具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶及应用

具有激活植物免疫功能的
α-甘露糖苷酶及应用
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，涉及一种具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶及应用，具体涉及一种水稻内生放线菌分泌的具有激活植物免疫功能的新型α-甘露糖苷酶sham1及其应用。

背景技术：

2.在长期的进化过程中，植物面对复杂的微生物环境，逐步进化出了复杂的免疫识别机制来识别外源微生物，进而激活免疫途径中下游一系列的防御反应，包括活性氧迸发、胼胝质沉积、防御通路相关基因的表达以及诱导过敏性坏死反应，最终导致植物免疫力和抗病性增强，其中诱导植物免疫并产生抗性的激发子包括糖类、蛋白多肽类、脂类以及小分子代谢产物类等，在农业生产中可开发应用为植物免疫诱抗剂。相较于化学农药的残留污染与抗性育种面临抗病性易丧失的问题，植物免疫诱抗剂的应用是广泛、长期的防治策略。
3.近年来，免疫激活物质的研究主要聚焦于病原菌来源的激发子，如大豆疫霉来源的蛋白激发子糖基水解酶xeg1、谷氨酰胺转移酶gp42和糖类激发子乙酸丁乙酯，稻瘟病菌来源的蛋白激发子mohrip1和mohrip2、次级代谢产物激发子脑苷脂等。但关于益生菌来源的激发子鉴定研究则相对较少。作为稳定生活在健康宿主体内的内生菌，其积极调控宿主免疫方面的能力与方式则更具适应性优势，因此，开拓内生菌领域的免疫激发子具有良好的农业应用前景。
4.α-甘露糖苷酶是一类参与蛋白质的n-糖基化的重要蛋白酶，其功能是剪切甘露糖残基的甘露糖α-1,2、α-1,3、α-1,6糖苷键，形成各种构型的n-寡糖。目前，已报道的α-甘露糖苷酶多是研究其酶活特性和水解机制，然而，迄今为止，α-甘露糖苷酶在植物与微生物互作过程中作为诱导植物免疫的激发子还未见报道。

技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶及应用，该α-甘露糖苷酶从水稻内生放线菌osish-2中分离鉴定得到，是一种新型的分泌型蛋白，不仅可有效激发并诱导宿主活性氧迸发、胼胝质积累和免疫通路相关基因上调等免疫响应，而且可以使宿主保持在一种“预备”状态，从而能够增强宿主的抗病能力，有效且节能地抵御随后的病菌(如稻瘟病菌)侵染，阻止或减轻病害的发生，因而本发明α-甘露糖苷酶能够作为植物与微生物互作过程中诱导植物免疫的激发子，可作为植物免疫诱抗剂的有效成分，广泛用于激活并提升植物(如水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄和本氏烟草)的免疫激活能力，在农业生产中具有广阔的应用前景。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
7.一种具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶，所述α-甘露糖苷酶为如a)或b)或c)或d)所示的蛋白质；
8.a)氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质；
9.b)在如seq id no.2所示的蛋白质的n端连接标签得到融合蛋白；
10.c)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
11.d)与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且相同功能的蛋白质。
12.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种编码上述的具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶的编码基因。
13.上述的编码基因，进一步改进的，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
14.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体携带有上述的编码基因。
15.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞的基因组中含有上述的编码基因或含有上述的重组表达载体。
16.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的α-甘露糖苷酶或上述的编码基因或上述的重组表达载体或上述的重组宿主细胞在防治稻瘟病菌中的应用。
17.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种植物免疫诱抗剂，所述植物免疫诱抗剂含有有效含量的如上述的α-甘露糖苷酶或由上述的编码基因或上述的重组表达载体或上述的重组宿主表达后得到的α-甘露糖苷酶。
