一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的LAMP反应试剂及其应用

一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂及其应用
技术领域
1.本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂及其应用。

背景技术：

2.弧菌属是一类广泛存在于海水、海产品中的细菌。其中有十几种是能够引起人疾病的病原菌，其中，副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus，vp)和创伤弧菌(vibrio vulnificus，vv)会引起较高的死亡率。海产品或其他食品中的副溶血性弧菌和创伤弧菌是通过人摄入或者伤口感染至人体内引起呕吐和腹泻等一系列胃肠道疾病或败血症甚至死亡。所以，弧菌的快速检测和控制是保障人们饮食安全健康的一个特别重要的技术。
3.对病原微生物检测的早期策略主要是基于对病原体的分离和培养，耗时耗力。尽管现在普遍使用的基于免疫方法的病原微生物检测非常简便快速，但因存在检测窗口期及灵敏度还不够高而限制了应用。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)由于可在生物体外进行核酸扩增的特点成为了最经典的分子生物学技术，被广泛应用于生物学、医学和法学等领域，但是基于pcr方法的检测，一般分三步骤设置变性(90℃-95℃)-退火(40℃-60℃)-延伸(70℃-75℃)三个温度点，需要反应温度优化、后续检测和专门仪器设备及1小时以上的反应时间等条件，在即时检测方面的应用仍有一些限制。与常规pcr技术相比，环介导核酸等温扩增(lamp)无需温度循环，简化仪器的要求，缩短反应时间和更能满足即时快速简便的需求，但是还是存在灵敏度低的缺陷。现有技术中，为了提高lamp反应检测的灵敏度，将lamp法与金纳米颗粒(goldnanoparticle，aunps)结合进行检测，但是aunps容易受到扩增温度和反应体系中的一些成分(如盐离子)的影响，从而变得不稳定，将aunps进行修饰虽然能提高其稳定性，但会带来复杂繁琐、耗时长，成本高等问题。
4.因此，一种简单、低成本的增强aunps稳定性的基于lamp法来检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法是有必要的。

