一种骨质疏松症的诊疗靶点及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种骨质疏松症的诊疗靶点及其应用。

背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis，op)是最常见的代谢性骨病，是由于骨形成和骨吸收失衡所造成的，主要病理特点表现为骨骼中蛋白质以及其他可溶性骨钙与矿物质大量的慢性代谢或丢失，导致骨量减少与骨脆性增加，给社会带来了巨大的公共卫生负担。
3.骨质疏松症包括原发性、继发性和特发性三类。由多种危险因素，如衰老、内分泌、代谢和营养障碍以及一些药物引起的骨形成和吸收之间的不平衡所导致的。目前，药物是应对骨质疏松症的主要手段，临床上用于骨质疏松症的药物主要包括四类，其一为抑制骨吸收药物，如双膦酸盐类、性雌激素及选择性雌激素受体调节剂、核因子-κb受体活化因子配体抑制剂、降钙素等；其二为促进骨形成药物，如甲状旁腺激素类似物；其三为其他机制类药物，如活性维生素d及其类似物、抗骨硬化蛋白单克隆抗体、锶盐等；其四为中药，如骨碎补总黄酮、淫羊藿苷等。然而，现有技术中仍无法证实骨质疏松症发生的确切病因，故很难到根治性的方法。虽然临床上目前现有的骨质疏松的药物有很多，但是这些药物都存在疗效欠佳与副作用多的缺点。
4.因此，亟需研究和开发出疗效更好、特异性更强、并发症更少、安全性更高的新型骨质疏松症药物。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种骨质疏松症的诊疗靶点及其应用，以期临床上控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的产生。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供一种骨质疏松症的诊疗靶点，所述靶点为alkbh5，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明alkbh5可作为骨质疏松症的诊疗新靶点。alkbh5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用，且alkbh5水平与骨量呈正相关， alkbh5正调控骨量，alkbh5缺失介导单核细胞破骨分化增强导致骨质疏松患者骨量减少。
9.第二方面，本发明提供一种骨质疏松症的小分子药物，包括alkbh5 蛋白或alkbh5上调剂。
10.本发明的小分子药物能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。
11.作为本发明所述的小分子药物的优选实施方式，还包括药学上可接受的载体。
12.进一步的，所述载体为稀释剂、粘合剂、吸附剂、填充剂、崩解剂、添加剂中的至少一种。
13.第三方面，本发明提供一种评估骨质疏松症的产品，包括用于检测生物样本中
alkbh5表达水平的检测试剂。
14.本发明在体外的细胞研究中成功分离并诱导破骨细胞前体细胞的破骨分化，并通过干预alkbh5的水平，发现alkbh5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用。可通过检测生物样本中alkbh5表达水平评估骨质疏松症的发生和发展。
15.第四方面，本发明将所述的诊疗靶点在制备诊断骨质疏松症的试剂盒中的应用。
16.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述试剂盒为通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测alkbh5基因表达以诊断骨质疏松症的试剂盒。
17.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述试剂盒为通过免疫印迹法、酶联免疫吸附法、谱法、质谱法或凝胶电泳法检测alkbh5蛋白表达以诊断骨质疏松症的试剂盒。
18.第四方面，本发明将所述的诊疗靶点、所述的小分子药物在制备骨质疏松症的药剂中应用。
19.基于本发明的新靶点研制骨质疏松症的新药物，能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
