一种利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法

1.本发明属于农林生物技术领域和微生物基因工程领域，具体是一种重组酿酒酵母介导裂解杜仲叶抽提杜仲胶的方法。

背景技术：

2.杜仲(eucommia ulmoides.oliver)是我国特有胶源植物，其胶制品在医药、工业和农业等领域极具开发潜力。杜仲胶(e.ulmoides gum，eug)是一种天然高分子材料，与天然橡胶(natural rubber，nr)互为同分异构体。eug是杜仲细胞的次生代谢产物，主要合成并贮存于含胶细胞中。研究发现杜仲不同组织中杜仲胶含量存在差异。如杜仲翅果中eug含量最高，达12-18％，而叶片中含胶量最低，仅为2-3.5％。尽管杜仲叶片含胶量低，但其生物量最大，可作为杜仲胶提取的理想原料目前，杜仲胶的提取多集中在物理法、化学法和生物法，但物理法所产生的机械冲击、剪切极易破坏杜仲胶丝，导致非胶杂质难以分离，而化学法处理过程试剂消耗量大废料难以处理极易造成污染环境。尽管生物法作用温和，能较大程度保留eug的天然结构，但生物法酶促降解细胞壁效率不高，极大影响了eug的提取率。近来，有学者发现部分真菌[如，里氏木霉(trichoderma reesei)和黑曲霉(aspergillus niger)等]可分泌高活性纤维素酶和半纤维素酶，但这些真菌遗传背景复杂且次生代谢产物多，利用它们的酶促酵解不利于目标产物的分离、纯化。因此，利用基因工程手段改造酵母菌，实现对工程菌功能的提升是许多学者关注的热点。

