一种氟化酶突变体和细胞表面展示氟化酶的微生物细胞及其应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种氟化酶突变体和细胞表面展示氟化酶的微生物细胞及其应用。

背景技术：

2.氟化酶最早发现于卡特利亚链霉菌(streptomyces cattleya)，是目前已知的将无机氟离子引入有机物的唯一天然酶，催化腺苷甲硫氨酸与氟离子之间形成c-f键。该反应属于sn2反应。相对于化学合成法，利用氟化酶生成相应的含氟前体是一种更绿的途径。采用酶催化的方法会存在酶纯化繁琐、失活等固有问题，相比之下，全细胞催化是一种更为便捷的生物催化方式。由于催化成本低、减少了传统酶催化细胞裂解和蛋白质浓缩等步骤，在制药、工业合成绿再生能源等领域展现出独特的优势和极大的应用前景。然而，细胞的透性屏障作用却成了阻碍细胞氟化催化发展的主要问题。一方面，体外的s-腺苷甲硫氨酸向细胞内部的转运被细胞膜阻断。另一方面，由于野生大肠杆菌的crcb通道蛋白的氟离子外排作用，细胞内氟浓度非常低。

技术实现要素：

3.本发明的目的是为了能够解决全细胞催化过程中底物跨膜受限的技术问题。
4.本发明提供了一种氟化酶的突变体，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no:7所示的序列为出发序列，对第72位和164位中的至少一个氨基酸进行突变。
5.进一步地限定，所述突变体为将seq id no:7所示的氨基酸序列中的第72位突变为丙氨酸，第164位突变为丙氨酸。
6.本发明提供了一种编码权利要求上述突变体的基因。
7.本发明提供了一种重组微生物细胞，所述微生物细胞含有权利要求3所述的编码基因。
8.进一步地限定，所述微生物细胞为细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌是以大肠杆菌作为出发菌株，表达冰核蛋白n端编码基因和上述的编码基因获得的大肠杆菌工程菌，所述冰核蛋白n端编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有上述的编码基因和冰核蛋白n端编码基因的重组表达载体。
10.本发明提供了上述的突变体、上述的编码基因、上述的微生物细胞或上述的重组载体在途在生产氟化酶中的应用。
11.进一步地限定所述生产氟化酶的方法如下：
12.(1)将权利要求上述的大肠杆菌工程菌按照1-2％的接种量转接到含有100ml lb培养基中，待菌液生长至od600＝0.6，添加0.2mm的iptg，温度为30℃，诱导2h-35h，收集诱导过程中的细胞，用tris-hcl清洗，然后重悬；
13.(2)将诱导4h的细胞收集并重悬于pbs中，采用高压破碎仪进行细胞破碎，压力设置为30kpsi，然后以6000rpm去除大的细胞碎片，收集的上清10000g离心1h以获得膜组分沉淀，去除上清液，将沉淀采用含有2％triton-x100的pbs重悬，再次10000g离心1h，获得细胞外膜的沉淀。
14.本发明提供了上述的突变体、上述的编码基因、上述的微生物细胞或上述的重组载体在作为全细胞催化剂中的应用，其特征在于，所述应用是催化s-腺苷甲硫氨酸与氟化钾获得5
’‑
氟嘧啶。
15.进一步地限定，所述获得5
’‑
氟嘧啶的方法是将上述的大肠杆菌工程菌加入到s-腺苷甲硫氨酸与氟化钾的水溶液中，在37℃条件下，进行催化反应。
16.有益效果：本发明通过基因重组方法构建了一种细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌，该工程菌可以将氟化酶基因稳定表达在大肠杆菌中，并自动展示于细胞表面。所述工程菌有以下优势：(1)在表达目的蛋白同时实现酶的固定化，简化了传统酶固定化方式的步骤，操作方便，且能获得具有生物活性的氟化酶。(2)将酶直接与底物接触，避免了底物通过细胞膜的限制，最大限度提高酶的利用率。(3)表面展示降低了外源蛋白对于宿主的影响，可以获得更大的细胞量，提高了工程化应用的可能性。
17.本发明提供了所述构建方法得到的细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌的细胞表面稳定表达氟化酶，由此方法提供了一种用于催化有机物氟化的全细胞催化剂，具有良好的工业应用价值。
附图说明
18.图1是表面展示型氟化酶构建示意图；
19.图2是重组质粒pet28a-inp-faa的图谱；
20.图3是氟化酶基因片段faa的电泳图谱；
21.图4是载体片段pet28a-inp的电泳图谱；
22.图5是细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌细胞各组分的sds-page图谱；