21.本发明在体外的细胞研究中成功分离并诱导破骨细胞前体细胞的破骨分化，并通过干预alkbh5的水平，发现alkbh5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用。进一步构建alkbh5特异性敲除小鼠，检测骨量发现 alkbh5特异性敲除小鼠的骨量明显低于野生型小鼠，说明alkbh5的缺失是导致骨质疏松患者骨量减少的重要原因。而在对alkbh5敲除小鼠尾静脉注射 alkbh5过表达腺相关病毒后，骨量丢失情况明显缓解，alkbh5敲除小鼠的骨量接近于野生型小鼠骨量，说明alkbh5水平与骨量呈正相关，alkbh5正调控骨量。骨质疏松的发生与小鼠破骨细胞alkbh5的特异性缺失而造成破骨分化活动增强有关，alkbh5缺失介导单核细胞破骨分化增强导致骨质疏松患者骨量减少，alkbh5是骨质疏松症的重要靶点。
22.基于本发明的新靶点研制骨质疏松症的新药物，能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。
附图说明
23.图1为trap染检测人单核细胞的破骨分化情况；
24.图2为trap染检测鼠单核细胞的破骨分化情况；
25.图1和图2中，si组均表示sirna敲减。
26.图3为western blot检测人单核细胞破骨分化标志物的蛋白水平。
27.图4为动物实验方案流程示意图。
28.图5为小鼠股骨骨小梁、骨皮质micro-ct扫描重建图。
29.图6为小鼠股骨骨小梁、骨皮质的统计分析图。
具体实施方式
30.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
31.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1：细胞实验
33.分离并诱导破骨细胞前体细胞的破骨分化，通过干预alkbh5的水平，发现alkbh5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用。
34.alkbh5的氨基酸序列为：
35.maaasgytdlreklksmtsrdnykagsreaaaaaaaavaaaaaaaa aaepypvsgakrkyqedsdpersdyeeqqlqkeeearkvksgirqmrlfsq decakiearidevvsraekglynehtvdraplrnkyffgegytygaqlqkr gpgqerlyppgdvdeipewvhqlviqklvehrvipegfvnsavindyqpggciv shvdpihiferpivsvsffsdsalcfgckfqfkpirvsepvlslpvrrgsvtvlsg yaadeithcirpqdikerraviilrktrldaprletkslsssvlppsyasdrlsg nnrdpalkpkrshrkadpdaahrprilemdkeenrrsvllpthrrrgsfsse nywrksyessedcseaagsparkvkmrrh。
36.具体实验如下：
37.(1)单核细胞的分离
38.1)小鼠单核细胞细胞系raw264.7购买自中科院细胞库。
39.2)原代人来源单核细胞提取自健康志愿者，外周血采集健康志愿者前臂常规消毒后用注射器(提前用肝素钠溶液润湿)抽取外周血约50ml。
40.提前采用紫外线消毒生物安全柜30分钟后进行操作。用生理盐水将外周血 1:1稀释后取20个15ml离心管，各加入5ml ficoll分离液然后每个15ml离心管中轻轻加入5ml稀释后的血液放在慢速离心机中，采用1500rpm离心20 min。然后使用巴氏吸管将中间的白膜层吸出，补充无菌pbs缓冲液至10ml，放在离心机中，采用1800rpm离心8min。离心后倒掉上清，在一个离心管中加入5ml无菌pbs缓冲液，逐个清洗离心管5管洗成1管，洗两遍，洗完后放入离心机中以1800rpm离心8min。离心后倒去上清，用1ml无菌pbs缓冲液重悬。之后按照cd14磁珠分选说明书将cd14单核细胞从外周血单个核细胞(pbmc)中分选出来加入a-mem培养基以合适密度接种于孔板中并转入5％ co2的37℃恒温培养箱中培养。
41.(2)单核细胞的alkbh5水平干预
42.分别将人和鼠的单核细胞种于孔板中，种板后第二天舍弃原培养基，对单核细胞进行alkbh5敲减sirna转染，sirna在转染6h后更换诱导培养基。
43.人alkbh5-1 sirna序列为：
44.sense 5
′‑
gacugugcucaguggauautt-3
′
，
45.antisense 5'-auauccacugagcacaguctt-3
′
；
46.人alkbh5-2 sirna序列为：
47.sense 5
′‑
gcuaugcuucagaucgccutt-3
′
，
48.antisense 5'-aggcgaucugaagcauagctt-3
′
；
49.鼠alkbh5-1 sirna序列为：
50.sense 5
′‑