技术实现要素：

[0003]
针对上述领域中的需求，本发明提供了一种利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶的方法。通过构建含有外源里氏木霉(t.reesei)纤维素降解基因cel5a/cel6a的表达载体，并导入受体酿酒酵母(s.cerevisiae)获得工程酵母菌，利用重组酿酒酵母发酵杜仲叶，与传统杜仲胶提取方法相比较，污染少，提取得率高，不影响杜仲胶的性能，可为今后杜仲胶规模提取和推广奠定基础。
[0004]
重组表述载体，其特征在于：以paur101为基础载体，将乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase，adh)基因启动子序列(padh1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)基因终止子序列连接到表达载体paur101上，得到中间表达载体paur101-padh1，再将里氏木霉(t.reesei)内切葡聚糖酶cel5a基因或里氏木霉(t.reesei)外切葡聚糖酶cel6a基因分别连接到中间载体上得到重组表述载体，所述cel5a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cel6a基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0005]
所述的重组表达载体，命名为paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a，其结构如图2或图3所示。
[0006]
重组酿酒酵母工程菌，含有上述的重组表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a。
[0007]
所述的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株为invsc1
#
，具有氨苄和卡纳
抗性。
[0008]
一种利用重组酿酒酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法，采用如下顺序步骤：
[0009]
1)杜仲叶发酵预处理：将自然风干的杜仲叶片破碎至2-4mm的组织碎屑，加入0.1g/l sds，50％乙醇，超声处理；之后煮沸除去叶绿素，过滤后备用；
[0010]
2)杜仲叶发酵工艺：活化权利要求3或4中含有cel5a基因和cel6a基因的两种重组酿酒酵母工程菌，添加预处理过的杜仲叶，进行发酵，发酵工艺条件为料液比1:10，发酵30℃，ph 7，发酵120h；
[0011]
3)提取杜仲胶：取出发酵固形物，过滤、自然风干后以石油醚为溶剂，加热回流，然后将溶液冷却析出沉淀，沉淀自然风干即为杜仲胶。
[0012]
其中两种重组酿酒酵母工程菌的体积比为1：1。
[0013]
所述活化为重组酿酒酵母工程菌按接种比1:100接种于5l马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose，pd)中并发酵，所述重组酿酒酵母工程菌的制备方法，将权利要求2中表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a经酶切验证后导入大肠杆菌(e.coli dh5α)；然后利用stu i酶切线性化，经胶回收纯化后热激法对受体酿酒酵母菌进行转化，热激条件为：42℃，热击30min。
[0014]
所述表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a的构建方法为：以paur101为基础载体，将乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase，adh)基因启动子序列(padh1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)基因终止子序列连接到表达载体paur101上，构建中间表达载体paur101-padh1，再将里氏木霉(t.reesei)内切葡聚糖酶cel5a基因或里氏木霉(t.reesei)外切葡聚糖酶cel6a基因连接到中间载体上而得到，所述cel5a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cel6a基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0015]
所述cel5a基因或cel6a基因连接到中间载体上的方法为利用bam hi和kpn i双酶切paur101-padh1，经由t4 dna连酶连将cel5a及cel6a基因分别连接在中间载体上，并最终构建成表达载体paur101-padh1::cel5a和paur101-padh1::cel6a。
[0016]
所述超声处理为：以20khz的超声频率，45℃处理，超声30min，所述煮沸温度为80℃；所述回流为在90℃下热回流提取12h；所述冷却为将溶液置于-20℃下冷却3h。
[0017]
所述的杜仲叶片均来自杜仲品种华仲6号(eucommia ulmoides l.var.huazhong no.6)、树龄为3年生的树木中段叶片。
[0018]
本发明的利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法，详细过程如下：