18.上述的植物免疫诱抗剂，进一步改进的，所述植物免疫诱抗剂中α-甘露糖苷酶的浓度为150nm至3μm。
19.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的植物免疫诱抗剂在提高植物抗稻瘟病菌能力中的应用。
20.上述的应用，进一步改进的，所述应用包括以下处理：将植物免疫诱抗剂喷洒到植物的叶片表面；所述植物为水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄或本氏烟草。
21.与现有技术相比，本发明的优点在于：
22.针对现有技术中未涉及具有激活植物免疫和抗病功能的α-甘露糖苷酶等缺陷，本发明首次提出了一种具有激活植物免疫和抗病功能的α-甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶为氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质，或为在如seq id no.2所示的蛋白质的n端连接标签得到融合蛋白，或为将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质，或为与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且相同功能的蛋白质。与其他现有α-甘露糖苷酶相比，本发明的α-甘露糖苷酶具有以下优势：从水稻内生放线菌osish-2中分离鉴定得到，是一种新型的分泌型蛋白，不仅可有效激发并诱导宿主活性氧迸发、胼胝质积累和免疫通路相关基因上调等免疫响应，而且可以使宿主保持在一种“预备”状态，从而能够增强宿主的抗病能力，有效且节能地抵御随后的病菌(如稻瘟病菌)侵染，阻止或减轻病害的发生，因而本发明α-甘露糖苷酶能够作为植物与微生物互作过程中诱导植物免疫的激发子，可作为植物免疫诱抗剂的有效成分，广泛用于激活并提升植物(如水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄和本氏烟草)的免疫激活能力，在农业生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
24.图1为本发明实施例1中重组蛋白sham1的凝胶电泳条带图。
25.图2为本发明实施例1中重组蛋白sham1在不同抑制剂条件下的酶活性对比图。
26.图3为本发明实施例1中重组蛋白sham1在不同ph值条件下的酶活性对比图。
27.图4为本发明实施例1中重组蛋白sham1在不同温度条件下的酶活性对比图。
28.图5为本发明实施例1中重组蛋白sham1在不同金属离子条件下的酶活性对比图。
29.图6为本发明实施例1中重组蛋白sham1灭活或酶活抑制后的酶活性对比图。
30.图7为本发明实施例1中不同重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导水稻过敏反应和浓度依赖性的效果图。
31.图8为本发明实施例1中重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导不同植物过敏反应的广谱诱抗效果图。
32.图9为本发明实施例2中重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导激活水稻免疫响应时在不同诱导时间条件下对应的叶片上过氧化氢积累量变化图。
33.图10为本发明实施例2中重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导激活水稻免疫响应时在不同诱导时间条件下对应的叶片上胼胝质沉积量变化图。
34.图11为本发明实施例2中重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导激活水稻免疫响应时对应的叶片上不同信号通道相关基因的表达量效果图。
35.图12为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片上过氧化氢积累量变化图。
36.图13为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片上胼胝质沉积量变化图。
37.图14为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片上基因osaos2的表达量变化图。
38.图15为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片上基因oslox2的表达量变化图。
39.图16为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片病斑实物图。
