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通用高容量蛋白质捕获和可调电化学释放的制作方法

1.本发明涉及电化学捕获-释放系统，所述电化学捕获-释放系统包含通过电化学不敏感的芳基键的单层与结构共价连接从而形成聚电解质配置的ph响应性聚合物，并且被布置成通过在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置施加电化学电位来捕获和释放实体，所述实体为蛋白质、囊泡或经聚(乙二醇)改性的化合物。

背景技术

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：：2.可以捕获大量蛋白质而不引起变性的界面在许多领域例如纯化、生物分析或酶催化中是普遍关注的。可控地释放捕获的蛋白质的可能性进一步为新的芯片实验室(lab-on-a-chip)(d.l.huber,r.p.manginell,m.a.samara,b.i.kim,b.c.bunker,programmedadsorptionandreleaseofproteinsinamicrofluidicdevice.science301,352-354(2003))或药物递送(a.c.anselmo,y.gokarn,s.mitragotri,non-invasivedeliverystrategiesforbiologics.natrevdrugdiscov18,19-40(2019)；e.katz等,substancereleasetriggeredbybiomolecularsignalsinbioelectronicsystems.jphyschemlett6,1340-1347(2015)；以及s.mitragotri,p.a.burke,r.langer,overcomingthechallengesinadministeringbiopharmaceuticals:formulationanddeliverystrategies.natrevdrugdiscov13,655-672(2014))技术开辟了可能性。已经开发了几种用于通过各种化学相互作用固定和释放生物分子的界面，所述生物分子例如dna(f.wang,d.li,g.p.li,x.q.liu,s.j.dong,electrodissolutionofinorganicions/dnamultilayerfilmfortunablednarelease.biomacromolecules9,2645-2652(2008)，以及m.gamella等,dnacomputingsystemsactivatedbyelectrochemically-triggereddnareleasefromapolymer-brush-modifiedelectrodearray.electroanal29,398-408(2017))、胰岛素(e.honarvarfard等,electrochemicallystimulatedinsulinreleasefromamodifiedgraphene-functionalizedcarbonfiberelectrode.electroanal29,1543-1553(2017))、白介素(s.m.gutowski等,protease-degradablepeg-maleimidecoatingwithon-demandreleaseofil-1ratoimprovetissueresponsetoneuralelectrodes.biomaterials44,55-70(2015))、或者甚至全细胞(h.zhu,j.yan,a.revzin,catchandreleasecellsorting:electrochemicaldesorptionoft-cellsfromantibody-modifiedmicroelectrodes.colloidsandsurfacesb:biointerfaces64,260-268(2008))。值得注意的是，蛋白质(特别是抗体)现在构成大多数药物(a.c.anselmo,y.gokarn,s.mitragotri,non-invasivedeliverystrategiesforbiologics.natrevdrugdiscov18,19-40(2019)；以及s.mitragotri,p.a.burke,r.langer,overcomingthechallengesinadministeringbiopharmaceuticals:formulationanddeliverystrategies.natrevdrugdiscov13,655-672(2014))，这需要新的方法来实现有效的固定和控制释放。3.然而，现有的捕获-释放设计通常与蛋白质不兼容，因为它们需要温和的固定方法来保持结构和生物活性(k.takasu等,polymerbrushbiointerfacesforhighlysensitivebiosensorsthatpreservethestructureandfunctionofimmobilizedproteins.sensorsandactuatorsb:chemical216,428-433(2015))。一个例外是使用受体来捕获特定蛋白质，这有时可以与通过化学环境的变化的释放相结合(a.shastri等,anaptamer-functionalizedchemomechanicallymodulatedbiomoleculecatch-and-releasesystem.naturechemistry7,447-454(2015))。不幸的是，这样的基于亲和力的方法对受体提出了极端的要求，受体必须保持靶蛋白牢固结合，同时以高密度固定并保持活性等。一种令人感兴趣的释放策略是将分子储存在由可以电化学溶解的薄膜密封的微容器中(a.c.r.grayson等,multi-pulsedrugdeliveryfromaresorbablepolymericmicrochipdevice.natmater2,767-772(2003)；j.t.santini,m.j.cima,r.langer,acontrolled-releasemicrochip.nature397,335-338(1999)；以及farra,r.等,first-in-humantestingofawirelesslycontrolleddrugdeliverymicrochip.scitranslmed,4,122:122ra21,(2012))。虽然这种方法有望用于许多化合物，但其通常不用于蛋白质并且需要先进的精密加工。此外，现有的释放策略是不可调的(“全部或全不”)，并且由于整个化学构造被移除，因此限于单次使用(f.wang,d.li,g.li,x.liu,s.dong,electrodissolutionofinorganicions/dnamultilayerfilmfortunablednarelease.biomacromolecules9,2645-2652(2008)；以及t.ghaly,b.e.wildt,p.c.searson,electrochemicalreleaseoffluorescentlylabeledthiolsfrompatternedgoldsurfaces.langmuir26,1420-1423(2010))。4.生物分析和生物医学应用非常需要用于蛋白质的固定和控制释放的技术。然而，迄今为止，固定方法和释放技术二者都受到一些限制。要到无论环境如何均保持蛋白质结构并按需以期望的量释放它们的通用构思特别困难。因此，持续需要改进的用于蛋白质的固定和控制释放的技术。技术实现要素：5.本公开内容的一个目的是提供用于实体例如蛋白质的捕获和释放的改进的或至少替代的捕获-释放系统。6.本发明由所附独立专利权利要求限定。非限制性实施方案从从属权利要求、附图和以下描述中得出。7.根据第一方面，提供了用于重复使用的电化学捕获-释放系统，其包括：ph响应性聚合物，所述ph响应性聚合物通过电化学不敏感的芳基键的单层与结构共价连接，从而形成聚电解质配置，所述聚电解质配置被布置成：当共价结合的聚合物处于中性状态时，捕获实体，所述实体为蛋白质、囊泡或经聚(乙二醇)改性的化合物，而当聚合物处于带电状态时，通过静电排斥释放由聚电解质配置捕获的实体；用于在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置施加电化学电位以引起聚电解质配置从中性状态到带电状态或相反的转换的装置。