[0019]
1)构建重组酵母
[0020]
2)收集杜仲叶片自然风干；
[0021]
3)杜仲叶发酵预处理，先将杜仲叶片破碎至3mm左右组织碎屑，超声波处理，加入0.1g/l sds，50％乙醇，超声30min。以20khz的超声频率，45℃处理；之后再以80℃煮沸除去叶绿素，过滤后备用；
[0022]
4)利用重组酿酒酵母活化，接种比1:100，接种5l马铃薯葡萄糖液体培养基并发酵，发酵48h添加杜仲叶；
[0023]
5)主体发酵条件为料液比1:10，30℃，ph 7，发酵120h；
[0024]
6)取出发酵固形物，过滤、自然风干后以石油醚为液相在90℃下热回流提取12h；
[0025]
7)将提取液置于-20℃冷却3h，析出沉淀，弃去石油醚(石油醚可回收利用)，沉淀自然风干即为杜仲精胶。
[0026]
注：
[0027]
①
以上杜仲叶片预处理后，发酵前需高温灭菌；
[0028]
②
以上重组酿酒酵母分为两种分别为重组cel5a基因型和重组cel6a基因型，菌种活化后接种时，两菌种体积比1:1
[0029]
③
所述重组酵母表达载体为paur101，paur101是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)染体整合型穿梭载体。在酵母细胞中不能自主复制，只能通过重组酶将其整合到酵母染体中才能稳定的存在。paur101含有突变体aur1-c基因作为筛选标记，在酵母转化时，可使用aureobasidin a(aba)进行抗性筛选。该载体可通过aur1-c基因中单切点限制酶(bstp i、ecoo65 i、bsiw i或stu i)线性化，然后以同源重组的方式有效地整合到宿主染体中；
[0030]
④
所述的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株为invsc1
#
，,具有氨苄和卡纳抗性。本菌株是生长快速的双倍体酵母细胞，为his,leu,trp和ura营养缺陷型菌株，在缺乏组氨酸,亮氨酸,氨酸和尿嘧啶的scminimal media中无法生长。其基因型如下:mata his3δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/matαhis3δ1 leu2 trp1-289 ura3-52；
[0031]
⑤
所述的杜仲叶片均来自贵州大学农业生物工程研究院林场杜仲资源圃杜仲树龄为3年生的树木中段叶片，杜仲品种为：华仲6号(eucommia ulmoides l.var.huazhong no.6)。
[0032]
本发明建立含有里氏木霉(trichoderma reesei)纤维素酶基因cel5a/cel6a的表达载体，导入酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)构建工程酵母菌，并利用工程酵母对超声预处理后的杜仲叶片进一步酶解以实现对杜仲胶的完全释放，对发酵产物利用索氏提取纯化杜仲胶，实现对杜仲胶的充分提取。
[0033]
本发明无需酸液碱液处理及大量清水冲洗，具有以下优点：
[0034]
第一：本研究方法能更好的保留杜仲橡胶形态结构，工程酿酒酵母外源纤维素酶，能有效酶促降解杜仲叶片细胞壁，从而实现对杜仲橡胶有效提取。同时，与传统杜仲胶提取方法相比较，污染少，提取得率高，不影响杜仲胶的性能。
[0035]
第二：本研究获得的杜仲橡胶提取方法可以在一定程度上在提高杜仲叶片的提取率，提取率达2.35％
[0036]
第三：重复性与普遍性高。对材料的处理方式统一，易重复。
[0037]
第四：本研究的杜仲橡胶提取方法所得杜仲橡胶主要为长丝的杜仲橡胶其最高平均分子量为29.283
×
104，所得杜仲胶为高分子量胶。
附图说明
[0038]
图1中间载体构建及酶切图，(图中的1泳道为未酶切对照组，2泳道为酶切组)
[0039]
图2 cel5a载体构建及酶切图(图中的1泳道为未酶切对照组，2泳道为酶切组)
[0040]
图3 cel6a载体构建及酶切图(图中的1泳道为未酶切对照组，2泳道为酶切组)
[0041]
图4酵母转化筛选菌落
[0042]
a,转cel5a阳性菌落.b,转cel6a阳性菌落
[0043]
图5酵母转化筛选菌落pcr电泳图，
[0044]
a,转cel5a阳性菌落pcr.b,转cel6a阳性菌落pcr，
[0045]
(其中的1、2、3、4、5泳道分别为株系阳性菌落菌落pcr)
[0046]
图6杜仲胶制备工艺流程图，
[0047]
图7发酵后杜仲胶图，
[0048]
图8杜仲胶发酵后及碱碱浸法提取杜仲胶分子量分布图，
具体实施方式
[0049]
下面结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。
[0050]
本发明的用语及培养基：
[0051]
本发明中酵母菌培养一般采用pda培养基(酵母提取物10g/l+蛋白胨10g/l+葡萄糖10g/l，ph 7.2)培养。
[0052]
一、重组酵母获得
[0053]
1.1目的基因选择及优化
[0054]
根据文献报道，利用ncbi登录号查里氏木霉(t.reesei)内切葡聚糖酶cel5a(gene id：18482842)以及外切葡聚糖酶cel6a(geneid：18488147)基因编码序列，利用在线软件expoptimizer(https://www.novopro/tools/codon-optimization.html)对编码频率小于20％的密码子进行了密码子优化(akcapinar等2011)。同时，为实现目标基因的定向表达，在2个基因前端添加α-factor信号肽，并调整gc含量为40％-50％。优化后的基因序列交由金开瑞(武汉)进行全序列合成。见seq id no.1和seq id no.2。
