一种人参TCTP蛋白的真核表达和纯化方法

一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法
技术领域
1.本发明涉及蛋白真核表达技术领域，具体涉及一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法。

背景技术：

2.翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，tctp)最开始发现于哺乳动物的肿瘤细胞中，是在遗传进化上高度保守的蛋白，不仅存在于肿瘤细胞中，在动物、植物和酵母等正常细胞中也存在其同源蛋白。tctp在生物体中的普遍存在也说明其生物学功能的多样性和重要性。最初研究认为tctp仅是一个肿瘤相关蛋白，但后来的研究发现tctp不仅可以调节细胞周期、细胞外的组胺释放、炎症反应、应激反应等细胞过程，还参与调控细胞的增殖和分化，并具有抗凋亡、抗肿瘤等生物学活性。tctp有望作为重要的作用靶点为药物开发提供新思路。
3.目前tctp蛋白的体外表达多采用大肠杆菌原核表达系统，尚未建立真核表达体系。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法。本发明所述方法能够实现tctp蛋白的高效表达，得到的tctp蛋白生物活性高、毒性低。
5.本发明提供了一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法，包括以下步骤：
6.1)将人参tctp蛋白基因片段和ppic9k载体进行连接，构建得到重组表达载体；
7.2)将步骤1)得到的重组表达载体转入dh5α感受态细胞中进行验证，并提取验证正确的重组质粒；
8.3)将步骤2)得到的重组质粒进行线性化，回收线性化产物；
9.4)将步骤3)得到的线性化产物转入毕赤酵母表达菌株gs115感受态细胞中；
10.5)采用md平板筛选his+重组转化子，得到重组酵母转化子；
11.6)将步骤5)得到的重组酵母转化子接种至含有g418的ypd平板，筛选高拷贝转化子，得到重组高拷贝菌株；
12.7)将步骤6)得到的重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清，过滤，得到重组蛋白溶液；
13.8)将步骤7)得到的重组蛋白溶液经ni-亲和层析柱纯化，得到纯化后的人参tctp蛋白。
14.优选的是，所述人参tctp蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，编码所述人参tctp蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15.优选的是，步骤1)中，用于扩增人参tctp蛋白基因片段的引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq i d no.4所示。
16.优选的是，步骤3)所述线性化使用saci酶进行酶切。
17.本发明提供了一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法。本发明提供了完整的tctp蛋白的表达及纯化方法，包括tctp基因的克隆、毕赤酵母分泌型表达载体的构建、tctp蛋白的诱导表达及纯化。首先，相对于原核表达系统，真核表达系统可以对重组蛋白进行修饰使其更接近天然蛋白，生物活性高；其次，酵母的生长密度高可以实现大规模的发酵罐培养，且自身分泌蛋白少，不会产生内毒素等有毒物质，可以获得有生物活性的目的蛋白；本发明使用的ppic9k表达载体含有α因子信号肽序列，可以将表达产物分泌到培养基中，使后续纯化更简单。
附图说明
18.图1为本发明提供的目的蛋白纯化表达pcr扩增结果图；
19.图2为本发明提供的pcr产物和ppic9k载体连接产物的pcr鉴定结果图；
20.图3为本发明提供的重组酵母转化子的菌落pcr鉴定结果图；
21.图4为本发明提供的高拷贝酵母转化子的菌落pcr鉴定结果图；
22.图5为本发明提供的ni-亲和层析结果图；
23.图6为本发明提供的经western blot抗his抗体鉴定纯化的蛋白为tctp蛋白结果图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法，包括以下步骤：
25.1)将人参tctp蛋白基因片段和ppic9k载体进行连接，构建得到重组表达载体；
26.2)将步骤1)得到的重组表达载体转入dh5α感受态细胞中进行验证，并提取验证正确的重组质粒；
27.3)将步骤2)得到的重组质粒进行线性化，回收线性化产物；
28.4)将步骤3)得到的线性化产物转入毕赤酵母表达菌株gs115感受态细胞中；
29.5)采用md平板筛选his+重组转化子，得到重组酵母转化子；
30.6)将步骤5)得到的重组酵母转化子接种至含有g418的ypd平板，筛选高拷贝转化子，得到重组高拷贝菌株；
31.7)将步骤6)得到的重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清，过滤，得到重组蛋白溶液；