8.因此，电化学捕获-释放系统包括能够进行实体的固定和控制释放的系统，如本文所述，其中实体包括例如蛋白质(例如水溶性蛋白质)、囊泡(例如水溶性脂质体)、或经聚(乙二醇)改性的化合物。9.此外，电化学捕获-释放系统可以在纯化、生物分析、酶催化中实施，并且还可以在分离技术和分析装置中，以及在用于从植入装置中控制释放蛋白质例如性抗体的技术和植入装置、生物电极中，芯片实验室、芯片上的器官(organ-on-a-chip)和药物递送技术中实施。10.此外，如本文所述的实体包括完整的脂质体、经聚(乙二醇)改性的化合物、生物分子药物、可用于生物分析和生物医学应用的蛋白质、以及蛋白质药物，例如抗体、胰岛素和酶。11.电化学捕获-释放系统包含所述ph-响应性聚合物，其中ph-响应性聚合物可以是例如含有羧酸基团的ph-响应性聚合物，所述羧酸基团具有解离质子或吸收质子从而分别提高或降低电极界面处的ph的能力，ph响应性聚合物为例如聚(丙烯酸)(paa)或聚(甲基丙烯酸)(pmaa)。12.此外，电化学捕获-释放系统包含所述ph响应性聚合物，所述ph响应性聚合物与结构共价结合，从而形成聚电解质配置。本发明的电化学捕获-释放系统涵盖任何ph响应性聚电解质配置，其中聚电解质配置包括例如通过电化学不敏感的芳基键(例如重氮盐表面官能化)与电极表面共价连接的聚电解质刷、膜、凝胶或层。13.公开了其中聚电解质配置包括通过电化学不敏感的芳基键的单层(例如通过重氮盐表面官能化形成)与电极表面共价连接的聚电解质刷、膜、凝胶或层的又一个实施方案。14.公开了其中聚电解质配置包括聚电解质刷或者为聚电解质刷的另一个实施方案。15.根据本发明的电化学捕获-释放系统的所述结构可以为例如表面，例如平坦表面，或者该结构为纳米孔阵列，或者该结构例如表面的尺寸是微孔或中孔的，从而允许多尺度分层多孔结构，这将允许更高的表面积并因此允许更高的蛋白质负载容量。16.此外，所述结构可以是可以结合重氮盐的任何结构，即该结构可以为碳、硅或金属，例如贵金属如au(金)和pt(铂)，其中表面与重氮盐反应，导致形成与表面共价结合的芳族有机层。17.ph响应性聚合物通过电化学不敏感的键，即通过包含芳基的电化学不敏感的键与所述结构结合。18.电化学捕获-释放系统使得能够实现水溶性蛋白质的高容量(几μg/cm2)固定并保持其二级结构。此外，在如本文所述的电化学捕获-释放系统的情况下，当聚电解质刷处于其中性质子化状态时，固定由来自羧酸基团的非静电多价氢键介导。如本文所述的电化学捕获-释放系统还使蛋白质能够以其天然状态结合。19.此外，如本文所述的电化学捕获-释放系统即使在使电化学捕获-释放系统暴露于生理流体时也使蛋白质能够保留在其聚电解质配置内。20.通过电化学，可以控制本发明的电化学捕获-释放系统的界面ph，使得可调的捕获和释放是可能的。在如本文所述的电化学捕获-释放系统的情况下，还可以使用微米尺度电极、局部递送和图案化。除了蛋白质之外，完整的脂质体和经聚(乙二醇)改性的化合物也可以用本发明的电化学捕获-释放系统以相同的方式捕获和释放。如本文所述的电化学捕获-释放系统可用于分析装置和药物递送系统。此外，在所述电化学捕获-释放系统的情况下，公开了能够在生物流体中实现非侵入性且高效的蛋白质固定和可调的电化学释放的电极界面。21.此外，已经表明，当聚合物刷处于其中性质子化状态时，电化学捕获-释放系统可以用于通过经由非静电分子内吸引相互作用(例如氢键合)的固定将处于其天然状态的大量(多层)蛋白质自发地固定至聚合物刷。假定聚合物刷保持在其中性状态并保持结构和催化功能，如本文所述的电化学捕获-释放系统使蛋白质能够不可逆地结合。通过电化学控制并且如果电化学稳定的化学锚(即通过电化学不敏感的包含芳基的键)能够用如本文所述的电化学捕获-释放系统实现，则捕获的蛋白质的可调释放是可能的。电化学捕获-释放系统也对脂质体和经聚(乙二醇)改性的化合物奏效。此外，如本文所述的电化学捕获-释放系统的电极界面可以通过来源于电化学信号的ph变化而释放所有结合的蛋白质以完全再生，并且可以在内容物释放之后直接重复使用而无需任何再生步骤，甚至是用于另一种蛋白质(如果需要的话)。22.这种现在通过电化学捕获-释放系统实现的用于蛋白质捕获-释放的通用技术将可用于未来的生物分析或生物医学装置。23.在上述电化学捕获-释放系统的情况下，已显示出通过非静电分子内吸引相互作用(例如通过与处于中性状态的多酸刷氢键合)，即在本发明的电化学捕获-释放系统的聚电解质配置中的新型的高容量蛋白质固定，以及因由增加界面ph的电化学控制引起的静电排斥而产生的随后释放。类似地，通过增加电极所暴露的溶液的ph也可以触发通过静电排斥而释放蛋白质的转换。24.电化学捕获-释放系统能够使蛋白质保持结合在生理流体中并保持其结构。也可以降低界面ph以将如本文所述的电化学捕获-释放系统的聚电解质配置的表面从排斥转换为蛋白质结合。成功电化学转换的关键在于用于将聚合物(即如本文所述的电化学捕获-释放系统的ph响应性聚合物)接枝到表面(即如本文所述的电化学捕获-释放系统的结构)的化学过程。聚电解质刷的转换被限定为改变刷的充电程度的任何ph变化。充电程度由刷的pka(图2)和刷所暴露的溶液的ph决定。当ph低于刷的pka时，其主要是中性和质子化的，充电程度低，而当ph高于pka时，刷主要是带电的，充电程度高。取决于ph的变化有多大，转换是渐进的或完全的。如图2所示，低于ph5，充电程度非常低(《0.1)，高于ph7，充电程度非常高(》0.9)。因此，通过电化学的刷的转换取决于界面处的ph通过电化学氧化还原反应移动了多少，这由施加的电化学电位的大小决定。刷的pka的精确值发生变化，这取决于刷的化学特性和溶液的组成，特别是盐浓度。25.此外，通过调节刷的化学特性，或通过改变溶液组成例如盐浓度，刷的pka改变以实现与蛋白质的有利相互作用，这进一步增加了蛋白质摄取。已经表明，通过调节溶液组成，例如低盐组成，即使在ph7.4下也可以实现蛋白质的高容量固定。这是因为由于低盐浓度，即使在ph7.4下，多酸刷也被充分质子化，从而通过非静电分子内相互作用(例如氢键合)吸引蛋白质。26.当向暴露于包含不同蛋白质的混合物的生物流体(例如血清)的刷电极施加相对小的电压窗口(例如0v至-0.5v)时，这引起一部分固定的蛋白质的释放。释放的蛋白质部分具有相对低的等电点pi，其由于对刷的静电排斥而被排出。剩余部分的具有相对高pi的蛋白质继续固定在刷(结构)内。该过程的重复使刷富含显示出相对高的等电点的蛋白质，这可以用作蛋白质等电分离的方法。纯化的高pi蛋白质的后续释放是通过施加更大的电位窗口(例如0v至-0.75v)来实现的，该电位窗口将刷界面的ph增加到足以释放所有捕获的蛋白质。27.如本文所述的电化学捕获-释放系统的金表面(即结构)已被修饰，但所述方法，即也是如本文所述的电化学捕获-释放系统，适用于可以结合重氮盐的任何表面，即如本文所述的结构。类似地，我们使用了平坦表面或纳米孔阵列，即两者都是如本文所述的结构，但通过具有更高有效表面积的结构，即如本文所述的纳米多孔结构，或通过多孔导电材料(例如但不限于碳、贵金属电极、导电氧化物)的官能化，储存容量可以自然地增加甚至更多。例如，我们在多孔碳电极内进行pmaa的聚合，以实现蛋白质的静态结合容量在20mg/cm3电极体积的范围内，在如同商业蛋白质纯化谱材料的结合容量但不限于该结合容量的范围内。可以通过优化电极结构和孔隙率结合充分利用pmaa刷的蛋白质结合容量来进一步改进如本文所述的电化学捕获-释放系统的进一步优化。如本文所述的电化学捕获-释放系统的实施在聚焦蛋白质的分离技术和分析装置中应当是简单的。从长远来看，我们设想利用该技术(即也是如本文所述的电化学捕获-释放系统)来从植入装置中控制释放蛋白质例如性抗体。28.ph响应性聚合物可以通过重氮盐与所述结构结合，并且电化学不敏感的键包含芳基。29.ph响应性聚合物可以是充当羧酸供体的含有羧酸基团的多酸聚合物。30.又一个实施方案涉及如本文所述的电化学捕获-释放系统，其中ph响应性聚合物为例如聚(丙烯酸)(paa)或聚(甲基丙烯酸)(pmaa)。31.ph响应性聚合物可以是一些其他类型的聚电解质，例如但不限于多元聚电解质，例如聚(二乙基氨基)甲基丙烯酸甲酯或聚(2-乙烯基吡啶)。或者能够通过非静电分子内蛋白质聚电解质相互作用(例如氢键合)在中性状态下结合实体(例如蛋白质)，接着通过静电排斥随后释放的任何其他ph响应性聚电解质，其中吸引和排斥的转换通过施加建立局部ph梯度的电化学信号而触发。类似地，还可以通过增加电极所暴露的溶液的ph来触发通过静电排斥而释放蛋白质的转换。