40.图17为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片病斑损坏程度统计图。
41.图18为本发明实施例3中经重组蛋白sham1诱导激活防御反应且感染稻瘟病菌后水稻叶片生物量统计图。
具体实施方式
42.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
43.以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售，所采用工艺为常规工艺，所采用设备为常规设备。
44.实施例1：具有激活植物免疫功能和抗病功能的α-甘露糖苷酶(sham1)的鉴定
45.1、cdna的获得
46.将水稻内生放线菌s.hygroscopicus osish-2孢子液接种于ispii液体培养基，30℃、170rpm培养7d，过滤后得到osish-2发酵液。逐步分离得到具有过敏反应活性的蛋白组分，进行纳升液相谱-串联质谱分析法(thermo scientific,ltq orbitrap velos pro)鉴定。通过比对osish-2全基因组搜库比对确定了15个水解酶类的候选蛋白。
47.本发明中，采用的水稻内生放线菌s.hygroscopicus osish-2(原命名为streptomycessp.osish-2，详见ncbi)，其保藏编号为cgmcc no.8716，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，经检测存活。
48.osish-2基因组rna的提取是采用上海生工rna试剂提取盒，将得到的rna使用诺唯赞的逆转录试剂盒进行cdna的合成，得到osish-2的cdna。
49.2、pcr扩增
50.以步骤1中获得的osish-2的cdna为模板，用takara的prime star高保真dna聚合酶扩增sham1编码序列全长，pcr体系为：25μl 2
×
phanta max buffer，10μl 5
×
pcr enhancer，8μl ddh20，引物sham1-f(10μm)和sham1-r(10μm)各2μl，1μl cdna模板，1μldntp mix(10mm)，1μl super-fidelity dna polymerase。
51.采用的sham1编码序列的全长特异性引物如下：
52.上游引物sham1-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为：5
’‑
ctcggtaccctcgag ggatccatgccctcaag-3’；
53.下游引物sham1-r的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体为：5
’‑
gacaagcttgaatcc ggatcctcagccgcg-3’。
54.在上游引物sham1-f和下游引物sham1-r中，下划线标出的是原核表达载体pcold tf克隆位点两端的同源序列。
55.pcr反应程序为：预变性95℃ 5min，变性95℃30sec，退火58℃15sec，延伸72℃4min，彻底延伸72℃3min，36个循环。
56.上述pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，按照胶回收试剂盒(上海生工)说明书对pcr产物进行回收，将洗脱下的dna样品放在-20℃冰箱备用。
57.以bamh i作为pcold tf线性载体的酶切位点，将上述回收到的sham1的基因片段构建到原核表达载体pcold tf中并通过热激法转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，并均匀涂布在固体lb培养基(kana)上。菌落pcr鉴定到阳性单菌落之后，由上海生工进行测序。测序结果表明：扩增产物中具有序列表的seq id no.1所示的开放阅读框，编码序列表的seq id no.2所示的蛋白质。将如seq id no.2所示的蛋白质命名为sham1蛋白，将如seq idno.1所示的核苷酸序列命名为sham1基因，其中seq id no.1所示的sham1编码基因全长核苷酸序列含有3279个碱基，如seq id no.2所示的sham1全长蛋白序列含有1092个氨基酸。
58.如seq id no.1所示的sham1编码基因全长核苷酸序列为：
59.atgccctcaagacccctggccgccctggcggccgcggccctgaccgcggggctcctcgccaccgcggccaccgcgcccgcgtcggccgccgcgccgccgccgctggtcaaggacccggcggcgtacgtcgatccgctgatcggcagcgcggccggcggcgacaccttccccggcgccgtcgtccccttcggcatgctctcgtggagcccggagaacaccc