32.8)将步骤7)得到的重组蛋白溶液经ni-亲和层析柱纯化，得到纯化后的人参tctp蛋白。
33.本发明将人参tctp蛋白基因片段和ppic9k载体进行连接，构建得到重组表达载体。在本发明中，所述人参tctp蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示(mlvyqdlltgdellsdsfpykeiengvlwevegkwvvqgavdvniganpsaeggdedegvddqtikvvdivdtfrlqeqpafdkkqfvayikkyiktltpkleddkkeefkkgiegatkfllgklkdlqffvgesmhddgslvfayykdgatdptflyfghglkeikc)，编码所述人参tctp蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示(atgttggtttaccaggatttgttgaccggtgacgagttgttgtctgattcttttccatacaaggagattgaaaacggtgttttgtgggaggttgagggtaagtgggttgttcaaggtgctgttgatgttaatattggtgctaatccatctgctgagggtggtgatgaggatgaaggtgttgatgatcagactattaaggttgttgatattgttgataccttcagattgcaagaacaaccagctt
ttgataagaagcaatttgttgcctatatcaagaaatacatcaagacattgacccctaagcttgaagacgataagaaggaagagtttaagaagggtatagaaggtgctacaaaatttttgctgggaaagttgaaggatttgcaattttttgttggtgaaagtatgcatgatgatggttctttggtttttgcctactacaaggatggtgctactgacccaacttttttgtactttggtcatggtttgaaggagattaagtgtcatcatcaccatcaccat)。在本发明中，用于扩增人参tctp蛋白基因片段的引物的核苷酸序列优选如seq id no.3(tctp-f：5
’‑
agaggctgaagcttacgtagaattcatgttggtttaccaggatttgttg-3’)和seq id no.4(tctp-r：5
’‑
gcgaattaattcgcggccgcatggtgatggtgatgatgacact-3’)所示。在本发明中，所述人参tctp蛋白基因片段优选以含人参tctp蛋白基因片段的重组质粒为模板进行pcr扩增得到。在本发明中，所述pcr扩增的反应体系优选如表1所示，所述pcr扩增的反应程序优选如表2所示。本发明优选将pcr产物和ppic9k载体酶切后连接，得到重组表达载体。在本发明中，所述酶切优选使用ecori和noti限制性内切酶进行。在本发明中，所述连接优选使用t4 dna连接酶进行。
34.得到重组表达载体后，本发明将重组表达载体转入dh5α感受态细胞中进行验证，并提取验证正确的重组质粒。本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规转入方法即可。本发明优选对验证正确的重组质粒进行质粒提取，本发明对质粒提取的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的质粒提取方法进行提取即可。
35.得到重组质粒后，本发明将重组质粒进行线性化，回收线性化产物。在本发明中，所述线性化优选使用saci酶进行酶切。
36.得到线性化产物后，本发明将线性化产物转入毕赤酵母表达菌株gs115感受态细胞中。在本发明中，所述转入的方法优选包括电击转化法，所述电击转化法的条件优选为1500v，电击时间4～10ms。电击后，本发明优选立即加入预冷的山梨醇溶液对菌液进行稀释，静置培养。
37.将线性化产物转入毕赤酵母表达菌株gs115感受态细胞中后，本发明采用md平板筛选his+重组转化子，得到重组酵母转化子。本发明优选在静置培养后，讲菌液涂布于md培养基上进行倒置培养。倒置培养后，本发明优选通过菌液pcr鉴定单克隆是否为阳性菌株。在本发明中，显示条带，且大小为651bp则判定为阳性(核酸片段大小+酶切位点至3’aox)。
38.得到重组酵母转化子后，本发明将重组酵母转化子接种至含有g418的ypd平板，筛选高拷贝转化子，得到重组高拷贝菌株。
39.在本发明中，所述重组酵母转化子优选的分别接种至含有不同浓度的g418的ypd平板，筛选高拷贝转化子，得到重组高拷贝菌株。在本发明中，所述g418的浓度优选为0,0.5,1,2,3和4mg/ml。
40.在本发明具体实施过程中，优选的以g418浓度为3mg/ml的ypd平板上筛到的转化子作为高拷贝菌株。