32.实体可以为蛋白质(例如水溶性蛋白质)、囊泡(例如水溶性脂质体)、或经聚(乙二醇)改性的化合物，和/或实体为药物。33.结构可以为表面，例如平坦表面或电极表面，或者结构可以为多孔材料或纳米孔阵列。34.结构可以包括碳、贵金属(例如金或铂)、导电氧化物、不锈钢或导电聚合物，或者由碳、贵金属(例如金或铂)、导电氧化物、不锈钢或导电聚合物制成。35.导电聚合物可以为例如聚噻吩、聚乙烯亚胺、聚(吡咯)、聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)或聚(苯胺)。36.在一个实施方案中，电极表面是金的。37.在另一个实施方案中，电极表面是铂的。38.在又一个实施方案中，电极表面由碳制成。39.电化学捕获-释放系统为实体捕获系统，例如蛋白质捕获系统。40.本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的电化学捕获-释放系统，其中电化学捕获-释放系统为实体释放系统，例如药物释放系统。41.本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的电化学捕获-释放系统，其中电化学捕获-释放系统为实体释放系统，例如细胞释放系统，即通过蛋白质释放的细胞释放。42.本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的电化学捕获-释放系统，其中电化学捕获-释放系统被小型化，例如电化学捕获-释放系统或装置的尺寸的大小是纳米尺度、微米尺度或中尺度的。43.用于引起聚电解质配置中从聚合物的带电状态到聚合物的中性状态的转换的氧化还原活性物质可以选自氢醌、过氧化氢、盐酸多巴胺(dopa)、抗坏血酸、4-氨基苯乙醇(对羟苯基乙醇)、3,4-二羟基(dopac)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型和还原型二钠盐水合物(nadh)。44.电化学捕获-释放系统还可以包含与聚电解质配置结合的酶，在这种情况下，非氧化还原活性物质可以用于通过生物催化反应的存在来产生氧化还原活性物质，例如但不限于与溶解氧一起在酶葡萄糖氧化酶的存在下通过生物催化化学转化产生氧化还原活性过氧化氢的葡萄糖。酶可以为例如进行生物电催化的葡萄糖氧化酶，在生物电催化中，非氧化还原活性生物代谢物(例如但不限于碳水化合物如葡萄糖)在电极界面处被局部消耗，从而导致局部酸化。使用表面结合酶局部消耗非氧化还原活性物质将用于调节蛋白质释放速率或防止由电化学捕获和释放系统从表面释放。45.聚电解质配置(例如聚电解质刷、重氮盐和电极)的组合厚度可以为数百纳米厚至微米厚。然而，除了为电极厚度的横向尺寸之外，电化学释放系统的尺寸可以进一步减小。因此，对于基于本文描述的电化学捕获和释放系统的装置，进一步小型化原则上不受限制，其中电化学捕获-释放系统为实体捕获系统，例如蛋白质捕获系统。如果电化学捕获-释放系统为实体释放系统，例如药物释放系统，或者如果其为蛋白质捕获系统，则为了较低的侵入性或改善的功能性的益处，使电化学捕获和释放系统经历小型化。46.又一个实施方案涉及活的生物系统中生物存在的氧化还原活性物质例如多巴胺或血清素通过以下的局部消耗：用电化学捕获和释放系统施加电化学电位以在体内或在体外保持电极表面的局部酸化。生物系统中天然存在的氧化还原物质的局部消耗将用于调节蛋白质释放速率或防止从表面释放，直到电化学捕获和释放系统按需指定。类似地，通过使用生物催化，保持蛋白质与电极结合的电极的局部ph酸化也可以使用非氧化还原活性物质(例如但不限于葡萄糖)来实现。47.根据第二方面，提供了包括上述电化学捕获-释放系统的用于感测蛋白质存在、用于收获蛋白质样品、或用于一些其他生物分析目的的蛋白质捕获系统。48.根据第三方面，提供了包括上述电化学捕获-释放系统的药物释放系统，即蛋白质药物的药物递送系统。49.根据第四方面，提供了通过连续施加循环电化学信号的连续蛋白质排斥的方法，所述循环电化学信号产生局部非常高的ph梯度，该ph梯度使聚电解质刷为高度蛋白质排斥的，即防污性，其中通过去除连续电化学信号，聚电解质刷电极按需快速捕获蛋白质样品。50.根据第五方面，提供了在捕获-释放系统中捕获和释放实体的方法，所述实体为蛋白质、囊泡、经聚(乙二醇)改性的化合物和/或药物，所述方法包括：通过电化学不敏感的芳基键的单层将ph响应性聚合物与结构共价结合，从而形成聚电解质配置；当共价结合的聚合物处于中性状态时，使包含所述实体的溶液与聚电解质配置接触，从而允许聚电解质配置通过非静电相互作用捕获所述实体；以及在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置施加电化学电位，以引起聚电解质配置中从聚合物的中性状态到聚合物的带电状态的转换，从而通过静电排斥从聚电解质配置中释放实体；以及可能地，在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置施加电化学电位，以引起聚电解质配置中从聚合物的带电状态到聚合物的中性状态的转换，从而允许聚电解质配置通过非静电相互作用捕获实体。51.非静电相互作用可以为例如氢键。附图说明52.下面将参照附图中示出的实施方案更详细地描述本发明，在附图中：53.图1示出了用于产生电化学活性和ph响应性刷界面，即根据本发明的电化学捕获-释放系统的聚电解质配置的电化学活性和ph响应性刷界面的方案。54.图2示出了通过在聚电解质刷paa和pmaa，即根据本发明的电化学捕获-释放系统的聚电解质配置的spr中滴定来确定刷pka。55.图3示出了在qcm中监测的电化学多酸刷转换，即根据本发明的电化学捕获-释放系统的聚电解质配置的电化学多酸刷转换。还示出了改变缓冲剂ph的响应以进行比较。56.图4示出了监测使用等离子体纳米孔阵列的根据本发明的界面电化学捕获-释放系统的亲和素蛋白在ph5时通过氢键相互作用(圆圈)向中性pmaa刷的固定，以及在ph8时通过静电吸引(交叉)向带电pmaa刷的固定，接着是在ph11.5时由于静电排斥而完全不存在蛋白质结合(正方形)(亲和素的pi为10)(响应与覆盖率成线性)。57.图5示出了在暴露于血清之前和之后的固定的bsa的荧光强度。58.图6示出了不同蛋白质的表面覆盖率的量化(fib：纤维蛋白原，gox：葡萄糖氧化酶，igg：免疫球蛋白，glu：葡糖苷酶，avi：亲和素，bsa：牛血清白蛋白，navi：中性亲和素，hrp：辣根过氧化物酶，myo：肌球蛋白，lys：溶菌酶，ubi：泛素，ins：胰岛素，ins-gla：甘精胰岛素，serum：10倍稀释且过滤的血清)。59.图7示出了实时显示igg的逐步释放的电化学qcm。60.图8a示出了电化学捕获和释放系统以及制备该系统的方法中的不同步骤。还示出使用这样的系统来捕获和释放蛋白质。61.图8b示出了表面官能化期间以及多次固定和释放循环之前和之后的spr谱。62.图9示出了固定至叉指形微电极条的蛋白质的荧光，在所述叉指形微电极条中通过从一个电极局部释放绿(白电极)蛋白质，随后通过第二固定步骤向空聚合物刷电极添加红(黑电极)蛋白质来完成图案化。63.图10示出了bsa和igg在固定之前和释放之后的圆二谱。64.图11示出了在固定之前和释放之后的gox活性的michaelis-menten分析。65.图12示出了显示出因电化学引起的酸化而产生的刷塌陷的电化学qcm。示出通过泵送改变缓冲剂时的响应以进行比较。66.图13示出了通过在具有5mm氢醌的pbs中施加+0.5v的原位电化学qcm蛋白质“按需吸附”。67.图14示出了用于合成重氮盐1的方案。68.图15示出了电化学沉积的重氮盐与裸金电极相比的循环伏安(voltagram)扫描，以及比较化学沉积的重氮盐与电化学沉积的重氮盐的通过spr的相应空气扫描。仅在重氮盐以化学方法沉积时，层才足够薄以产生法拉第反应(faradaicreaction)，这意味着需要化学沉积来实现聚电解质刷，即根据本发明的聚电解质配置的电化学转换。69.图16.通过qcm监测的在ph5时脂质体与pmaa的相互作用，其显示出通过根据本发明的电化学捕获-释放系统高负载数个多层脂质体随后电化学释放。70.图17示出了原位电化学qcm测量，在测量中使血清(用水稀释10倍并过滤，ph7.4)暴露于电化学捕获-释放系统，从而引起血清蛋白的自发固定(步骤1)。在实验中在15分钟、22分钟和27分钟时施加具有0v至-0.5v电位窗口的20次重复cv扫描，从而引起部分蛋白质释放(步骤2)。施加具有0v至-0.75v的更大电位窗口的50次重复cv扫描，从而引起由电化学捕获-释放系统完全释放蛋白质。