gcugcaaguuccaguucaatt-3
′
，
51.antisense 5'-uugaacuggaacuugcagctt-3
′
；
52.鼠alkbh5-2 sirna序列为：
53.sense 5
′‑
gcgcggucaucaacgacuatt-3
′
，
54.antisense 5'-uagucguugaugaccgcgctt-3
′
；
55.对照sirna序列为：
56.sense 5
′‑
uucuccgaacgugucacgutt-3
′
，
57.antisense 5
′‑
acgugacacguucggagaatt-3
′
。
58.(3)单核细胞的破骨分化诱导
59.在对细胞进行敲减后进行相应的分化诱导。加入破骨分化诱导培养基，定期更换培养基1次/3天。更换培养基时先弃去旧培养基，用无菌pbs缓冲液清洗3次，随后加入全新的破骨诱导培养基，置于5％co2的37℃恒温培养箱中培养。
60.其中，破骨分化诱导培养基的配方为：10％fbsα-mem、25nm m-csf、 50nm rnakl、100iu/ml青霉素-链霉素。
61.(3)单核细胞破骨分化水平检测
62.破骨水平在破骨分化诱导的第8天进行检测。采用trap染检测细胞的破骨分化情况。采用western blot检测人单核细胞中破骨分化相关标志物ctsk、 trap、nfatc1的蛋白水平。
63.抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)为破骨细胞的特异性标志酶，trap染检测人单核细胞的破骨分化的情况如图1所示，人单核细胞中，alkbh5敲减后表征破骨分化程度的trap染强度增强，说明alkbh5缺失能有效促进破骨分化。trap染检测鼠单核细胞的破骨分化的情况如图2所示，鼠单核细胞中，alkbh5敲减后表征破骨分化程度的trap染强度增强，说明alkbh5缺失能有效促进破骨分化。
64.western blot检测人单核细胞中破骨分化相关标志物蛋白水平结果如图3所示，ctsk、trap、nfatc1能够使细胞分化为破骨细胞并促进骨吸收，alkbh5 敲减使得人单核细胞中ctsk、trap、nfatc1的蛋白水平均升高，尤其是ctsk、 trap的蛋白水平表现出极显著的增加。
65.在人和鼠单核细胞中，alkbh5敲减后破骨分化标志物的蛋白水平升高、且trap染强度增强，说明alkbh5缺失能有效促进破骨分化。提示alkbh5 水平与破骨分化标志物呈负相关，alkbh5能够负调控破骨分化。
66.实施例2：动物实验
67.实验方案如图4所示，具体如下：
68.(1)骨质疏松小鼠动物模型构建
69.具有c57bl/6背景的alkbh5
fl/+
小鼠由cyagen(中国苏州)使用crispr/cas 介导的基因组工程构建。alkbh5基因(ncbi参考序列：nm_172943，ensembl： ensmusg00000042650)位于小鼠11号染体上。外显子1被选为条件敲除区域。为了设计靶向载体，使用bac克隆rp23-329 m3作为模板，通过pcr 生成同源臂和条件敲除cko区域。将cas9、引导rna和靶向载体共同注射到受精卵中，用于cko小鼠生产。通过pcr对幼崽进行基因分型，然后进行测序分析。
70.ctsk-cre转基因小鼠购自杰克逊实验室。将ctsk-cre小鼠与alkbh5
fl/+
小鼠杂交以获得ctsk-cre、alkbh5
fl/+
小鼠作为杂合条件alkbh5敲除小鼠。通过交配ctsk-cre、alkbh5
fl/+
雄性小鼠与ctsk-cre、alkbh5 fl/fl
雌性小鼠，获得了ctsk-cre、alkbh5
fl/fl
小鼠作
为纯合条件性alkbh5敲除小鼠。
71.从小鼠尾巴中提取的基因组dna进行pcr分析来鉴定转基因小鼠的基因型。
72.用于floxed的alkbh5敲除等位基因基因分型的引物如下：
73.正向引物5'-caggtttgaagtggccatagtagc-3'，
74.反向引物5'-gaggccaagacaggagaatcagac-3'。
75.cre转基因基因分型的引物如下：
76.正向引物5'-gctctgatgttggcaaaggggt-3'，
77.反向引物5'-aacatcttcaggttctgcggg-3'。
78.(2)alkbh5过表达腺相关病毒的构建
79.alkbh5过表达腺相关病毒由上海和元生物技术有限公司设计并构建。
80.(3)分组给药
81.分别将野生型小鼠和alkbh5特异敲除小鼠分为三组，包括野生型小鼠组、 alkbh5敲除小鼠组、alkbh5敲除小鼠+alkbh5过表达组。在对小鼠进行鼠尾鉴定确认小鼠的基因型后，三组分别予相同体积生理盐水、5