41.得到高拷贝菌株后，本发明将重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清，过滤，得到重组蛋白溶液。在本发明中，所述bmgy培养基以蒸馏水为溶剂，以1l计，含有以下浓度的组分：20g胰蛋白胨、10g酵母提取物、100ml的10％甘油、100ml的1m磷酸钠缓冲液、100ml的10倍酵母氮源基础培养基(ynb)和2ml的500倍生物素；所述bmgy含有甘油，用于表达前毕赤酵母重组菌株的扩增。在本发明中，所述bmmy培养基以蒸馏水为溶剂，以1l计，含有以下浓度的组分：20g胰蛋白胨、10g酵母提取物、100ml的1m磷酸钠缓冲液、100ml的10倍ynb和2ml的500倍生物素；所述bmmy含有甲醇，用于
后续的诱导蛋白的分泌表达。在本发明中，所述甲醇优选每隔24h进行补加，甲醇的终浓度优选为1％。在本发明中，所述诱导的时间优选的以蛋白的表达量达到最高停止诱导；在本发明具体实施过程中，每24h收集菌液经sds-page检测，测定蛋白的表达量，所述诱导的时间优选为96h。
42.得到重组蛋白溶液后，本发明将重组蛋白溶液经ni-亲和层析柱纯化，得到纯化后的人参tctp蛋白。本发明优选重组蛋白溶液与nta-ni填料混合后孵育，孵育后装入层析柱。本发明优选使用清洗液(wash buffer)进行清洗后，使用洗脱液(elution buffer)进行洗脱。在本发明中，具体优选使用wash buffer(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl，10mm imidazole)洗2～5个柱体积，收集流穿液用于检测非特异性杂蛋白的洗脱情况；接着依次用含有100mm、200mm咪唑的elution buffer(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl)进行洗脱，收集各洗脱产物用于检测目的蛋白的洗脱情况；最后用500mm咪唑的缓冲液(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl)进行强洗脱，洗去结合力较强的蛋白。
43.下面结合具体实施例对本发明所述的一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
44.实施例1
45.tctp蛋白的表达、纯化具体步骤如下：
46.1.分子克隆和载体构建：以北京擎科合成的ppic9-tctp重组质粒为模板进行tctp的pcr扩增，得到pcr产物(如图1所示，图1中m，1，2分别代表：dna marker，扩增条带1和2。产物大小为539bp)。根据uniprot公布的tctp氨基酸序列转换的核酸序列设计引物，正向引物：5
’‑
agaggctgaagcttacgtagaattcatgttggtttaccaggatttgttg-3’(seq id no.5)；反向引物：5
’‑
gcgaattaattcgcggccgcatggtgatggtgatgatgacact-3’(seq id no.6)；并在引物两端分别加上包含ecori/noti酶切位点在内的载体正向或反向16～25个碱基的重叠序列。用ecori和noti限制性内切酶对表达载体ppic9k进行双酶切，将pcr产物和酶切载体ppic9k(购于novagen公司)，使用t4 dna连接进行连接，构建重组表达载体。将重组表达载体转入大肠杆菌dh5α感受态，在含有终浓度为100mg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上筛选并经菌落pcr鉴定阳性(如图2所示，图2为将pcr产物和ppic9k载体连接并转化至大肠杆菌感受态中后，通过lb平板筛选出阳性克隆的琼脂糖凝胶图，m为dl2000，100～2000bp，1～5分别是从lb平板上挑选的5个单克隆跑胶后的条带，大小为912bp(5’aox1-ecor i的大小+片段大小)，并测序鉴定。经测序验证正确的重组质粒，进行质粒提取，-20℃保存备用。
47.表1 pcr反应体系(50μl)
[0048][0049]
表2 pcr反应程序
[0050][0051]
表3连接体系
[0052][0053]
2.重组酵母转化子的获得：
[0054]
将重组质粒采用sac i酶进行线性化，并通过电击转化法转至事先制备好的毕赤酵母gs115感受态中。设置参数：电压1500v，电击时间4～10ms，电击完成后取出电转杯；于超净台上，立即加入1ml预冷的山梨醇溶液(1mol/l)稀释菌液，吸打混匀后，转至1.5ml无菌离心管中，30℃静置培养1h；4000r/min，离心1min，弃去部分上清。留约100μl上清吸打混匀后，均匀涂布于md培养基上，30℃倒置培养2～3d，通过菌液pcr鉴定单克隆是否为阳性菌株(如图3所示，m为dl2000，1-16是挑的16个单克隆。m第3条带对应的是1000bp，该条带附近的是目标条带，大小为903bp)。
[0055]
3.高拷贝转化子的获得：
[0056]
md平板上筛选到的重组酵母转化子菌液稀释10倍，然后点种于含有不同浓度(0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml，2mg/ml和4mg/ml)g418的ypd平板上，30℃培养2～3d以筛选含有多拷贝tctp基因插入的重组转化子。将g418-ypd平板上筛选到的重组高拷贝菌株以及ppic9k空载转化的菌落挑至ypd液体培养基中，30℃培养。通过菌液pcr鉴定阳性(如图4所示，其中条带大小是907bp(5’aox1载体引物+片段大小539bp)。扩增有点条带且大小正确即为阳性)。