gcggagacgccacccgcaccgtcgcgcccggcggttaccactacgacgccacccgcgtccgcggcttcagcctgacccatatgtccggcaccggctgtgcgggcggcgcgggtgacatccccttcttcccgcacgtgggcgaggtcacctcctcacccgccgccgacaccaaggaccaggtctacgcctccggcttcagccactccgacgagaccgcggaacccggccgctaccgggtcggcctcgcctccggtgccggcgccgagctgaccgccaccgcccacaccggatcggcccgcttcacctaccccgcggacaagaccgcctccctgctgatccgcacctcctcctccgaggtcggcagctccgccgccgacctcaccatcgacccggcgcaccgcaccgtctccggctccgtcaccagcggcaacttctgcggctacctcgaccccgagggccgccgcagctactacacgctgcacttcaccgccgtcttcgacaccgcgttcaccgcccagggcacctggcaggacggcaccctgcggcccggcacgaccaccgtcgagggcggcaccggctacggcagcgacggccgtccggtcgccggcaagggctccggcggctacctccagttcgccccgggcacccgccgggtgggcgtcaaggtcggcatcagctacgtcgacgacaagggcgcccgcgccaacctcgccgccgagaacccgccgcgccgcggcttcgaccaggtgcggacggccgcgtacgacgcctggcggcgtcagctgtccgcgatccgggtcggcggcggcgcggacgcggaccgcaccaccttctacaccgcgctctaccactcgctgctgcaccccaacgtcatcagcgacaccgacggccgctaccggggcggcgacggtgaggtgcaccgggtgagccggggccaccgggcccagtacggcaccttctccggctgggacgtctaccgctcccaggtccagctgctcaccctgctggagccggacaagggctccgacatcgcccagtccctgctcaacctcgcccggcagaacggcggcatctgggaccgctggctccagggcgcctccgggacgcatgtgatgaacggcgatccgtcggccgccgccctcgccggaatccgggccttcggcggcagccgcttcgacctcgacgccgccctcgactcgctcctcaaggcggccaccgtgccgaccgacaaggacctcagcccggcgggcaagcccatcatgtcggtcggccagcggccctcgctcgaccagtacctgaagctgcactacatgccgtccgtctccaacgcctggggcggcgcggccgagaccctggagatgtccggcgcggacttcgccctctcccagctggcgcgggcggcggggcggaagtccaccgccgacaccttcgcccgccgcgcccagtggtggcagaacaacttcaacgccgccgccgacccggagaccggcggctacatcgccaaccgcaaggccgacggcagctgggtcaccggcttcaccccggccaccggcaacggcttcgtggagggcaccagcgcccagtacacctggatggtcccgcacaaccccgccggtctcttcgccgccatgggcggcaaggacgccgcggtcaagcggctggacgccttcttccacgacgccgacggggactgggcgctgacgggggcgggcggcgagaagtccgcactggacaacgagccgtcgatcaacgtcccctatctgtacgcgtacgctggccagccgtacaagacccaggagaccgtgcgcgccgcgatgcgccggctgtggaccaccaagcccggcggcatccccggcaacgacgacctcggcgagatgtcctcgtggtacgtcttctccgccctcggcatgtacccgcaggtgccctcccgcgccgaactggtcctggcctcgcccctcttcccgcggatcgagatcgagcgcggcagcagggacatctccatccgcgccccgcaggccgcgcccggcgcgccgtacgtccacgcgctgaaggtgaacgggcgggcgagtgaccgcccctggctgccggagaccttcgtacggcacggcggaacgctggactacaccctctccgacgctcccgaccgcggctggggctcggcgccgtccgacgcgccgccctccttccgcgagggcgagcagccgtaccagatcggggtcgggccgaccgcgggcacgctcgccccgggcgaggccctgaccgtgaaggtggccgccgtcccggtcagcgagggcgaccgccccgaggtgcgcttcaccaccgacgcccccgacgggctcaccgcctcacccgcctccgggacggtcgggccggacggcacggcggagatctcgctgcgcgcggggaagggcacggccgagggcttctacgacgcgaaggtgacggtgaccagcgaggacaccgaggtcgtccagccgatcacactgaccgtcgccgcgcccggcaccctgctcgccgcgtacaacaacgtcggcgcgaccgaggacgagggcgaccacgacgagggcgactacgacggcggcggctggagctactcccggcaggccctcgccgcggccggtctcgagccgggcgccgaggccaccgtccagggcctggacttcacctggcccgcctccccggccggccgccccgacaacgcctcggccaccggccagaccatcggcctcccggcctccaccgccctgtccttcatcggcagcgccgtcaacggcaaccagaaggccacggccaaggtcacctacacggacggcagtacggacaccgcggacctgtccttcaccgactggacggtgggaggcggtggcggaacggtccagtacggcaacgtgaccgtggcaaagaccccgtaccgcaacatcagcggcggcgacaaggacgtggtggacgcctacatcttcgcca
cgaaggcgttccgggcgcccgagggcaagaccatcaagagcgtcaccctgccggacaacgcggatctccacgtcttcgcggtggcccgcggctga。
60.如seq id no.2所示的sham1全长蛋白序列为：
61.mpsrplaalaaaaltagllataatapasaaappplvkdpaayvdpligsaaggdtfpgavvpfgmlswspentrgdatrtvapggyhydatrvrgfslthmsgtgcaggagdipffphvgevtsspaadtkdqvyasgfshsdetaepgryrvglasgagaeltatahtgsarftypadktasllirtsssevgssaadltidpahrtvsgsvtsgnfcgyldpegrrsyytlhftavfdtaftaqgtwqdgtlrpgtttveggtgygsdgrpvagkgsggylqfapgtrrvgvkvgisyvddkgaranlaaenpprrgfdqvrtaaydawrrqlsairvgggadadrttfytalyhsllhpnvisdtdgryrggdgevhrvsrghraqygtfsgwdvyrsqvqlltllepdkgsdiaqsllnlarqnggiwdrwlqgasgthvmngdpsaaalagirafggsrfdldaaldsllkaatvptdkdlspagkpimsvgqrpsldqylklhympsvsnawggaaetlemsgadfalsqlaraagrkstadtfarraqwwqnnfnaaadpetggyianrkadgswvtgftpatgngfvegtsaqytwmvphnpaglfaamggkdaavkrldaffhdadgdwaltgaggeksaldnepsinvpylyayagqpyktqetvraamrrlwttkpggipgnddlgemsswyvfsalgmypqvpsraelvlasplfprieiergsrdisirapqaapgapyvhalkvngrasdrpwlpetfvrhggtldytlsdapdrgwgsapsdappsfregeqpyqigvgptagtlapgealtvkvaavpvsegdrpevrfttdapdgltaspasgtvgpdgtaeislragkgtaegfydakvtvtsedtevvqpitltvaapgtllaaynnvgatedegdhdegdydgggwsysrqalaaaglepgaeatvqgldftwpaspagrpdnasatgqtiglpastalsfigsavngnqkatakvtytdgstdtadlsftdwtvgggggtvqygnvtvaktpyrnisggdkdvvdayifatkafrapegktiksvtlpdnadlhvfavarg。
62.在碳水化合物活性酶数据库(cazy)中，sham1属于糖基水解酶92(glycoside hydrolase family 92,gh92)家族。信号肽预测sham1包含一个有30个氨基酸残基的信号肽(signalp5.0)，说明sham1为分泌蛋白，分子量为113.7kda。
