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一种引起呼吸道症状的病原体联检的组合物的制作方法

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及甲流、乙流、新型冠状病毒和艾滋病毒的联检的组合物、方法和用途，更具体地涉及甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株以及艾滋病毒的联检的组合物、方法和用途。

背景技术：

2.基于流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期为1～14天，症状主要是发热、乏力、干咳，重症患者表现为呼吸困难、脓毒症休克、出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒等。作为一种rna病毒，新冠病毒最大的特点之一就是容易变异，从变异株阿尔法(alpha b.1.1.7)到贝塔(beta b.1.351)，再到伽玛(gamma p.1)和德尔塔(delta b.1.617.2)，每次变异，新冠病毒都携带着更强的传播力,世界卫生组织(who)在最新的全球新冠疫情中表示，奥密克戎ba.4和ba.5变异株已经取代之前的ba.2成为全球主要毒株，且两者的比例还在不断上升。两者的上升都与其含有增强其感染性的突变有关。且ba.4/ba.5上增加了一些新的突变，具有极强的传染性和免疫逃逸能力，可能影响检测试剂及疫苗的效果。
3.流感病毒是正粘病毒科中的单分子负链rna病毒，根据核蛋白和m蛋白抗原的不同，可将流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)3型。甲(a)型流感病毒能感染人、猪、马和禽类；乙(b)型流感病毒仅感染人类且致病性较低。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的，甲型流感危害最大，主要通过飞沫或气溶胶经呼吸道传播，短时间内在人中突然发生并迅速蔓延，造成不同规模的流行；甲型流感病毒又分许多亚型，至今ha有16个亚型，na有9个亚型。其中h1n1/h3n2主要感染人类。
4.艾滋病(aids)是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(hiv)引起，hiv是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的cd4t淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并发生恶性肿瘤，病死率较高。艾滋病毒存在于感染的人的血液、精液或阴道分泌液中，以带病毒的体液进行传染，潜伏期可长达几年。呼吸道症状表现为长期咳嗽、胸痛、呼吸困难、严重时痰中带血。艾滋病已被我国列入乙类法定传染病，并被列为国境卫生监测传染病之一。
5.一种临床表现可由多个病原体引起，为临床早期诊断带来了困难，不同的病毒其临床方式可能不一样。同时一个个体可能同时存在多个感染。对于易感染病毒而言，需要尽早发现，尽早，且及时控制传染源，阻断传播途径。区分这些病毒感染，对后续的防控、以及采取针对性的措施提供指导，因此本领域需求一种能够同时检测并区分甲流、乙流、新型冠状病毒ba.4/ba.5和艾滋病毒的相关产品。