[0057]
4.蛋白表达及纯化：
[0058]
将鉴定成功的gs115-ppic9k-tctp-his(gs115是毕赤酵母株系、ppic9k是表达载体、tctp是蛋白缩写名、his是载体上的标签。)以及ppic9k载体的菌株，分别接种在2个培养瓶中至装有50ml bmgy培养基(45ml bmgy中加入5ml ynb和100μl生物素)的250ml锥形瓶中，30℃，培养1～2d，使菌液od
600
》2。将bmgy菌液转入500ml灭菌离心瓶中，3300r/min，室温离心10min去除上清，收集菌体。用bmmy培养液(225ml bmmy中加入25ml ynb和500μl生物素)重悬菌体使od
600
＝1.0，置于1l锥形瓶中进行诱导表达。每隔24h补充甲醇进行诱导使甲醇终浓度为1％，直至达到最佳诱导时间。分别在诱导0h、24h、48h、72h、96h后取1ml诱导菌液用于检测蛋白是否表达。将菌液12000
×
g，离心5min，取上清和沉淀，-40℃保存以待检测。将验证正确的菌株进行大量表达，4000
×
g，4℃离心30min，取上清；用0.22μm滤膜过滤除菌。过滤后的菌液和nta-ni填料在4℃摇床低速振荡孵育30min；将孵育后的菌液和nta-ni填料混合液装入层析柱，使其自然沉降保证填料中无气泡；用wash buffer(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl，10mm imidazole)洗2～5个柱体积，收集流穿液(w)用于检测非特异性杂蛋白的洗脱情况；接着依次用含有100mm、200mm咪唑的elution buffer(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl)进行洗脱，收集各洗脱产物(e1、e2)用于检测目的蛋白的洗脱情况；最后用500mm咪唑的缓冲液(50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl)进行强洗脱，洗去结合力较强的蛋白(e3)；通过12％的sds-page检测重组蛋白的分子量大小和纯度(如图5所示，e1有条带，说明100mm洗脱buffer能将大部分目的蛋白洗脱下来，e2也是有条带的，是因为洗脱下的蛋白浓度不高，条带浅；e3没条带，说明200mm的洗脱buffer便能将所有目的蛋白洗脱，导致500mm的咪唑洗脱下的溶液中无蛋白)。纯化后的蛋白可直接用于生化实验或用液氮速冻，-80℃保存。纯化后的tctp重组蛋白采用抗his抗体通过wb进行验证(如图6所示，条带大小在20-25kd之间，目标蛋白的大小约20kd，和图5大小是一致的)，用抗体目的蛋白结合，杂交出来了目的条带，说明目标蛋白成功表达和纯化。
[0059]
本发明建立了一个用于tctp蛋白外源表达的真核表达体系。相比原核表达系统来说，酵母表达的蛋白分泌的杂蛋白更少，更适合后续纯化；不产生包涵体，生物活性更高；酵母分泌的毒性物质更少。
[0060]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种人参tctp蛋白的真核表达和纯化方法，包括以下步骤：1)将人参tctp蛋白基因片段和ppic9k载体进行连接，构建得到重组表达载体；2)将步骤1)得到的重组表达载体转入dh5α感受态细胞中进行验证，并提取验证正确的重组质粒；3)将步骤2)得到的重组质粒进行线性化，回收线性化产物；4)将步骤3)得到的线性化产物转入毕赤酵母表达菌株gs115感受态细胞中；5)采用md平板筛选his+重组转化子，得到重组酵母转化子；6)将步骤5)得到的重组酵母转化子接种至含有g418的ypd平板，筛选高拷贝转化子，得到重组高拷贝菌株；7)将步骤6)得到的重组高拷贝菌株依次接种至bmgy培养基和bmmy培养基，经甲醇诱导表达，离心，收集上清，过滤，得到重组蛋白溶液；8)将步骤7)得到的重组蛋白溶液经ni-亲和层析柱纯化，得到纯化后的人参tctp蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人参tctp蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，编码所述人参tctp蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，用于扩增人参tctp蛋白基因片段的引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述线性化使用saci酶进行酶切。

技术总结

本发明涉及一种人参TCTP蛋白的真核表达和纯化方法，属于蛋白真核表达技术领域。本发明提供了一种人参TCTP蛋白的真核表达和纯化方法，包括重组表达载体构建，毕赤酵母表达菌株构建、重组酵母转化子和重组高拷贝菌株筛选、蛋白诱导表达和纯化的步骤。本发明所述方法能够实现TCTP蛋白的高效表达，得到的TCTP蛋白生物活性高、毒性低。毒性低。毒性低。