[0055]
1.2表达载体构建
[0056]
将人工合成的s.cerevisiae乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase，adh)基因启动子序列(padh1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)基因终止子序列(见seq id no.3)连接到表达载体paur101上，构建中间表达载体paur101-padh1(图1，中间载体构建及酶切图)。再利用bam hi和kpn i双酶切paur101-padh1，经由t4 dna连酶连将cel5a及cel6a基因分别连接在中间载体上，并最终构建成表达载体paur101-padh1::cel5a(图2cel5a载体构建及酶切图)和paur101-padh1::cel6a(图3 cel6a载体构建及酶切图)。同时，将构建的2个表达载体经酶切验证后导入大肠杆菌(e.coli dh5α)中保存。
[0057]
1.3酵母转化及pcr验证
[0058]
将上述保存的表达载体利用stu i酶切线性化，经胶回收纯化后参照liac/peg热激法对受体酿酒酵母菌进行转化。热激条件为：42℃，热击30min。之后将热激重悬菌液200μl涂布于含有aba(0.3μml/l)抗性pda培养基筛选(图4)，获得的阳性菌落经pcr扩增验证(图5)，菌落扩增体系见表1，引物见表2，分别获得阳性菌株cel5a-s
#
，及cel6a-s
#
。
[0059]
上述菌落pcr扩增体系如下：
[0060]
表1 cel5a/cel6a基因菌落pcr扩增体系
[0061][0062]
表2 pcr验证引物序列
[0063][0064]
二、重组酿酒酵母发酵
[0065]
2.1发酵前处理
[0066]
收集杜仲叶片自然风干；杜仲叶发酵预处理，称取杜仲叶片干重10g先将杜仲叶片破碎至3mm左右组织碎屑，超声波处理，加入0.1g/l sds，50％乙醇，超声30min。以20khz的超声频率，45℃处理；之后再以80℃煮沸除去叶绿素，过滤后备用。
[0067]
2.2发酵菌种活化
[0068]
利用重组酿酒酵母工程菌活化，接种比1:100(cel5a重组酿酒酵母工程菌：cel56重组酿酒酵母工程菌体积比为1：1)，接种5l酵母葡萄糖液体培养基(ypd)并发酵，发酵48h添加杜仲叶；
[0069]
2.3发酵条件
[0070]
主体发酵条件为料液比1:10，30℃，ph 7，发酵120h(图6)。
[0071]
三、索氏提取及分子量测定
[0072]
3.1索氏提取条件
[0073]
取出发酵固形物，过滤、自然风干后以石油醚为液相在90℃下热回流提取12h；将提取液置于-20℃冷却3h，析出沉淀，弃去石油醚(石油醚可回收利用)，沉淀自然风干即为杜仲精胶(图7)；
[0074]
3.2杜仲胶得率计算
[0075]
提取杜仲粗胶后计算其提胶率，计算公式为：
[0076][0077]
式中：p1为杜仲精胶产率，即所得杜仲胶精胶在叶片干重比例；
[0078]
m1为杜仲叶片干质量；
[0079]
m2为所得精胶干质量；
[0080]
此方法提取率三组对照分别为2.67％、2.10％及2.28％统计分析后为提取率为2.35
±
0.016％。碱解对照组橡胶得率为0.65％、0.61％和0.57％均值为0.61％。(见对照组实验)
[0081]
3.2分子量测定
[0082]
为了验证本实验与碱提法杜仲胶分子量的特征性质差异，将上述提取的杜仲胶置于37℃烘至恒重，准确称取10-20mg样品溶解至10ml thf溶液中37℃溶解，以0.22μl有机相滤头过滤。利用分子排阻谱(sizs-exclusion chromatogrphy，sec)对杜仲胶分子量进行测定。谱条件：流动相为四氢呋喃(tetrahydrofuran，thf)，液相流速0.35ml/min，样品稀释至1-2mg/ml，柱内温度设置为40℃，每组设6个重复，根据混标(mw＝706000，96400，5970，474，370，266)对应的出峰时间(5.972，7.273，9.198，10.73，10.833，11.165)建立标准曲线。由gpc专用软件(https://www.agilent/)进行处理即可直接输出杜仲胶的重均相对分子质量(图8)。
[0083]
对比实验：碱浸法提取杜仲胶(对照组)
[0084]
准确称量杜仲树叶干粉8.00g，加入100ml 10％的naoh溶液，90℃下对杜仲果皮进行预处理3h后过滤，滤渣用蒸馏水冲洗至ph为7.0，然后置于50℃烘箱中烘至恒质量得杜仲粗胶。以石油醚作为溶剂在90℃下回流提取26h，将提取液置于-20℃低温冷冻3h，待杜仲胶析出后除去(自然挥发)或回收石油醚(离心收集)，将提取的杜仲精胶置于37℃烘箱中烘干。
[0085]
结果表明，不同组别提取的杜仲胶，其分子量呈现出明显的5个峰，这一结果与报道相似。在高分子量分布峰中，各组别提取的杜仲胶平均分子量(-mw)均显著高于对照组(未经预处理)。其中，发酵组平均分子量最高达29.283
×
104，超出对照组近20倍(对照组分子量为1.701
×
104)。