71.图18示出了其中将稀释的血清引入到在铂表面上合成的pmaa刷中的原位电化学qcm实验，其中，在(a)中，表面的电化学活化(连续cv扫描)产生表面的高度无污状态，与在(b)中没有电化学活化相比，然而当施加足够大的电位时，仍然实现结合的蛋白质的完全解吸。72.图19示出了其中使用过氧化氢来转换在铂表面上官能化的pmaa刷的原位电化学qcm实验，如频率和耗散信号、(c)中示出的刷通过交替计时电流施加+0.6v和+0.2v的电位而快速转换以及(d)中示出的作为时间的函数的相应电流记录所示。73.图20示出了在铂表面上合成的经gox酶共价官能化的聚电解质刷的原位电化学qcm实验。当施加正电位(+1.0v和+1.2v)时，刷在含有10mm葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水溶液中可逆地转换。具体实施方式74.以下描述的具有进一步发展的本发明的实施方案仅被视为实例，而绝不旨在限制专利权利要求所提供的保护范围。75.图8a中示出的是用于重复使用的电化学捕获-释放系统1。所述系统1包含ph响应性聚合物2，所述ph响应性聚合物2通过电化学不敏感的芳基键的单层4与结构3共价结合，从而形成聚电解质配置5。聚电解质配置5被布置成：当共价结合的聚合物2处于中性状态时，通过非静电分子内结合例如氢键合捕获实体6，所述实体6为蛋白质、囊泡或经聚(乙二醇)改性的化合物，而当聚合物2处于带电状态时，通过静电排斥释放由聚电解质配置5捕获的实体6。布置了用于在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置5施加电化学电位以引起聚电解质配置5从中性状态到带电状态或相反的转换的装置7。下面描述了可以如何制造这样的系统1以及这样的制造所需的材料和化学品。下面还描述了如何使用该系统并给出了不同的这样的用途的实例。76.实验77.材料78.除非另有说明，否则使用的所有化学品和蛋白质均购自sigma-aldrich。h2o2(30％)和nh4oh(28％至30％)来自acros，而h2so4(98％)和乙醇(99.5％)来自solveco。水是astm研究级1型超滤水(milli-q-水)。用于合成重氮盐1的化学品为4-氨基苯乙醇、四氟硼酸(48％水溶液)、乙腈、硝酸叔丁酯和乙醚。为了将重氮盐附接至金，在水中使用l-抗坏血酸。在将重氮单层转化为聚合引发剂层时，使用二氯甲烷、三乙胺和α-溴异丁酰溴。聚合中采用的化学品为丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲磺酸、n,n,n’,n”‑五甲基二亚乙基三胺(pmdta)、cubr2和l-抗坏血酸。本工作中使用的缓冲剂基于磷酸盐缓冲盐水(pbs)片剂(0.01m磷酸盐，0.13mnacl，ph7.4)或者用hcl(1m水溶液)或naoh(1m水溶液)滴定至特定ph的磷酸氢二钠和nacl。peg-琥珀酰亚胺基戊酸酯(peg-sva，10,000g/mol)被用于与bsa(laysanbioinc.)缀合。用于制备脂质体的脂质磷脂酰胆碱和二棕榈酰基磷脂酰胆碱由avantipolarlipids获得。dna样品(单链和双链)可获自内部合作者。对于酶活性测定，使用2,2’‑连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)和d-葡萄糖。79.本研究中使用的蛋白质为亲和素(avi，thermofisher)、牛血清白蛋白(bsa)、bsa-异硫氰酸荧光素缀合物、来自牛血浆的纤维蛋白原(fib)、来自黑曲霉(aspergillusniger)的葡萄糖氧化酶(gox)vii型g2133、辣根过氧化物酶(hrp，thermofisher)、胰岛素(ins)、ins甘精胰岛素、来自人血清的igg抗体、来自马骨骼肌的肌红蛋白(myo)、溶菌酶(lys)、中性亲和素(navi，pierce)和来自牛红细胞的泛素(ubi)。人血清(来自人男性ab血浆)在使用之前通过40μm亲水过滤器过滤并在pbs中稀释十倍。使用alexafluortm488和555标记试剂盒(thermofisher)产生不同颜的bsa以展示蛋白质图案。用于研究与pmaa刷的相互作用的碳水化合物为来自明串珠菌属(leuconostocspp.)的葡聚糖(100,000g/mol)、来自马链球菌(streptococcusequi)的透明质酸钠盐(15,000g/mol至30,000g/mol)。还测试了醋酸催产素盐水合物。80.用于引起聚电解质配置中从聚合物的带电状态到所测试的聚合物的中性状态的转换的氧化还原活性物质为氢醌、过氧化氢、盐酸多巴胺(dopa)、抗坏血酸、4-氨基苯乙醇(对羟苯基乙醇)、3,4-二羟基(dopac)、和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型二钠盐水合物(nadh)。81.方法82.重氮盐合成：83.重氮盐的合成(图14)涉及修改的文献程序(s.gam-derouich等,aryldiazoniumsaltsurfacechemistryandatrpforthepreparationofmolecularlyimprintedpolymergraftsongoldsubstrates.surfaceandinterfaceanalysis42,1050-1056(2010))。在惰性气氛下，将4-氨基苯乙醇(2.94g，20mmol)和四氟硼酸(9.94g，113mmol)溶解在乙腈(20ml)中。在单独的烧瓶中，将硝酸叔丁酯(2.269g，22mmol)溶解在乙腈(12ml)中。将两种溶液与200ml乙醚一起脱气并冷却至-20℃。在20分钟之后，将溶液温热至0℃，之后在搅拌下将硝酸叔丁酯溶液滴加到4-氨基苯乙醇溶液中。然后将反应再搅拌1小时。通过将深黄溶液滴加到快速搅拌的乙醚(200ml)中来终止反应。在另外搅拌1小时之后，倾析出上清液。将棕沉淀物干燥，并获得3.69g不纯的重氮盐。为了验证产物，在环境温度下在varian400mhznmr波谱仪上记录1hnmr波谱。相对于外部tms分析波谱并参照最低场残余溶剂共振(cdcl3：δh7.26ppm)。重氮盐的1hnmr共振与先前报道的那些(s.gam-derouich等,aryldiazoniumsaltsurfacechemistryandatrpforthepreparationofmolecularlyimprintedpolymergraftsongoldsubstrates.surfaceandinterfaceanalysis42,1050-1056(2010))相匹配，并且分析显示80％的纯度。84.表面清洁：85.在表面官能化之前，将qcm传感器晶体(标准au，购自biolinscientific)和spr传感器表面(标准au，购自bionavis)在食人鱼洗液(piranhawash)(h2so4:h2o2，3:1v/v)中清洗10分钟，然后在milli-q中冲洗。接着，进行rca1洗涤(h2o:h2o2:nh4oh5:1:1v/v，在75℃下持续20分钟)，然后在milli-q中另一次冲洗，在乙醇中超声处理并用n2干燥。对于微电极，省略了食人鱼洗涤步骤，以防止由于多孔金膜的分层而破坏表面。86.表面活化：87.将金表面(qcm传感器和spr传感器)放置在包含重氮盐1(0.301g，1.28mmol)的具有隔膜密封的玻璃罐中，并用n2对罐进行吹扫。在单独的烧瓶中，将抗坏血酸(0.028g，0.16mmol)溶解在水(40ml)中并将溶液脱气1小时。然后，将抗坏血酸溶液转移到密封的玻璃罐中，使重氮盐溶解。通过使用平台振动器将金表面在溶液中搅拌1小时(15分钟后在表面上出现的氮气泡表明成功形成重氮盐单层)，之后将其在水然后是乙醇中彻底冲洗，并干燥。为了将重氮单层(单层在图8a中示出并在图8b和图15中表征)转化为聚合引发剂层，使金表面暴露于二氯甲烷(20ml)中的α-溴异丁酰溴(0.222ml，1.80mmol)和三乙胺(0.302ml，2.17mmol)10分钟，之后将表面在乙醇中冲洗并在n2下干燥。88.表面引发聚合：89.使用atrp以与公布的程序(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))类似的方式制备pmaa聚合物刷，即本发明的聚电解质配置。使用氧化铝柱从单体甲基丙烯酸叔丁酯中去除抑制剂，之后将其在-20℃下储存，然后在临使用之前升温至室温。