63.将测序成功的重组质粒通过热激法转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。bl21菌株活化后在16℃110rpm过夜诱导表达，根据说明书用ni-nta琼脂糖(thermo scientific)纯化后得到重组蛋白sham1，经同样方式表达纯化的空载pcold tf蛋白为对照。
64.图1为本发明实施例1中重组蛋白sham1的凝胶电泳条带图。重组蛋白sham1的理论分子量为161.7kda，即113.7kda的sham1蛋白和48kda伴侣蛋白tf。如图1所示，重组蛋白sham1在大肠杆菌bl21中诱导表达并通过ni-nta琼脂糖纯化后，sds-page凝胶电泳检测到目的条带在170kda附近，说明重组蛋白sham1诱导并纯化成功。
65.为验证实施例1中重组蛋白sham1是否具有α-甘露糖苷酶活性，在最终浓度为5mm的条件下，以4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃甘露糖苷和刺槐豆胶为活性底物检测α-甘露糖苷酶活性，以4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷为底物检测葡糖糖苷酶活性，以微晶纤维素为底物检测纤维素酶活性，以木聚糖为底物检测木聚糖酶活性。150μl底物与50μl的重组蛋白sham1，在ph 5.5、100mm mes缓冲液中40℃反应12h。其中，采用dns法测定刺槐豆胶、微晶纤维素和木聚糖还原糖含量。硝基苯基类底物(4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷)的酶活测定是用50μl 10％ na2co3终止后，在405nm波长下检测所产生的硝基苯酚含量，结果如图2和表1所示。
66.结果发现sham1仅对4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷有特异性酶活(见表1)。进一
步用α-甘露糖苷酶特异性抑制剂—苦马豆素(0.1mm)与sham1孵育，其降解4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷的酶活下降了89.9％(见图2)。根据生物信息学分析和酶活特性，确证本发明sham1为一种α-甘露糖苷酶。
67.表1 sham1对不同类型底物的水解活性检测
68.不同类型底物相对酶的活性(％)以4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷1004-硝基苯基-β-d-吡喃甘露糖苷nd4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷nd4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷nd刺槐豆胶nd微晶纤维素nd木聚糖nd
69.注：表1中，nd表示未检测到酶活性
70.sham1酶活最适ph的研究：配置100mm的mes缓冲液(ph 3-12)，取不同ph的mes缓冲液150μl配制5mm 4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷，加入50μl重组蛋白sham1在40℃的条件下反应12h，用50μl 10％ na2co3终止后，在405nm波长下检测所产生的硝基苯酚含量。以酶活力的最大值为100％，其他处理的活性折算成相应比例。如图3所示，sham1酶活最佳ph值为5.5。
71.sham1酶活最适温度的研究：150μl的ph 5.5 100mm的mes缓冲液配制5mm 4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷，加入50μl重组蛋白sham1在20-65℃的条件下反应12h，用50μl 10％ na2co3终止后，在405nm波长下检测所产生的硝基苯酚含量。以酶活力的最大值为100％，其他处理的活性折算成相应比例。如图4所示，sham1酶活最佳温度为40℃。
72.金属阳离子对sham1酶活性的影响研究：用ph 5.5 100mm的mes缓冲液配制5mm金属阳离子(mg
2+
，ca
2+
，co
2+
，zn
2+
，ni
2+
，fe
2+
，cu
2+
，mn
2+
，pb
2+
，al
3+
，fe
3+
，na
+
，k
+
)。用以上含金属阳离子的mes缓冲液配制5mm 4-硝基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷，加入50μl重组蛋白sham1在40℃的条件下反应12h，用50μl 10％ na2co3终止后，在405nm波长下检测所产生的硝基苯酚含量。以酶活力的最大值为100％，其他处理的活性折算成相应比例。如图5所示，ca
2+