技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，该lamp反应试剂是通过金纳米颗粒(aunps)、价格较低廉的聚乙二醇和lamp反应引物对混合对副溶血性弧菌和/或创伤弧菌基因组dna进行扩增。基于该用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，能实现在63℃条件下55min内100fg以上的检测，检测时间短，灵敏度高，成本较低；而且还可以可视化，使得检测更加便捷。
6.为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
7.本发明一方面提供一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，包括用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对、聚乙二醇和aunps。
8.本发明另一方面提供一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测试剂盒，其包括上述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂。
9.本发明再一方面提供一种检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，包括：对待检测样品提取细菌基因组dna，然后使用上述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂对细菌基因组dna进行lamp扩增反应。
10.本发明有益效果包括：基于本发明提供的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法能在63℃条件下55min内100fg以上的检测，检测时间短，灵敏度高；而且基于aunps，实现了副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的可视化半定量检测。
附图说明
11.图1为不同反应温度的aunps-lamp反应的琼脂糖凝胶电泳图；
12.图2为不同反应时间的aunps-lamp反应的琼脂糖凝胶电泳图；
13.图3为不同peg浓度的aunps-lamp反应的情况；
14.图4为aunps-lamp不同反应温度条件下的实时荧光扩增曲线；
15.图5为阳性结果和阴性结果的胶孔内颜对比；
16.图6为多重aunps-lamp扩增副溶血性弧菌的toxr基因的检测限；
17.图7为多重aunps-lamp扩增创伤弧菌的rpos基因的检测限；
18.图8为副溶血性弧菌toxr基因aunps-lamp扩增的灵敏度；
19.其中，图1中，1：61℃，2:62℃，3：63℃，4：64℃，5：65℃，m:100bpdnaladder，n:阴性对照；
20.图2中，1'：45min，2'：50min，3'：55min，4'：60min，m:100bpdnaladder；n：阴性对照；
21.图5中，1-3分别是副溶血性弧菌的toxr基因的阳性对照和阴性对照(其他细菌基因组dna和水为模板)，4-6分别是创伤弧菌的rpos基因的阳性对照和阴性对照(其他细菌基因组dna和水为模板)；
22.图6和图7中，检测限的dna浓度从200pg/μl、20pg/μl、2pg/μl、200fg/μl、100fg/μl、50fg/μl、25fg/μl至12.5fg/μl分析，nc为阴性对照；
23.图8中，(a)：琼脂糖凝胶图(b)：比图，m:100bpdnaladder，1-7分别为2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、100fg和50fg，n：阴性对照。
具体实施方式
24.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
25.本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以
添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
26.本发明实施例提供一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，包括用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对、聚乙二醇和aunps。具体地，本发明引入一种空间位阻剂聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)，减少了金纳米颗粒之间的碰撞几率，提高了aunps的稳定性，而且方便简洁。另外，aunps和peg参与反应，不同菌浓度下aunps团聚程度不同而呈现出颜的区别，从而实现病原微生物的可视化半定量检测，且成本较低。
27.在一些具体实施例中，上述用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对可以包括以下引物对：引物对1：seq id no.1和seq id no.2，引物对2：seq id no.3和seq id no.4，引物对3：seq id no.5和seq id no.6，引物对4：seq id no.7和seq id no.8，引物对5：seq id no.9和seq id no.10，引物对6：seq id no.11和seq id no.12。需要说明的是，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对可以是本领域所已知的lamp引物对，也可以是本发明中提供的引物对，本发明中的引物对对副溶血性弧菌toxr基因和创伤弧菌的rpos基因有较强的扩增特异性，可以有效对副溶血性弧菌toxr基因和创伤弧菌的rpos基因进行扩增，实现副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测，检测灵敏度可以达到100fg。
28.还需要说明的是，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂中，还包括本领域所公知的其他的lamp反应试剂，比如反应缓冲液、dntp、和bstpolymerase等。
29.在一些具体实施例中，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂中，聚乙二醇的质量浓度为38％-40％。需要说明的是，聚乙二醇的作用是增加减少了金纳米颗粒之间的碰撞几率，提高了aunps的稳定性。聚乙二醇的质量浓度对检测也存在影响，peg浓度只有到了38％-40％(优选39％)，阴性对照才显示红无沉淀；其他浓度会产生明显的沉淀，即产生aunps的团聚现象，影响检测的灵敏度。
30.在一些具体实施例中，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂中，一般选用粒径为16nm的aunps。。
31.本发明另一实施例提供一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测试剂盒，其包括上述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂。需要说明的是，检测试剂盒的组成为本领域所已知的常规形式，比如检测试剂盒会设置试剂盒说明书，比如会有盛装各种检测试剂的试剂瓶，比如会设置成若干小格子用来放置检测试剂瓶，比如会有滴管用来移取检测试剂等。
32.本发明另一实施例提供一种检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，包括：对待检测样品提取细菌基因组dna，然后使用上述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂或用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测试剂盒对细菌基因组dna进行lamp扩增反应。需要说明的是，对待检测样品提取细菌基因组dna为本领域所已知的。
33.在一些具体实施例中，上述检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法中，lamp扩增反应的温度为62℃-64℃，优选63℃。需要说明的是，在同一浓度下，63℃的扩增速度最快。
34.在一些具体实施例中，上述检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法中，lamp扩增反应的时间为53min-55min，比如54min或55min等。
35.在一些具体实施例中，上述检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法中，若lamp扩增反应后反应液呈蓝，则待检测样品中含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌；若lamp扩增反应后反应液呈红，则待检测样品中不含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌。
36.为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
37.实施例1用于快速检测副溶血性弧菌和创伤弧菌可视化方法的建立
38.(1)副溶血性弧菌和创伤弧菌dna的提取
39.从海水或养殖水体、海洋沉积物和水生或水产动物中分离出的副溶血性弧菌和创伤弧菌；经过活化后，采用试剂盒法提取细菌基因组dna并立即存储于-20℃备用。
40.(2)金纳米颗粒的合成
41.加热100ml0.242mm(1％)的氯金酸至沸腾，加入3.5ml1％柠檬酸三钠，并剧烈搅拌，继续加热20分钟；20分钟后，让烧瓶慢慢冷却至室温，搅拌过夜；由透射电子显微镜图像估算颗粒的尺寸大小为16.22
±
0.67nm；采用16nm左右直径的裸aunps。
42.(3)基于空间位阻剂初步建立副溶血性弧菌和创伤弧菌aunps-lamp反应扩增条件
43.针对副溶血性弧菌的toxr基因和创伤弧菌的rpos基因采用引物(见表1)和进行aunps-lamp扩增实验；lamp反应体系共35μl，包括：12.5μl2
×
反应缓冲液(newenglandbiolabsinc.)、1μl 10mm dntp(生工)、0.5μl 40μμfip/bip(vv)、0.25μl 40μμlf/lb(vv)和f3/b3(vv)、1.5μl 40μμfip(vp)和bip(vp)、0.75μl 40μμlf/lb(vp)、0.25μl40μμf3/b3(vp)、8u/μl of bstpolymerase(largefragment；newenglandbiolabsinc.)、2μldna模板、5μl peg、5μlaunps；反应条件为63℃，55min；80℃，5min；通过肉眼观察和琼脂糖凝胶电泳确定反应结果。
44.表1lamp反应检测引物对
[0045][0046][0047]
实施例2优化aunps-lamp反应扩增条件
[0048]
(1)优化反应温度
[0049]
设置反应温度为61℃、62℃、63℃、64℃和65℃，其他步骤同实施例1，进行aunps-lamp反应得反应产物，然后进行凝胶电泳，结果如图1和图4所示，61℃、62℃、63℃、64℃和65℃下均有扩增条带，且条带亮度几乎相同(见图1)；在同一浓度下，63℃的扩增速度最快(见图4)。
[0050]
(2)优化反应时间
[0051]
设置反应时间分别为45min，50min，55min，60min，其他步骤同实施例1，进行aunps-lamp反应得反应产物，然后进行凝胶电泳，结果如图2所示，扩增条带最亮的时间为最佳反应时间，45min后至60min也都有扩增条带，条带亮度几乎相同。
[0052]
(3)优化peg浓度
[0053]
设置peg质量浓度为9％、14％、19％、24％、29％、34％和39％，其他步骤同实施例1，进行aunps-lamp反应得反应产物，反应情况如图3所示，peg浓度只有到了39％，阴性对照才显示红无沉淀，其余均有明显的沉淀，即产生aunps的团聚现象，则peg最佳浓度为39％。
[0054]
(4)样品检测
[0055]
采用上述优化后的反应时间、反应温度和peg浓度按照实施例的步骤进行aunps-lamp反应检测，检测结果如图5所示，其中阳性结果呈蓝，阴性结果呈红。
[0056]
实施例2对本发明所建立的检测方法进行灵敏度试验分析
[0057]
本发明实施例中，通过使用实施例1中优化后的aunps-lamp反应方法扩增梯度稀释的副溶血性弧菌基因组dna样品，来确定该方法的灵敏度和检测限，结果如图6和图7所示，在30min内针对副溶血性弧菌toxr基因和创伤弧菌rpos基因的检测限均为100fg/μl；图8显示aunps-lamp扩增2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、100fg和50fg的副溶血性弧菌dna琼脂糖凝胶电泳结果，即200fg以上的dna浓度均出现了扩增条带，但与图6的结果不一致的是，100fg未显示出条带，这可能是因为此浓度下扩增产物量过低，无法在琼脂糖电泳分析中显示出来。
[0058]
实施例3对本发明所建立的检测方法进行比特性分析
[0059]
本发明实施例中，通过使用实施例1中优化后的aunps-lamp反应方法对弧菌不同dna浓度下检测结果的观察和拍照，与比卡对比，确定该方法的半定量比结果，结果如图8b和下表2所示，实施例1中的方法能在63℃条件下55min内实现100fg以上的半定量可视化检测。改变dna的浓度(100fg/μl以上)，用同种方法进行多次实验，确定颜变化的临界点，从而可以根据样品反应的颜判断菌的含量范围。
[0060]
表2不同dna浓度下的比结果
[0061][0062]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