在n2惰性气氛下使用标准schlenk线技术进行反应。将cubr2(0.006g，0.03mmol)和pmdta(0.052ml，0.246mmol)溶解在二甲基亚砜(20ml)中，并与甲基丙烯酸叔丁酯(20ml，0.1231mol)的单独烧瓶一起通过强烈的n2鼓泡脱氧30分钟。然后通过套管将反应溶液和单体转移到包含引发剂制备的金表面的螺旋盖罐(带有橡胶隔膜盖)中。通过添加抗坏血酸(0.033g，0.185mmol)引发反应。反应介质中的各组分的最终浓度为：[单体]＝3.1m，[cubr2]＝0.6mm，[pmdta]＝6.2mm，以及[抗坏血酸]＝4.6mm。将反应置于磁力搅拌下。通过将样品浸入纯乙醇中淬灭反应。然后通过使聚(甲基丙烯酸叔丁酯)(ptbma)刷暴露于二氯甲烷(10ml)中的0.2mm甲磺酸15分钟，随后在二氯甲烷和乙醇中冲洗来将其转化为pmaa。对于paa，使用丙烯酸叔丁酯作为起始单体，其他方面具有相同方案。[0090]多孔碳电极：[0091]使用网状玻璃碳电极(redox.me)作为用于评估电化学捕获和释放系统的可能的蛋白质纯化能力的多孔电极。电极的体积密度为0.05g/cm3、孔隙率为96.5％，并且孔数为24个孔/cm，其中直径为20mm且高度为25mm(7.85cm3)。多孔碳电极内pmaa的表面活化和atrp合成是通过将配方以相同的浓度和80ml的总反应体积放大2倍来使用的。通过浸入设定为ph5.0的40mg/ml的bsa蛋白质溶液中1小时来进行蛋白质固定测试。然后将电极冲洗并浸入设定为ph8.0的pbs的烧杯中以引起结合的蛋白质的释放。通过测量电极浸入之后原始bsa溶液中的蛋白质浓度和释放有蛋白质的烧杯中的蛋白质浓度来评估电极的静态结合容量。使用nanodrop(thermofisherscientific)测量捕获和释放的蛋白质的量化。石英晶体微天平：[0092]使用涂覆有金的传感器晶体并使用q-sensee4(biolinscientific)进行测量。示出的所有数据对应于第一或第三泛频峰(overtone)。使用具有电化学模块(qem401)的流动池进行原位电化学实验。将gamryinterface1000e恒电位仪(gamryinstruments)连接至电化学电池。对于每个实验，测量电路的内阻(getru)并测量开路电位，以验证可接受的参比电极性能和正确连接的电路。使用的参比电极为worldprecisioninstrument的低泄漏“dri-ref”电极。除非另有说明，否则cv实验中的扫描速率为100mv/秒。[0093]表面等离子体共振：[0094]在空气和水二者中在sprnavi220a仪器(bionavis)上进行测量。在三个不同的激光波长上和两个不同的流道中记录全内反射(tir)和spr角。所使用的缓冲剂的流量为20μl/分钟。通过将恒电位仪(与对于qcm相同)连接到为该目的而设计的电池(来自仪器制造商)来进行电化学spr测量。在fresnel建模(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))中，假设沉积的重氮层具有1.5的折射率(对于有机涂层是典型的)。对于paa和pmaa，假设干聚合物刷的折射率相等并设定为1.522。假设聚电解质刷中结合的干蛋白质的折射率与聚合物的折射率相等。这种分析spr谱及其有效性的方法已在先前的工作(g.ferrand-drakedelcastillo等,enzymeimmobilizationinpolyelectrolytebrushes:highloadingandenhancedactivitycomparedtomonolayers.langmuir35,3479-3489(2019))中进行了描述和证明。为了获得表面覆盖率，将干聚合物和蛋白质的密度分别设定为1.22g/cm3和1.35g/cm3。[0095]用纳米孔阵列的等离子体检测：[0096]如先前所述(a.b.dahlin等,high-resolutionmicrospectroscopyofplasmonicnanostructuresforminiaturizedbiosensing.analyticalchemistry81,6572-6580(2009))进行微米尺度消光光谱法。简而言之，使表面以透射模式成像，并将一部分光引导至焦平面中光纤的开口。检测点(通常50μm)取决于光纤直径和物镜放大倍率。分辨率几乎与spr中一样高(下降至0.1ng/cm2)。注意，作为以nm为单位的共振位移呈现的所有数据都来自等离子体纳米孔阵列，而以度为单位的共振位移来自常规的角spr。微电极的制造：[0097]为了产生微米尺度条电极，使用激光印字机(heidelberginstrumentsdwl2000)。以4000rpm旋涂光致抗蚀剂(lor3a)并将其在180℃的热板上烘烤5分钟。以4000rpm旋涂第二层s1813并将其在120℃的热板上烘烤2分钟。通过60mw激光束写入图案，之后使样品在显影剂mf-318中显影50秒。然后通过胶体光刻制备纳米孔阵列(k.xiong,g.emilsson,a.b.dahlin,biosensingusingplasmonicnanoholearrayswithsmall,homogenousandtunableaperturediameters.analyst141,3803-3810(2016))。最后，在去除剂rm-rem400中进行剥离。[0098]蛋白质的非原位电化学解吸：[0099]为简单起见，在一些实验中，蛋白质的固定和释放没有实时监测。相反，使用来自spr和qcm测量的动力学作为指导，将表面浸入蛋白质溶液中30分钟以确保饱和结合。蛋白质加载之后，将表面在ph5.0的pbs和水中冲洗，然后用n2干燥。通过将样品浸入具有高phasupported,three-dimensionallipidvesiclematrixprobedbyqcm-dandspr.chemphyschem5,729-733(2004))制备囊泡。简而言之，通过使溶剂蒸发将脂质干燥到玻璃小瓶的内部，随后在缓冲剂中再水合并通过直径为100nm的聚碳酸酯径迹蚀刻膜(polycarbonatetrack-etchedmembrane)挤出。[0110]实施例[0111]通过表面引发活化剂再生的原子转移自由基聚合(atrp)在金表面上制备聚(丙烯酸)(paa)和聚(甲基丙烯酸)(pmaa)刷，即制备根据本发明的电化学捕获-释放系统-刷表征和转换。[0112]我们通过表面引发活化剂再生的原子转移自由基聚合(atrp)在金表面上制备了聚(丙烯酸)(paa)和聚(甲基丙烯酸)(pmaa)刷，即本发明的聚电解质配置，即我们制备了根据本发明的电化学捕获-释放系统。合成了重氮盐(s.gam-derouich等,aryldiazoniumsaltsurfacechemistryandatrpforthepreparationofmolecularlyimprintedpolymergraftsongoldsubstrates.surfinterfaceanal42,1050-1056(2010))(图14)并将其通过抗坏血酸还原以产生与金共价连接的芳基单层(图1，图15)。单层转化为atrp引发剂层，之后进行聚合(图1)。弱多酸刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)具有如通过表面等离子体共振(spr)确定的数十nm范围内的干厚度(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))。通过在spr中滴定来分析刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)的有效pka(图2)。如我们先前示出的(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))，这产生与由通过红外光谱法分析获得的结果(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))相同的结果。