对sham1的活性有显著的促进作用，增加了173.63％，而其他金属离子如zn
2+
、cu
2+
和pb
2+
对sham1的活性有较强的抑制作用。
73.sham1酶活与免疫诱导的相关性研究：将3mm sham1重组蛋白在100℃高温预孵育20min或用40mm苦马豆素抑制剂预孵育1h后，渗入本氏烟草叶片，监测过敏反应活性。如图6所示，通过两种灭活处理的sham1都不能诱导本氏烟草中的过敏反应，说明sham1诱导水稻免疫应答依赖于其α-甘露糖苷酶活性。
74.考察不同浓度重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)诱导植物过敏反应和广谱诱抗性：将不同浓度的重组蛋白sham1(植物免疫诱抗剂)喷施在籼稻9311水稻的活体叶片上，监测到2天后sham1诱导水稻叶片产生的过敏反应。如图7所示，随着sham1浓度从150nm增加到3μm，叶片过敏反应程度增强，且浓度为3μm时，对水稻叶片产生强烈的过敏反应。
75.同时，将3μm的sham1注射不同植物叶片上并渗透到叶片中。如图8所示，sham1能诱导拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄和本氏烟草的过敏反应。
76.本发明中，α-甘露糖苷酶为在如seq id no.2所示的蛋白质的n端连接标签得到融合蛋白，或为将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质，或为与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且相同功能的蛋白质时，也如α-甘露糖苷酶(sham1)一样具有激活植物免疫功能和抗病功能，也能够作为植物与微生物互作过程中诱导植物免疫的激发子，因而将它们作为植物免疫诱抗剂的有效成分，广泛用于激活并提升植物(如水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄和本氏烟草)的免疫激活能力。
77.实施例2：sham1激活水稻免疫响应
78.将实施例1中浓度为3μm的重组蛋白sham1喷施处理籼稻9311水稻的活体叶片，取不同时间点的叶片样品观察过氧化氢产生、胼胝质沉积和下游防御相关基因的表达水平。经同样方式表达纯化的空载pcold tf蛋白为对照。
79.将剪下的叶片用1mg/ml 3,3
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二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)染8-12h，染结束后用无水乙醇在沸水浴中脱，待叶绿素完全脱去后在体式显微镜(mshot,mz62)下观察，棕褐斑块即为所积累的过氧化氢。如图9所示，过氧化氢在0.5h开始在叶脉周围迅速积累，48h达到峰值随后积累量降低。
80.过氧化氢积累会进一步诱发胼胝质沉积。取样叶片先用无水乙醇脱至完全透明，70mm ph 9.0的磷酸钠缓冲液冲洗数遍后，用0.01％苯胺蓝染液(70mm ph 9.0磷酸钠缓冲液现配现用)染1-2h。如图10所示，在荧光显微镜(nikon,ts2r-fl)下观察到胼胝质在24h被诱导产生，且48h达到峰值随后沉积量降低，显然，它的变化趋势与过氧化氢积累量的变化趋势一致。
81.使用上海生工rna提取试剂盒并按照说明书提取sham1处理6h后的水稻叶片rna，并逆转录成cdna。如图11所示，实时荧光定量qpcr(bio-rad,cfx96touch)结果显示，水杨酸信号通路相关基因ospr1a和ospbz1、茉莉酸信号通路的相关基因osaos2和oslox2以及两信号通路节点的osmpk6、oswrk70基因均被激活表达。因此，sham1具有良好的诱导水稻免疫响应能力，适合用于提高水稻抗病性的应用。
82.实施例3：sham1预处理启动防御反应并增强水稻对稻瘟病菌的抗性
83.将实施例2中sham1预处理后的水稻活体接种稻瘟病菌孢子(浓度为5
×
105孢子/毫升，含0.02％吐温20)，按照实施例2中的方式观察过氧化氢、胼胝质和防御基因的响应。如图12所示，处理组和对照组水稻叶片中均观察到显著的活性氧爆发，其中处理组水稻中过氧化氢在稻瘟病菌侵染4h(hpi)后迅速积累，而对照组水稻的过氧化氢在24hpi后才开始大量积累，并剧烈增加，最终由于过氧化氢积累量过多导致细胞死亡。如图13所示，处理组水稻的胼胝质沉积也比对照组水稻提前发生至少4h，且数量也显著增加。结合图12和图13可知，过氧化氢与胼胝质更快或更强的积累都说明了sham1预处理使水稻保持在一种“预备”状态，能有效且节能地抵御随后的稻瘟病菌入侵。如图14和图15所示，按照实施例2中的方式提取rna，实时荧光定量qpcr检测信号通路相关基因的表达水平发现，茉莉酸生物合成相关基因osaos2和oslox2的表达在处理组水稻中被强烈触发，而在对照组水稻中仅有少量激活，说明sham1预处理后水稻特异性地启动了茉莉酸通路信号的响应以抵抗稻瘟病菌。