×
10
11
空载体和appl1过表达腺病毒尾静脉注射，每2周一次。
82.(4)小鼠股骨骨量检测
83.从给药后的第9周开始，采用颈椎脱臼法处死三组中的小鼠。处死后取小鼠股骨，进行micro-ct扫描，分析股骨骨小梁及骨皮质相关指标，包括骨体积分数、骨皮质厚度、骨表面积/骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度。
84.三组小鼠均未见感染或异常死亡等情况。各组小鼠股骨骨小梁、骨皮质 micro-ct扫描重建的对比如图5所示，小鼠股骨骨小梁、骨皮质的统计分析对比如图6所示。与野生型小鼠相比，alkbh5特异敲除小鼠的骨体积分数显著降低、骨表面积/骨体积显著增加、骨小梁厚度和骨小梁数量显著降低、骨小梁分离度显著升高、骨皮质厚度降低，alkbh5特异敲除小鼠的骨量显著降低，说明成功造模骨质疏松小鼠模型，且alkbh5的缺失是骨质疏松发生的重要原因。
85.与alkbh5特异敲除小鼠相比，将过表达腺相关病毒通过尾静脉注射到 alkbh5敲除小鼠后，alkbh5过表达的特异敲除小鼠的骨体积分数显著增加、骨表面积/骨体积显著降低、骨小梁厚度和骨小梁数量显著增加、骨小梁分离度显著降低、骨皮质厚度增加，alkbh5特异性敲除小鼠的骨量降低情况明显改善，与正常野生型小鼠的骨量相当，即骨量丢失情况明显缓解，说明aklbh5 的水平与骨量呈正相关，alkbh5正调控骨量。
86.本发明在体外的细胞研究中成功分离并诱导破骨细胞前体细胞的破骨分化，并通过干预alkbh5的水平，发现alkbh5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用。进一步构建alkbh5特异性敲除小鼠，检测骨量发现alkbh5特异性敲除小鼠的骨量明显低于野生型小鼠，说明alkbh5的缺失是导致骨质疏松患者骨量减少的重要原因。而在对alkbh5敲除小鼠尾静脉注射 alkbh5过表达腺相关病毒后，骨量丢失情况明显缓解，alkbh5敲除小鼠的骨量接近于野生型小鼠骨量，说明alkbh5水平与骨量呈正相关，alkbh5正调控骨量。骨质疏松的发生与小鼠破骨细胞alkbh5的特异性缺失而造成破骨分化活动增强有关，alkbh5缺失介导单核细胞破骨分化增强导致骨质疏松患者骨量减少，alkbh5是骨质疏松症的重要靶点。
87.基于本发明的新靶点研制骨质疏松症的新药物，能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。
88.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.一种骨质疏松症的诊疗靶点，其特征在于，所述靶点为alkbh5，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种骨质疏松症的小分子药物，其特征在于，包括alkbh5蛋白或alkbh5上调剂。3.根据权利要求2所述的小分子药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。4.根据权利要求3所述的小分子药物，其特征在于，所述载体为稀释剂、粘合剂、吸附剂、填充剂、崩解剂、添加剂中的至少一种。5.一种评估骨质疏松症的产品，其特征在于，包括用于检测生物样本中alkbh5表达水平的检测试剂。6.权利要求1所述的诊疗靶点在制备诊断骨质疏松症的试剂盒中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测alkbh5基因表达以诊断骨质疏松症的试剂盒。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为通过免疫印迹法、酶联免疫吸附法、谱法、质谱法或凝胶电泳法检测alkbh5蛋白表达以诊断骨质疏松症的试剂盒。9.权利要求1所述的诊疗靶点、权利要求2～4任一项权利要求所述的小分子药物在制备骨质疏松症的药剂中的应用。

技术总结

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种骨质疏松症的诊疗靶点及其应用。本发明的骨质疏松症的诊疗靶点ALKBH5对人破骨细胞前体细胞的破骨分化具有负调控作用，ALKBH5的缺失是导致骨质疏松患者骨量减少的重要原因。ALKBH5水平与骨量呈正相关，ALKBH5正调控骨量。基于本发明的新靶点研制骨质疏松症的新药物，能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。好的效果。好的效果。