技术特征：

1.一种用于检测副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)和/或创伤弧菌(vibrio vulnificus)的lamp反应试剂，其特征在于，包括用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对、聚乙二醇和aunps。2.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，其特征在于，用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp引物对包括以下引物对：引物对1：seq id no.1和seq id no.2，引物对2：seq id no.3和seq id no.4，引物对3：seq id no.5和seq id no.6，引物对4：seq id no.7和seq id no.8，引物对5：seq id no.9和seq id no.10，引物对6：seq id no.11和seq id no.12。3.根据权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂，其特征在于，聚乙二醇的质量浓度为38％-40％。4.用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3中任一所述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂。5.一种检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，其特征在于，包括：对待检测样品提取细菌基因组dna，然后使用权利要求1至3中任一所述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的lamp反应试剂或权利要求5所述的用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的检测试剂盒对细菌基因组dna进行lamp扩增反应。6.根据权利要求5所述的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，其特征在于，lamp扩增反应的温度为62℃-64℃。7.根据权利要求5或6所述的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，其特征在于，lamp扩增反应的时间为53min-55min。8.根据权利要求5或6所述的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，其特征在于，若lamp扩增反应后反应液呈蓝，则待检测样品中含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌；若lamp扩增反应后反应液呈红，则待检测样品中不含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌。9.根据权利要求7所述的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法，其特征在于，若lamp扩增反应后反应液呈蓝，则待检测样品中含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌；若lamp扩增反应后反应液呈红，则待检测样品中不含有副溶血性弧菌和/或创伤弧菌。

技术总结

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的LAMP反应试剂及其应用。LAMP反应试剂包括用于检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的LAMP引物对、聚乙二醇和AuNPs。基于该LAMP反应试剂的检测副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的方法能在63℃条件下55min内100fg以上的检测，检测时间短，灵敏度高，成本较低；而且基于AuNPs，实现了副溶血性弧菌和/或创伤弧菌的可视化半定量检测。性弧菌和/或创伤弧菌的可视化半定量检测。性弧菌和/或创伤弧菌的可视化半定量检测。