23.图6是细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌全细胞催化效果图谱；
24.图7是细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌全细胞催化效果随诱导时间变化的图谱；
25.图8是细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌全细胞催化剂稳定性的图谱；
26.图9是利用细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂制备5
’‑
fda随时间变化的图谱。
具体实施例
27.冰核蛋白n端编码序列的ncbi序列为：
28.mnddkvlvlrtcannmadhcgqiwpvsgvveckyweptrklenglagllwgkgasthlnmqadarwvicevavsdiifldaqggvkfpraevvhvgtrnsaagyisaniasyasstvalnetfvfpevrtetkvdfpaspatadstfdidrhatiqgpqtletav(seq id no:6)。
29.氟化酶的编码序列的ncbi登录号为：wp_103354124.1，为初始酶(wt):makpsrpiiafmsdlgitddsvaqckglmlsvcpdvtivdvchtmkpwdveegaryivdlprlfpegtvfatttypatgtttrsv
alrikqaakggargqwagsgagferaegsyiyiapnnglltsvieehgyveayevsstevipeqpeptfysremvalpsahlaagfplekvgrpladdeivrferakpaqnddgelvgvvtaidhpfgnvwtnihredleklgagygtrlritldevlpfdlplsptfadagpigtpvaylssrgylalarnaaslaypynlnagisvrvvaa(seq id no:7)。
30.本发明构建细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌的步骤按照图1所述的示意图来操作。
31.lb培养基成分：胰蛋白胨(10g/l)、酵母提取物(5g/l)、氯化钠(10g/l)。
32.s-腺苷甲硫氨酸(sam)，氟化钾(kf)。
33.实施例1.获得编码氟化酶基因
34.1.氟化酶蛋白序列的优化：针对初始氟化酶催化效率较低的问题，通过定点突变的方式，将72t、164s氨基酸进行突变，突变后的氨基酸序列为seq id no:1：makpsrpiiafmsdlgitddsvaqckglmlsvcpdvtivdvchtmkpwdveegaryivdlprlfpegtvfaattypatgtttrsvalrikqaakggargqwagsgagferaegsyiyiapnnglltsvieehgyveayevsstevipeqpeptfysremvalpaahlaagfplekvgrpladdeivrferakpaqnddgelvgvvtaidhpfgnvwtnihredleklgagygtrlritldevlpfdlplsptfadagpigtpvaylssrgylalarnaaslaypynlnagisvrvvaa。(划横线的部分为突变的位点)，得到t72a/s164a突变体。
35.2.将突变后的酶与初始酶的粗酶液进行活性比较，结果显示如表1所示，酶的催化效率提高了约1.7倍。
36.表1突变体(t72a/s164a)与初始酶(wt)催化活性比较
[0037][0038]
3.以上述突变后的氨基酸序列为目标，将相应的核酸序列针对于大肠杆菌表达系统进行密码子优化，优化后的序列为seq id no:2。
[0039]
实施例2.构建细胞表面展示氟化酶的质粒
[0040]
1)将优化后的冰核蛋白n-端序列(seq id no:2)直接合成于pet28a载体的ncoi与banmhi限制性位点之间，获得pet28a-inp载体。
[0041]
(1)密码子优化后的编码冰核蛋白n端片段的核苷酸序列如seq id no:2所示：
[0042]
(ccatgggcatgaacgatgataaagtgctggtgctgcgcacatgtgcaaataatatggcagatcattgcggtcagatctggccagtgagcggtgttgtggaatgcaaatattgggaaccgacccgcaaactggaaaatggcctggcaggtctgctgtggggtaaaggtgcaagcacgcatctgaatatgcaggcagatgcccgttgggttatttgtgaagttgcggttagcgatattatttttctggatgcccagggtggtgtaaaatttccgcgtgcagaagttgttcatgttggtacacgtaatagcgcagcaggttatattagtgcaaatattgcgagttatgcaagcagcacagttgcactgaatgaaacatttgtttttccggaagttcgtaccgaaaccaaagttgattttcctgcctcaccggcaacagccgattcaacctttgatattgatcgtcatgcaacaatccagggtcctcagacactggaaaccgcagttggatcc)。