注意，多酸刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)的高pka值(与溶液中的相同分子相比)是期望的((t.wu等，behaviorofsurface-anchoredpoly(acrylicacid)brusheswithgraftingdensitygradientsonsolidsubstrates：1.experiment.macromolecules40，8756-8764(2007)；以及n.schuwer，h.a.klok，tuningthephsensitivityofpoly(methacrylicacid)brushes.langmuir27，4789-4796(2011))，并且与paa相比pmaa的pka更高也一样(gferrand-drakedelcastillo，g.emilsson，a.dahlin，quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122，27516-27527(2018))。[0113]我们发现我们的表面官能化方案(图15所示)提供了在电化学电位扫描期间是稳定的，同时仍然允许法拉第反应的聚合物锚。此外，刷(即本发明的聚电解质配置)对还原电位是电响应性的，因为这通过消耗质子和氧而增加了局部ph：[0114]o2+4h++4e-→2h2oꢀꢀꢀ(1)，[0115]o2+2h++2e-→h2o2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ(2)，[0116]h2o2+2h++2e-→2h2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ(3)[0117](t.k.tam等，reversible“closing”ofanelectrodeinterfacefunctionalizedwithapolymerbrushbyanelectrochemicalsignal.langmuir26，4506-4513(2010))。[0118]电化学石英晶体微天平(o.v.borisova，l.billon，r.p.richter，e.reimhult，o.v.borisov，ph-andelectro-responsivepropertiesofpoly(acrylicacid)andpoly(acrylicacid)-block-poly(acrylicacid-grad-styrene)brushesstudiedbyquartzcrystalmicrobalancewithdissipationmonitoring.langmuir31，7684-7694(2015))(qcm)数据显示，刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)可以通过电位控制完全转换到其带电状态，即响应与使具有远高于刷pka和低于刷pka的ph的缓冲剂流动时相同(图2和图3)。这意味着通过施加电化学电位，界面ph可以移位以在完全带电状态(刷内的聚电解质的所有单体都带电)与完全中性状态(其中所有单体都是中性和质子化的)之间移动。通过施加较弱的电化学信号，产生的ph梯度在大小方面较小，这导致图2所示的作为ph的函数的与充电程度成正比的刷的部分充电。即使在缓冲环境中转换也非常快(＜1秒)，并且不存在聚合物解吸的迹象。我们将此归因于刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)下面的高度易受影响的电极表面，以及电化学不敏感的芳基-金键。如所预期的，基于硫醇的锚定导致聚合物在负电位下解吸(t.ghaly，b.e.wildt，p.c.searson，electrochemicalreleaseoffluorescentlylabeledthiolsfrompatternedgoldsurfaces.langmuir26，1420-1423(2010))，并且电接枝的芳基重氮层阻止电子转移(j.pinson，f.podvorica，attachmentoforganiclayerstoconductiveorsemiconductivesurfacesbyreductionofdiazoniumsalts.chemicalsocietyreviews34，429-439(2005))(图15)。在经氮气吹扫的缓冲剂中刷显著更难转换，这证实了该效果来源于水溶液(在ntp下约0.3mm)中无处不在的o2。我们观察到液体流速对转换能力没有影响。[0119]通过在酸性ph溶液中施加负电位，我们能够示出电极界面处的ph的局部增加。然而，我们还通过以下实现了聚电解质刷从带电到中性的转换：在氧化还原物质的存在下施加正电位，所述氧化还原物质产生质子，从而产生局部酸化界面。例如，在图12中，当在5mm氢醌(hq)的存在下施加正电位(+0.5v)时，所述氢醌根据方程式3(n.fomina等，anelectrochemicalplatformforlocalizedphcontrolondemand.labchip16，2236-2244(2016))hq→h++q-(3)产生局部增加的质子浓度(ph降低)，实现了聚电解质刷的电化学诱导塌陷。[0120]用多种不同的氧化还原物质产生ph的局部降低，我们甚至发现生物存在的分子(例如多巴胺)可以使刷转换，但氢醌最容易发生反应以产生快速酸化。[0121]生物环境通常不包含用于在体内电化学转换刷的足够高浓度的醌或氧化还原活性神经传递物质。为了扩大捕获和释放系统还在缓冲中性ph环境中的有用性，我们研究了用于获得pmaa刷的电化学转换的利用大量的天然存在的物质的替代途径。此外，我们还研究了使用除金之外的其他电极支撑体的可能性，这可以扩大表面上可以发生的电化学反应的范围，并且还可能降低实现电化学转换所需的电位窗口。[0122]当使用铂代替金作为下方的电极表面时，这导致改变的电化学特性。铂电极需要较小量级的电位(+/-10mv)来改变刷ph。此外，铂的电化学特性使其可以进行更多的电化学hydrogen-bonding.journalofpolymersciencepartc-polymerletters14,129-134(1976)；以及k.l.smith,a.e.winslow,d.e.petersen,associationreactionsforpoly(alkyleneoxides)andpolymericpoly(carboxylicacids).indengchem51,1361-1364(1959))。注意，在ph5下，通常认为蛋白质的二级结构得到保持或至少不是不可逆地改变。所有蛋白质都被不可逆地固定，因此固定期间的蛋白质浓度仅影响加载速率，而不影响最终量。此外，蛋白质在用水洗涤之后并且甚至在暴露于生理流体之后保持结合。图5示出了在暴露于设定为ph5的全血清之前和之后的pmaa刷(即根据本发明的电化学捕获-释放系统)中的经标记的bsa的荧光，显示出强度未降低。这也证实了固定的蛋白质不能被其他蛋白质替代，尽管如果刷尚未达到其满载容量，则另外的血清蛋白也变得固定。[0127]我们强调，我们的方法与使用聚电解质刷进行蛋白质固定的常规方法相反：在此，聚合物在其带电状态下(当ph》pi时)提供排斥。我们的结果可能看起来与先前的研究相矛盾，在先前的研究中即使在携带相同净电荷时，例如由于表面上的局部“补丁”，蛋白质与带电聚合物结合(x.xu,s.angioletti-uberti,y.lu,j.dzubiella,m.ballauff,interactionofproteinswithpolyelectrolytes:acomparisonbetweentheoryandexperiment.langmuir,(2018)；以及a.b.kayitmazer,d.seeman,b.b.minsky,p.l.dubin,y.xu,protein–polyelectrolyteinteractions.softmatter9,2553-2583(2013))。这在很大程度上通过以下事实来解释：我们所有的测量都是在其中筛选消除了静电吸引的生理离子强度下进行的。此外，处于其带电状态的高度亲水刷如pmaa(约90％水)由于构象熵损失和渗透压预期也排斥蛋白质(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))。[0128]通过将fresnel模型拟合至在干燥状态下记录的spr谱来量化固定的蛋白质的量(图5)。由于蛋白质折射率与聚合物的折射率非常相似，因此该方法提供高准确性(g.ferrand-drakedelcastillo等,enzymeimmobilizationinpolyelectrolytebrushes:highloadingandenhancedactivitycomparedtomonolayers.langmuir35,3479-3489(2019))。