技术特征：

1.重组表述载体，其特征在于：以paur101为基础载体，将乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase，adh)基因启动子序列(padh1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)基因终止子序列连接到表达载体paur101上，得到中间表达载体paur101-padh1，再将里氏木霉(t.reesei)内切葡聚糖酶cel5a基因或里氏木霉(t.reesei)外切葡聚糖酶cel6a基因分别连接到中间载体上得到重组表述载体，所述cel5a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cel6a基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的重组表达载体，命名为paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a，其结构如图2或图3所示。3.重组酿酒酵母工程菌，含有权利要求2所述的重组表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a。4.根据权利要求3所述的工程菌，所述的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株为invsc1
#
，具有氨苄和卡纳抗性。5.一种利用重组酿酒酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法，采用如下顺序步骤：1)杜仲叶发酵预处理：将自然风干的杜仲叶片破碎至2-4mm的组织碎屑，加入0.1g/l sds，50％乙醇，超声处理；之后煮沸除去叶绿素，过滤后备用；2)杜仲叶发酵工艺：活化权利要求3或4中含有cel5a基因和cel6a基因的两种重组酿酒酵母工程菌，添加预处理过的杜仲叶，进行发酵，发酵工艺条件为料液比1:10，发酵30℃，ph 7，发酵120h；3)提取杜仲胶：取出发酵固形物，过滤、自然风干后以石油醚为溶剂，加热回流，然后将溶液冷却析出沉淀，沉淀自然风干即为杜仲胶。6.根据权利要求5所述的方法，其中两种重组酿酒酵母工程菌的体积比为1：1。7.根据权利要求5所述的方法，所述活化为重组酿酒酵母工程菌按接种比1:100接种于5l马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose，pd)中并发酵，所述重组酿酒酵母工程菌的制备方法，将权利要求2中表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a经酶切验证后导入大肠杆菌(e.coli dh5α)；然后利用stu i酶切线性化，经胶回收纯化后热激法对受体酿酒酵母菌进行转化，热激条件为：42℃，热击30min。8.根据权利要求7所述的方法，所述表达载体paur101-padh1::cel5a或paur101-padh1::cel6a的构建方法为：以paur101为基础载体，将乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase，adh)基因启动子序列(padh1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，nos)基因终止子序列连接到表达载体paur101上，构建中间表达载体paur101-padh1，再将里氏木霉(t.reesei)内切葡聚糖酶cel5a基因或里氏木霉(t.reesei)外切葡聚糖酶cel6a基因连接到中间载体上而得到，所述cel5a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cel6a基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。9.根据权利要求8所述的方法，所述cel5a基因或cel6a基因连接到中间载体上的方法为利用bam hi和kpn i双酶切paur101-padh1，经由t4 dna连酶连将cel5a及cel6a基因分别连接在中间载体上，并最终构建成表达载体paur101-padh1::cel5a和paur101-padh1::cel6a。10.根据权利要求5所述的方法，所述超声处理为：以20khz的超声频率，45℃处理，超声30min，所述煮沸温度为80℃；所述回流为在90℃下热回流提取12h；所述冷却为将溶液置
于-20℃下冷却3h；所述的杜仲叶片均来自杜仲品种华仲6号(eucommia ulmoides l.var.huazhong no.6)、树龄为3年生的树木中段叶片。

技术总结

本发明公开一种利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法。该方法的主要步骤包括：建含有里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因Cel5A/Cel6A的表达载体，导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)构建工程酵母菌，并利用工程酵母对超声预处理后的杜仲叶片进一步酶解以实现对杜仲胶的完全释放，对发酵产物利用索氏提取纯化杜仲胶，实现对杜仲胶的充分提取。本发明方法无需高浓度碱液酸液裂解、多次反复冲洗，避免了橡胶在提取过程中形态结的破坏，减少了提取过程中有害废液的产生，对实现杜仲胶的绿提取具有指导意义。实现杜仲胶的绿提取具有指导意义。