[0043]
(2)密码子优化后的氟化酶编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示：
[0044]
(atggcgaaacctagccgcccgattattgcgtttatgagcgatctgggcattaccgatgatagcgtggcgcaatgcaaaggcctgatgttaagcgtgtgcccggatgtgaccattgtggatgtgtgccataccatgaaaccgtgggatgtggaagaaggcgcgcgctatattgttgatctgccgcgcttatttcctgaaggcaccgtgtttgcggctaccacctatcctgcgaccggtaccactactcgttcagttgcgctgcgcattaaacaggcggcgaaaggtggtgcacgtg
35h，收集诱导过程中的细胞，用tris-hcl(ph 7.8,50mm)清洗，然后重悬。
[0059]
3.将诱导4h的细胞收集并重悬于pbs(ph 8.0,50mm)中，采用高压破碎仪进行细胞破碎，压力设置为30kpsi，然后以6000rpm去除大的细胞碎片。收集的上清10000g离心1h以获得膜组分沉淀，上清为细胞质组分。将沉淀采用含有2％triton-x100的pbs重悬，再次10000g离心1h，获得成分为细胞外膜的沉淀以及细胞内膜的上清组分。
[0060]
4.将获取的全细胞组分(cell)、细胞质组分(om)、细胞内膜组分(im)、细胞外膜组分(om)与蛋白loading buffer混合，沸水浴2min后进行sds-page凝胶电泳，分析目的蛋白的定位。氟化酶的理论大小约为33kda，冰核蛋白n端的理论大小约为18kda，因此融合蛋白约为51kda，得到结果如图5所示，实验组中目标蛋白明显主要存在于外膜组分中，内膜以及细胞质组分中条带在胶图中不可观察，这说明蛋白成功定位于细胞外膜上。
[0061]
实施例5：细菌表面显示氟化酶催化效果
[0062]
1.将参照实施例4步骤1-3的方法诱导4h后收集的细胞重悬于tris-hcl(ph 7.8,50mm)中，经过高压破碎后，将破碎液经过离心机6000rpm进行分离以获取上清可溶性组分，沉淀重悬于等量tris-hcl。最终细胞od
600
为10，各取980微升全细胞悬浮液、细胞破碎液、破碎上清液、破碎沉淀悬浮液，加入20微升底物，配制底物终浓度为sam(1mm)和kf(20mm)的混合反应液。将各样品置于37℃水浴1h后沸水浴终止反应，测定相应的产物生成量。考虑到菌株间蛋白表达量的差异，以全细胞组分催化能力占破碎组分催化能力的占比来代表氟化酶的展示效果。诱导4h的细胞结果如图6，全细胞催化能力较对照提高不显著，而上清催化能力明显较低，考虑到氟化酶随细胞大的碎片生成了沉淀而造成上清活性的损失，因此推测氟化酶已经定位于细胞膜部分，但是获得具有活性的多聚体需要一定的时间。随后测定不同诱导时间全细胞组分催化能力占细胞破碎液比例的变化，结果如图7：全细胞催化能力占本身总催化能力随诱导时间逐渐升高，印证了氟化酶在胞内表达到展示到细胞表面不是瞬时发生的，表面展示在22h后达到稳定，最高效率约为78％。
[0063]
2.底物母液配制：精确称取0.1g sam，溶解于5ml的kf(1m)的水溶液，配制为含1m kf与50mm sam的底物母液。s-腺苷甲硫氨酸(sam)与氟化钾(kf)。
[0064]
实施例6.表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌的全细胞催化剂的稳定性
[0065]
将参照实施例4步骤1-3的方法，诱导4h后的细胞重悬于tris-hcl(ph 7.8,50mm)中，配制od600约为10，储存于4℃环境中，每隔24h取全细胞催化剂，配制反应，确定不同储存时间全细胞催化剂催化能力的变化。结果如图8，相比于传统粗酶液(即未表面展示对照的破碎上清)相比，表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌的全细胞催化剂拥有更好的稳定性，在7天的存储中，可保持120％的自身初始活性。
[0066]