84.将实施例2中sham1预处理后的水稻叶片离体接种10μl稻瘟病菌孢子液(浓度为5
×
105孢子/毫升，含0.02％吐温20)，通过测定叶片病斑长度和稻瘟病菌生物量来检测水稻
叶片的抗病能力。如图16和图17所示，sham1预处理后接种稻瘟病菌的水稻(处理组)病斑损坏程度显著低于直接接种稻瘟病菌的水稻(对照组)，减少45.9％；如图18所示，按照实施例2中的方式提取rna，实时荧光定量qpcr显示，处理组的稻瘟病菌的相对生物量较对照组减少了约66.3％。因此，本发明sham1可作为植物免疫诱抗剂用于增强水稻对稻瘟病菌的抗性。
85.综上可知，本发明的α-甘露糖苷酶是从水稻内生放线菌osish-2中分离鉴定得到，是一种新型的分泌型蛋白，不仅可有效激发并诱导宿主活性氧迸发、胼胝质积累和防御/免疫通路相关基因上调等免疫响应，而且可以使宿主保持在一种“预备”状态，从而能够增强宿主的抗病能力，有效且节能地抵御随后的病菌(如稻瘟病菌)侵染，阻止或减轻病害的发生，因而本发明α-甘露糖苷酶能够作为植物与微生物互作过程中诱导植物免疫的激发子，可作为植物免疫诱抗剂的有效成分，广泛用于激活并提升植物(如水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄和本氏烟草)的免疫激活能力，在农业生产中具有广阔的应用前景。另外，本发明α-甘露糖苷酶(sham1)属于一种新型的α-甘露糖苷酶，且sham1诱导抗性是依赖于其α-甘露糖苷酶活性的；与此同时，本发明中sham1作为植物内生菌来源的免疫诱抗蛋白，其浓度在150nm至3μm范围内均有效果且都具有较广谱的诱抗性，具有较高的环境和生物安全性，可开发为一种潜在的免疫诱抗剂。同时，本发明提出的α-甘露糖苷酶(sham1)，也对植物与内生菌互作机制的破解提供了新的思路，有望作为一种来源于植物益生菌的新型微生物蛋白，为今后生物农药的开发与应用提供了有用资源。
86.以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶，其特征在于，所述α-甘露糖苷酶为如a)或b)或c)或d)所示的蛋白质；a)氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质；b)在如seq id no.2所示的蛋白质的n端连接标签得到融合蛋白；c)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有85％或85％以上的同源性且相同功能的蛋白质。2.一种编码权利要求1所述的具有激活植物免疫功能的α-甘露糖苷酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有权利要求2或3所述的编码基因。5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞的基因组中含有权利要求2或3所述的编码基因或含有权利要求4所述的重组表达载体。6.一种权利要求1所述的α-甘露糖苷酶或权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组宿主细胞在防治稻瘟病菌中的应用。7.一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂含有有效含量的如权利要求1所述的α-甘露糖苷酶或由权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组宿主表达后得到的α-甘露糖苷酶。8.根据权利要求7所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂中α-甘露糖苷酶的浓度为150nm至3μm。9.一种如权利要求7或8所述的植物免疫诱抗剂在提高植物抗稻瘟病菌能力中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下处理：将植物免疫诱抗剂喷洒到植物的叶片表面；所述植物为水稻、拟南芥、辣椒、黄瓜、番茄或本氏烟草。

技术总结

本发明公开了一种具有激活植物免疫的α-甘露糖苷酶及应用，该α-甘露糖苷酶为氨基酸序列是如SEQ ID NO.2所示的蛋白质，或为如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白、具有85％或85％以上的同源性且相同功能的蛋白质。本发明α-甘露糖苷酶，可有效激发并诱导宿主活性氧迸发、胼胝质积累和免疫通路相关基因上调等免疫响应，也可使宿主保持在一种“预备”状态，能够增强宿主的抗病能力，有效且节能地抵御随后的病菌侵染，阻止或减轻病害的发生，能够作为植物与微生物互作过程中诱导植物免疫的激发子，因而可作为植物免疫诱抗剂的有效成分，广泛用于激活并提升植物的免疫激活能力，在农业生产中具有广阔的应用前景。广阔的应用前景。广阔的应用前景。