有seq id no:13的序列的cdr-h2和含有seq id no:14的序列的cdr-h3；并且其中所述轻链可变区包含含有选自由seq id no:15-17组成的组的序列的cdr-l1、含有seq id no:18的序列的cdr-l2和含有seq id no:19的序列的cdr-l3。7.如权利要求4所述的抗体或抗原结合部分，其中所述重链可变区包含seq id no:3的序列，并且其中所述轻链可变区包含选自由seq id no:5-8组成的组的序列。8.如权利要求7所述的抗体或抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含seq id no:8的序列。9.如权利要求4所述的抗体或抗原结合部分，其中所述重链可变区包含seq id no:4的序列，并且其中所述轻链可变区包含选自由seq id no:9-10组成的组的序列。10.一种结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其中所述重链可变区包含与seq id no:3具有90％-100％序列同一性的序列。11.如权利要求10所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与选自由seq id no:5-11组成的组的序列具有90％-100％序列同一性的序列。12.一种结合至slea和slec的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含含有seq id no:12的序列的cdr-h1、含有seq id no:13的序列的cdr-h2和含有seq id no:14的序列的cdr-h3；并且其中所述轻链可变区包含含有选自由seq id no:15-17组成的组的序列的cdr-l1、含有seq id no:18的序列的cdr-l2和含有seq id no:19的序列的cdr-l3。13.一种多核苷酸，其编码权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。14.一种载体，其包含权利要求13所述的多核苷酸。15.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的多核苷酸或权利要求14所述的载体。
16.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养权利要求15所述的宿主细胞以使得产生所述抗体。17.如权利要求16所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体。18.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。19.一种或改善消化疾病或病症的症状的方法，其中所述方法包括向患有所述消化疾病或病症的个体施用有效量的权利要求1-12中任一项所述的抗体或抗原结合部分或权利要求18所述的药物组合物。20.如权利要求19所述的方法，其中所述消化疾病或病症选自由炎性肠病、肠易激综合征、胰腺癌和结肠癌组成的组。21.如权利要求20所述的方法，其中所述消化疾病或病症是炎性肠病。22.如权利要求21所述的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

技术总结

本公开提供了结合至sLeA和sLeC的抗体或其抗原结合部分，以及与所述抗体或其抗原结合部分相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物和方法。物和方法。物和方法。

技术研发人员：

L

受保护的技术使用者：

PTM医药股份有限公司

技术研发日：

2021.03.16

技术公布日：

2023/2/3