技术实现要素：

6.有鉴于此，第一方面，本发明提供一种引起呼吸道症状的病原体联检的组合物，包
括：
7.第一核酸组合物：
8.如seq id no:1～3所示的检测甲流h1n1的上下游引物和探针；和
9.如seq id no:4～6所示的检测甲流h3n2的上下游引物和探针；
10.第二核酸组合物：
11.如seq id no:7～9所示的检测乙流by的上下游引物和探针；和
12.如seq id no:10～12所示的检测乙流bv的上下游引物和探针；
13.第三核酸组合物：
14.如seq id no:13～15所示的检测新型冠状病毒变异株ba.4、ba.5的上下游引物和探针；以及
15.第四核酸组合物：
16.如seq id no:16～18所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。
17.本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株的检测和区分。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/ml，检测更为准确。
18.进一步地，所述组合物包括第五核酸组合物。
19.所述第五核酸组合物为：检测内标的上下游引物及探针。
20.在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。
21.在一些具体的实施方案中，用于检测内标的上下游引物及探针为如seq id no:19所示的内标上游引物、如seq id no:20所示的内标下游引物，和如seq id no:21所示的内标探针。
22.进一步地，本发明第一、第二、第三和第四核酸组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
23.在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
24.进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
25.本发明的组合物可以任意组合成检测对应6个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
26.举例来说，可以包括上述6对引物和探针中的任意5对，可以包括上述6对引物和探针中的任意4对，可以包括上述6对引物和探针中的任意3对，可以包括上述6对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述6对引物和探针中的任意1对。
27.举例来说，还可以只包括第一核酸组合物；只包括第二核酸组合物；只包括第三核
酸组合物；只包括第四核酸组合物。
28.举例来说，还可以包括不同核酸组合物中不同对，举例来说可以包括第一核酸组合物中1对或2对引物和探针，和/或第二核酸组合物中1对或2对引物和探针，和/或第三组合物的引物和探针，和/或第四组合物的引物和探针。
29.在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
30.在一个具体的实施方案中，第一核酸组合物的探针的荧光报告基团为fam；第二核酸组合物的探针的荧光报告基团为hex；第三核酸组合物的探针的荧光报告基团为rox；第四核酸组合物的探针的荧光报告基团为cy5。
31.进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
32.进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。
33.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
34.进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μm；所述组合物中探针的用量为0.1～0.2μm。
35.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
36.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
37.进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
38.第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测引起呼吸道症状的病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体是甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株。
39.第三方面，本发明提供了一种检测引起呼吸道症状的病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
40.进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
41.在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株靶基因的片段质粒、片段rna、假病毒中的至少一种。
42.进一步地，所述试剂盒还包括dntps、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
43.更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及dna聚合酶中的至少一种。
44.更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntps、逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
45.进一步地，所述逆转录酶的浓度为5u/反应～15u/反应，例如逆转录酶可以是neoscript rt逆转录酶；所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
46.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、taq酶、mg
2+
、mn
2+
、rnasin、dntps、引物、探针和pcr缓冲液。
47.常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。
48.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
49.第四方面，提供了一种用于引起呼吸道症状的病原体联检的方法，所述方法包括以下步骤：
50.1)提取或释放待测样本的核酸；
51.2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
52.3)获得并分析结果。
53.在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、血液等，但不限于此。
54.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
55.逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
56.在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的引起呼吸道症状的病原体联检的方法，所述方法包括以下步骤：
57.1)提取或释放待测样本的核酸；
58.2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
59.3)获得并分析结果。
60.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
61.逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cdna预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
62.在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株以及艾滋病毒并罹患肺炎等呼吸道疾病的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有上述病原体。
附图说明
63.图1～4为本发明组合物检测结果图(分别为甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株以及艾滋病毒)；
64.图5～8为本发明组合物灵敏度结果图(分别为甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株以及艾滋病毒)；
65.图9为本发明组合物特异性结果图；
66.图10为本发明对比例组合物检测结果图。
具体实施方式
67.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
68.实施例1、本发明所使用的引物及探针
pcr反应管中，每管加入30μl pcr混合液，盖上管盖。
81.实时荧光pcr反应体系按照如下表2进行配置：
82.表2
[0083][0084][0085]
pcr扩增程序如下表3进行设置：
[0086]
表3
[0087][0088]
结果分析：
[0089]
1)目的检测信号为fam-1，hex(或vic)，rox，cy5；人基因内标检测信号为fam-2；
[0090]
2)baseline的设置：baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(end)比最早出现指数扩增的样本ct减少1-2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
[0091]
结果判读a.对于fam通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为甲流h1n1或h3n2毒株阳性。b.对于hex通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为乙流bv或by毒株阳性。c.对于rox通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为新冠ba.4或ba.5毒株阳性。d.对于cy5通道检测到典型的s型扩增曲线，且ct≤40的样本，报告为艾滋病毒阳性。
[0092]
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
[0093]
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株、艾滋病毒的假病毒样本进行验证，结果表明能够对甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株、艾滋病毒的检测并区分，检测结果如图1～4所示。
[0094]
实施例4、本发明组合物的灵敏度
[0095]
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行lod(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量pcr仪器上进行多重pcr检测。结果如图5～8所示，表明对低至200拷贝/ml的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为200拷贝/ml。
[0096]
实施例5、本发明组合物的特异性
[0097]
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，以冠状病毒(nl63，hku1，229e，oc43)、sars冠状病毒、mers冠状病毒、光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄葡萄球菌、丁酸酸菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、藤黄微球菌、马红球菌、格式李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图9显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的特异性好。
[0098]
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
[0099]
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
[0100]
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于检测甲型流感病毒h1n1/h3n2毒株、乙型流感病毒bv/by毒株、新型冠状病毒变异株ba.4/ba.5毒株、艾滋病毒。具体检测结果如图10所示，从图中可以看出扩增曲线荧光值低ct值靠后，因此，整体检测效果差。

技术特征：

1.一种引起呼吸道症状的病原体联检的组合物，包括：第一核酸组合物：如seq id no:1～3所示的检测甲流h1n1的上下游引物和探针；和如seq id no:4～6所示的检测甲流h3n2的上下游引物和探针；第二核酸组合物：如seq id no:7～9所示的检测乙流by的上下游引物和探针；和如seq id no:10～12所示的检测乙流bv的上下游引物和探针；第三核酸组合物：如seq id no:13～15所示的检测新型冠状病毒变异株ba.4、ba.5的上下游引物和探针；以及第四核酸组合物：如seq id no:16～18所示的检测艾滋病毒的上下游引物和探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四核酸组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物的探针的荧光报告基团为fam；所述第二核酸组合物的探针的荧光报告基团为hex；所述第三核酸组合物的探针的荧光报告基团为rox；所述第四核酸组合物的探针的荧光报告基团为cy5。4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第五核酸组合物，所述第五核酸组合物包括用于检测内标的上下游引物及探针。6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述用于检测内标的上下游引物及探针为如seq id no:19所示的内标上游引物、如seq id no:20所示的内标下游引物，和如seq id no:21所示的内标探针。7.权利要求1～6中任一项所述的组合物在制备引起呼吸道症状的病原体联检的试剂盒中的用途。8.一种引起呼吸道症状的病原体联检的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任一项所述的组合物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntps、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。10.一种用于以非诊断目的的引起呼吸道症状的病原体联检的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取或释放待测样本的核酸；2)使用如权利要求1～6中任一项所述的组合物或如权利要求8～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；3)获得并分析结果。

技术总结

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及甲型流感病毒H1N1/H3N2毒株、乙型流感病毒BV/BY毒株、新型冠状病毒变异株BA.4/BA.5毒株以及艾滋病毒的联检的组合物、方法和用途。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的不同的位点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现甲型流感病毒H1N1/H3N2毒株、乙型流感病毒BV/BY毒株、新型冠状病毒变异株BA.4/BA.5毒株以及艾滋病毒的检测和区分。使得不同病原体能够得到区别对待，从而使得和预防更有效。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到200拷贝/mL，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。