实施例7.表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌的全细胞催化
[0067]
将参照实施例4步骤1-3的方法，诱导24h后的细胞重悬于tris-hcl(ph 7.8,50mm)中，取800微升全细胞悬浮液，加入200微升底物，配制细胞od600＝5，底物为sam(1mm)、kf(200mm)的反应液。连续测定37℃条件下产物的生成，鉴定全细胞催化能力。全细胞催化效果如图9所示，全细胞催化速率在前10小时较快，随着底物浓度降低，速率降低，经过37小时催化，产物5
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fda获得0.55mm，对于sam的产率为55％。
[0068]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技
术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种氟化酶的突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no:7所示的序列为出发序列，对第72位和164位中的至少一个氨基酸进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为将seq id no:7所示的氨基酸序列中的第72位突变为丙氨酸，第164位突变为丙氨酸。3.编码权利要求1或权利要求2所述突变体的基因。4.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞含有权利要求3所述的编码基因。5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为细胞表面展示氟化酶的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌是以大肠杆菌作为出发菌株，表达冰核蛋白n端编码基因和权利要求3所述的编码基因获得的大肠杆菌工程菌，所述冰核蛋白n端编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的编码基因和冰核蛋白n端编码基因的重组表达载体。7.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的编码基因、权利要求4或5所述的微生物细胞或权利要求6所述的重组载体在途在生产氟化酶中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生产氟化酶的方法如下：(1)将权利要求5所述的大肠杆菌工程菌按照1-2％的接种量转接到含有100ml lb培养基中，待菌液生长至od
600
＝0.6，添加0.2mm的iptg，温度为30℃，诱导2h-35h，收集诱导过程中的细胞，用tris-hcl清洗，然后重悬；(2)将诱导4h的细胞收集并重悬于pbs中，采用高压破碎仪进行细胞破碎，压力设置为30kpsi，然后以6000rpm去除大的细胞碎片，收集的上清10000g离心1h以获得膜组分沉淀，去除上清液，将沉淀采用含有2％triton-x100的pbs重悬，再次10000g离心1h，获得细胞外膜的沉淀。9.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的编码基因、权利要求4或5所述的微生物细胞或权利要求6所述的重组载体在作为全细胞催化剂中的应用，其特征在于，所述应用是催化s-腺苷甲硫氨酸与氟化钾获得5
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氟嘧啶。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述获得5
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氟嘧啶的方法是将权利要求2所述的大肠杆菌工程菌加入到s-腺苷甲硫氨酸与氟化钾的水溶液中，在37℃条件下，进行催化反应。

技术总结

本发明提供了一种氟化酶突变体和细胞表面展示氟化酶的微生物细胞及其应用，属于基因工程技术领域。为了能够解决全细胞催化过程中底物跨膜受限的问题。本发明提供了序列如SEQ ID NO:3所示的基因，以大肠杆菌工程菌是以大肠杆菌作为出发菌株，表达冰核蛋白N端编码基因和氟化酶编码基因获得的大肠杆菌工程菌，该工程菌可以将氟化酶基因稳定表达在大肠杆菌中，并自动展示于细胞表面，将酶直接与底物接触，避免了底物通过细胞膜的限制，最大限度提高酶的利用率，表面展示降低了外源蛋白对于宿主的影响，可以获得更大的细胞量，提高了工程化应用的可能性。化应用的可能性。化应用的可能性。