测试了具有不同分子量(m)和pi的多种蛋白质，在所有情况下都产生高表面覆盖率(图6)。当归一化为pmaa的覆盖率时，蛋白质量与m(p《0.05)相关，但与pi无关，证实了结合不是由于静电吸引引起的。m越高则表面覆盖率越高的趋势可以由简单的缩放理论来理解：假定聚合物与尺寸为r的蛋白质的表面相互作用，则与蛋白质接触的聚合物的量与r2成正比，而m与r3成正比。因此，每质量可用聚合物的固定的蛋白质的质量应与m1/3成比例，与我们的结果合理一致。剩余的变化可以归因于蛋白质表面上不同程度的良好氢键受体基团。结果强烈表明聚合物“环绕”亲水蛋白质的外部。注意，即使是最低的固定量，417ng/cm2的辣根过氧化物酶仍然对应于超过一个单层。此外，可以将刷(即本发明的聚电解质配置)制造得更厚以储存甚至更多的蛋白质。在本工作中，我们保持水合厚度与spr中的瞬逝场相当，以使得能够实现高度探测(g.ferrand-drakedelcastillo,g.emilsson,a.dahlin,quantitativeanalysisofthicknessandphactuationofweakpolyelectrolytebrushes.jphyschemc122,27516-27527(2018))。如由桥接数个链的多价相互作用所预期的(j.yu等,multivalentcounterionsdiminishthelubricityofpolyelectrolytebrushes.science360,1434(2018))，蛋白质固定导致刷的压缩，从而克服了插入的熵惩罚(entropicpenalty)(n.fomina等,anelectrochemicalplatformforlocalizedphcontrolondemand.labchip16,2236-2244(2016))。[0129]蛋白质向聚合物刷固定的高容量表明其可以用于蛋白质纯化应用(jainp,bakergl,brueningml.applicationsofpolymerbrushesinproteinanalysisandpurification.annurevanalchem.2,387-408(2009))。原则上，平坦表面上的pmaa刷的蛋白质表面覆盖率(图6)应转化为与多孔固体支撑体内的聚合物刷相等而不是与平坦表面的表面覆盖率相等的表面覆盖率。每体积经聚电解质刷功能化的多孔固体支撑体的相应蛋白质结合可能变得非常高。我们通过使网状玻璃(玻璃状)碳电极固体支撑体内的pmaa刷聚合并对用于平坦表面的合成方案进行细微调整来测试这一点。干电极支撑体的重量增加140mg/cm3表明在电极的整个内表面内成功聚合。在ph5下，pmaa功能化的电极的bsa蛋白摄取确定为50mg/cm3(静态结合容量)。然而，通过以下优化很可能的是结合容量可以甚至进一步增加：(1)在高内表面积材料内的聚合物刷合成，以及(2)使孔隙率和聚合的可用表面积最大化。在我们的初步测试中，我们使用了具有非常高的内部孔隙率(96.5％)的多孔支架，如果用于流动应用(大多数商业蛋白质纯化设备都是这种情况)，则这是有利的，因为其显著降低压降并增加整个电极的质量传输。然而，高的内部孔隙率降低内表面积。通过优化支架内的聚合物刷合成，孔隙率与表面积之间的折衷很可能会被显著推向高孔隙率，因为聚合物刷显示的每表面积的蛋白质固定容量非常高(与常规表面相比至少为100倍)。在先前对经聚(羟基乙基)丙烯酸酯(phea)聚合物刷功能化的多孔氧化铝膜的蛋白质结合容量的研究中显示出150mg/cm3的蛋白质结合容量(sunl,daij,bakergl,brueningml.high-capacity,protein-bindingmembranesbasedonpolymerbrushesgrowninporoussubstrates.chemmater.18,4033-4039(2006))，其是应当可实现的蛋白质固定容量，但决不对我们的电化学蛋白质捕获和释放系统的多孔电极支撑体的容量构成限制。总之，我们的方法可以以与常规谱法(gagnonp.technologytrendsinantibodypurification.jchromatogra.1221,57–70.(2012))相同范围内的结合容量用于蛋白质纯化，同时提供与有利的流通特性、高传质速率和最小压降结合的电化学引起的结合和洗脱。在ph5下，一些其他化合物也可以与pmaa大量结合。一个重要的实例为聚(乙二醇)(peg)和经peg改性的化合物。蛋白质的peg修饰不会导致其从刷中排除。相反，我们观察到与处于天然状态的相同蛋白质的量相当的量的结合。这预期是由于与peg中的醚氧的氢键(y.osada,m.sato,thermalequilibriumofintermacromolecularcomplexesofpolycarboxylicacidsrealizedbycooperativehydrogen-bonding.journalofpolymersciencepartc-polymerletters14,129-134(1976))。此外，脂质体可以以多层结合(图16)而无需系链(c.m.agrawal,k.a.athanasiou,techniquetocontrolphinvicinityofbiodegradingpla-pgaimplants.jbiomedmaterres38,105-114(1997))。[0130]这些结果表明对于在其中经peg改性的化合物和脂质体载体是常见的药物递送中应用的高潜力。同时，对于其他生物大分子，例如多糖(例如透明质酸)、核糖核酸(例如双链dna)或短肽(例如催产素)，完全未检测到结合。因此，pmaa刷对蛋白质和一些其他类型的大分子极具特异性。[0131]当刷的ph增加时，发生蛋白质从刷中解吸。解吸背后的机制与蛋白质捕获期间发生的相反。当载有蛋白质的刷内的ph增加时，聚电解质刷的羧酸被去质子化，从而破坏刷与蛋白质之间的键。此外，当ph改变而高于刷的pka时，刷变得带负电，类似地，当ph高于等电点时，蛋白质变得带净负电，从而引起蛋白质与刷之间的静电排斥。电化学转换刷的可能性(图3)以及蛋白质在足够高的ph下解吸的事实表明控制释放是可能的。我们首先通过在qcm中施加重复的伏安扫描来证实这一点(图7)，其显示出信号逐渐返回至基线(固定之前)。spr谱显示出相同的行为(图8b)，并且捕获-释放可以在同一表面上再现，而储存容量或释放效率没有可检测到的变化(测试多达10次循环)。我们还观察到，对于具有高pi的蛋白质，必须施加负电位持续更长时间以充分提高ph，但测试的所有蛋白质都可以完全释放。此外，我们使用具有等离子体纳米孔阵列的微电极来证明局部释放和图案化。在此，我们还参考了a.b.dahlin等,high-resolutionmicrospectroscopyofplasmonicnanostructuresforminiaturizedbiosensing.analyticalchemistry81,6572-6580(2009)。图9示出了通过选择性释放和随后的固定在不同微电极上的蛋白质的图案化。[0132]为了测试蛋白质的高级结构在捕获和释放之后被保持，我们对bsa和igg进行了圆二谱，显示出二级结构没有可检测到的变化(图10)。此外，gox活性测定的michaelis-menten分析表明在固定和解吸之后酶活性的非常小的变化(图11)。我们认为保留的生物活性非常显著，因为许多固定方法，特别是疏水相互作用(j.n.talbert,j.m.goddard,enzymesonmaterialsurfaces.colloidsandsurfacesb:biointerfaces93,8-19(2012))引起蛋白质的解折叠和生物活性的丧失。我们将保持的二级结构归因于与蛋白质外表面而不是内部的氢键相互作用，这与分子量依赖性一致。溶液的总盐浓度强烈影响刷的pka(ferrand-drakedelcastillog,hailesrln,dahlina.largechangesinprotonationofweakpolyelectrolytebrusheswithsaltconcentration—implicationsforproteinimmobilization.jphyschemlett.11(13):5212-8(2020))。具体地，pka在较低盐浓度下转变为较高值，从而促进在较高ph值下蛋白质与刷结合。对于用水而不是pbs稀释的血清，我们注意到即使在ph7.4下也有非常大量的自发蛋白质固定(图17步骤1)。此外，根据所施加的电化学电位，基于蛋白质对刷的相对静电排斥，我们可以获得蛋白质的电荷选择性分离，即等电点分离。通过在血清暴露期间施加小电位窗口(-0.5v至0v)内的连续循环伏安扫描(图17步骤2)，由于对刷的静电排斥，一部分具有低pi的蛋白质从刷中释放。然而，由于缺乏静电排斥，高pi蛋白质部分保持与刷结合。在释放电化学信号之后，新的蛋白质与当前部分空的刷结合，从而重新填充刷的由于低pi部分产生的未占据空隙体积。通过重复该循环，刷有效地从蛋白质的血清溶液中积累具有高pi的蛋白质，从而产生基于等电点的蛋白质分离。通过将cv扫描窗口改变为更高值(图17步骤3)，所有结合的蛋白质都从刷中释放，这强调了高pi蛋白质仍然可以通过对刷进行足够程度的电化学充电而随时去除。这种用于按需从血清中捕获蛋白质的聚合物刷的电化学活化可以证明在生物分析应用中的蛋白质处理中是有用的。系统在(-0.5v至0v)之间扫描表面时的平均功耗为9μw/cm2，极低功耗的原因在于唯一需要的功率是产生纳米尺度化学ph梯度的功率。功耗与最先进的生物催化生物燃料电池和具有低功率需求的植入技术相匹配(songy,minj,gaow.wearableandimplantableelectronics:movingtowardprecisiontherapy.acsnano.13,12280–12286,(2019))。[0133]在ph7.4的稀释的血清溶液中，我们注意到聚合物刷与保持局部高ph的连续循环伏安扫描相结合，起到产生蛋白质和生物分子高度排斥的表面的作用。当用-0.5v至0v的cv扫描连续扫描铂表面上的pmaa刷时，刷完全抵抗蛋白质结合(图18.a)。相比之下，在暴露于血清之前不进行电化学活化的情况(图18b)下，非常大量的蛋白质固定至刷(数千赫兹和显著的耗散变化)。然而，通过施加20次与(图18a)中所使用的相同的电位范围(-0.5v至0v)内的cv扫描，实现了结合的蛋白质的完全解吸。到目前为止，我们已经通过局部增加电极处的ph示出蛋白质的按需释放或防止蛋白质结合(图7)。但是，由于我们也可以局部降低电极处的ph(图12)，并且基本上可以在电极表面处设定任何ph，这允许在任何溶液ph下蛋白质从缓冲溶液中的电化学活化的捕获和释放。例如，在5mm氢醌的存在下，当施加+0.5v的恒定电化学电位时，我们能够将蛋白质与聚电解质刷结合(图13)。即使在未稀释的pbs(ph7.4)中使用，正电位也使得可以与在ph5下一样有效地引起蛋白质结合。原则上，由铂电极支撑体与gox功能化组合组成的电化学捕获和释放系统可以利用天然浓度的葡萄糖代替氢醌来使刷转换。因此，电化学捕获和释放系统可以在生物环境中操作以按需捕获或释放蛋白质，而无需任何另外的补充。[0134]结论[0135]总之，我们已经示出了新型的在多酸刷(即本发明的聚电解质配置)中的高容量蛋白质固定，以及通过界面ph的电化学控制的随后释放，即根据本发明的电化学捕获-释放系统。蛋白质保持结合在生理流体中，并且其结构得以保持。还可以将表面从排斥转换为蛋白质结合。成功的电化学转换的关键在于用于将聚合物接枝到表面的化学过程。在本工作中，对金、铂和碳电极表面进行了修饰，但该方法适用于可以结合重氮盐的任何表面(j.pinson,f.podvorica,attachmentoforganiclayerstoconductiveorsemiconductivesurfacesbyreductionofdiazoniumsalts.chemicalsocietyreviews34,429-439(2005))。类似地，我们证明了电化学捕获和释放系统的储存容量可以与当前的商业蛋白质纯化材料相匹配，并且可能通过考虑具有更高有效面积的其他结构来进一步提高。我们预测了该技术的几个应用领域。在聚焦蛋白质的分离技术和分析装置中，实施应当是简单的。从长远来看，我们设想利用本文所述的技术(即电化学捕获-释放系统)来从植入装置中控制释放蛋白质例如性抗体。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种用于重复使用的电化学捕获-释放系统(1)，包括：ph响应性聚合物(2)，所述ph响应性聚合物(2)通过电化学不敏感的芳基键的单层(4)与结构(3)共价连接，从而形成聚电解质配置(5)，所述聚电解质配置(5)被布置成，当共价结合的聚合物(2)处于中性状态时，捕获实体(6)，所述实体(6)为蛋白质、囊泡或经聚(乙二醇)改性的化合物，以及当所述聚合物(2)处于带电状态时，通过静电排斥释放由所述聚电解质配置(5)捕获的实体(6)，用于在氧化还原活性物质的存在下向所述聚电解质配置(5)施加电化学电位以引起所述聚电解质配置(5)从所述中性状态到所述带电状态或相反的转换的装置(7)。2.根据权利要求1所述的电化学捕获-释放系统(1)，其中所述ph响应性聚合物(2)为含有羧酸基团的多酸聚合物。3.根据权利要求1至2中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)，其中所述结构(3)为表面例如平坦表面或电极表面、多孔材料或者纳米孔阵列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)，其中所述结构(3)包括碳、贵金属、导电氧化物、不锈钢或导电聚合物，或者由碳、贵金属、导电氧化物、不锈钢或导电聚合物制成。5.根据权利要求1至4中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)，其中所述聚电解质配置(5)包括聚电解质刷、膜、凝胶或层。6.根据权利要求1至5中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)，其中所述系统被小型化，使得所述系统的尺寸的大小是纳米尺度、微米尺度或中尺度。7.根据权利要求1至6中任一项所述的电化学捕获-释放系统(5)，其中用于引起所述聚电解质配置(5)中从所述聚合物(2)的所述带电状态到所述聚合物的中性状态的转换的所述氧化还原活性物质选自氢醌、过氧化氢、盐酸多巴胺(dopa)、抗坏血酸、4-氨基苯乙醇(对羟苯基乙醇)、3,4-二羟基(dopac)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型和还原型二钠盐水合物(nadh)。8.根据权利要求1至7中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)，所述电化学捕获-释放系统(1)还包含与所述聚电解质配置结合的酶。9.一种蛋白质捕获系统，包括根据权利要求1至8中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)。10.一种药物释放系统，包括根据权利要求1至8中任一项所述的电化学捕获-释放系统(1)。11.一种在捕获-释放系统(1)中捕获和释放实体(6)的方法，所述实体(6)为蛋白质、囊泡、经聚(乙二醇)改性的化合物、和/或药物，所述方法包括通过电化学不敏感的芳基键的单层(4)将ph响应性聚合物(2)与结构(3)共价结合，从而形成聚电解质配置(5)，当共价结合的聚合物(2)处于中性状态时，使包含所述实体(6)的溶液与所述聚电解质配置(5)接触，从而允许所述聚电解质配置通过非静电相互作用捕获所述实体(6)，在氧化还原活性物质的存在下向所述聚电解质配置(5)施加电化学电位，以引起所述
聚电解质配置中从所述聚合物(2)的所述中性状态到所述聚合物的带电状态的转换，从而通过静电排斥从所述聚电解质配置中释放所述实体(6)，以及可能地，在氧化还原活性物质的存在下向所述聚电解质配置(5)施加电化学电位，以引起所述聚电解质配置(5)中从所述聚合物(2)的所述带电状态到所述聚合物的中性状态的转换，从而允许所述聚电解质配置通过非静电相互作用捕获实体(6)。

技术总结

一种用于重复使用的电化学捕获-释放系统(1)，其包含pH响应性聚合物(2)，所述pH响应性聚合物(2)通过电化学不敏感的芳基键的单层(4)与结构(3)共价连接，从而形成聚电解质配置(5)，聚电解质配置(5)被布置成：当共价结合的聚合物(2)处于中性状态时，通过非静电相互作用例如氢键捕获实体(6)，所述实体(6)为蛋白质、囊泡或经聚(乙二醇)改性的化合物，而当聚合物(2)处于带电状态时，通过静电排斥释放由聚电解质配置(5)捕获的实体(6)。所述系统还包括用于在氧化还原活性物质的存在下向聚电解质配置(5)施加电化学电位以引起聚电解质配置(5)从中性状态到带电状态或相反的转换的装置(7)。(7)。(7)。