mRNA-LNP递送系统、制备工艺及其在人源间充质干细胞应用的制作方法

mrna-lnp递送系统、制备工艺及其在人源间充质干细胞应用
技术领域
1.本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种mrna-lnp递送系统、递送工艺及其在人源间充质干细胞应用。

背景技术：

2.众所周知，mrna递送入胞过程中面临着两大技术障碍：(1)静电排斥致使的膜屏障；(2)递送途中的酶降解，因此需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mrna的胞内表达，改变mrna胞内的生物分布、细胞靶向和摄取机制，促进mrna的递送，发挥mrna翻译后的效果。为弥补病毒载体的不足，非病毒递送系统因其低毒性、靶向递送的潜力、长期稳定性、dna/mrna装载量较高、化学结构可控、免疫原性较小、易于大量制备而受到越来越多的关注。lnp(lipid nanoparticle)被认为是最具潜力的用于外源mrna递送的非病毒载体。lnp与细胞膜的组成成分相似，均由脂质分子构成，包括可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂、peg脂质，然而其核心专利为加拿大公司arbutus所有，专利保护期20年致使企业对其公开结构和组分配方制备工艺难以自主化应用而陷入研发困境。
3.人源脐带间充质干细胞(msc)被公认为一种难以转染的细胞，细胞转运机制研究发现其主要原因是外源性大分子进入细胞后难以从它的囊泡中逃逸出来，造成表达不充分、转染效率低等问题。然而，mrna-lnp递送工艺在msc中的应用研究以及转染效率的高低一直尚未被研究和验证，因此，总的来说，本项目拟仿市售制剂的处方工艺，或针对市售制剂的处方摸索可能的替代工艺及针对市售制剂的制备工艺摸索可能的替代处方，开发一种mrna-lnp递送系统及其制备工艺应用于人源间充质干细胞中，实现基因修饰型细胞药物的开发用于疾病的新一代升级。

技术实现要素：

4.针对上述不足，本发明的目的是提供一种mrna-lnp递送系统、递送工艺及其在人源间充质干细胞应用。
5.本发明提供了如下的技术方案：
6.一种mrna-lnp递送系统，包括负载一种或多种mrna的lnp非病毒载体，所述lnp非病毒载体包括可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂或/且peg脂质。
7.作为一种mrna-lnp递送系统的优选技术方案，所述可电离阳离子脂质为dlin-mc3-dma或dotap；所述中性辅助磷脂为dspc或dope；所述peg脂质为dspe-peg2000。
8.作为一种mrna-lnp递送系统的优选技术方案，所述可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂以及peg脂质之间的摩尔比例为40:40:10:(5-15)；优选为40:40:10:5、40:40:10:10、40:40:10:10中的一种。
9.作为一种mrna-lnp递送系统的优选技术方案，负载mrna的lnp非病毒载体的平均粒径为76.46nm-196.34nm，其zeta电位为-0.95mv-+47.34mv，其pdi为0.212-0.319。
10.一种mrna-lnp递送系统的制备工艺，包括如下步骤：
11.s1.将可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂或/且peg脂质溶解在无水乙醇中，制备成储备溶液；
12.s2.将相应的脂质成分混合在无水乙醇中作为有机相，至总脂质浓度为10mm，用ph＝4.5醋酸-醋酸钠缓冲液将mrna稀释至150μg/ml作为水相；
13.s3.采用微流控制备系统将步骤s2中水相和有机相进行混合、乳化，得到负载一种或多种mrna的lnp非病毒载体的颗粒悬液；
14.优选的，步骤s2中，mrna中的p元素与阳离子脂质中的n元素的摩尔比为(8-4):1。
15.步骤s3制备得到的颗粒悬液需要进行如下实验：
16.采用纳米粒度仪及zeta电位分析仪测定其有效粒径、多分散系数(pdi)及zeta电位；
17.通过凝胶电泳阻滞实验检测半定量包封率：将载mrna-lnp脂质体悬液分别与少量pbs溶液或triton x-100孵育，进行琼脂糖凝胶电泳阻滞实验，通过image j软件半定量计算mrna的脂质体包封率。
18.lnp递送自复制mrna-egfp至人源msc干细胞并检测egfp在细胞中的表达水平。
19.mrna-lnp递送系统在人源间充质干细胞中的应用。
20.本发明的有益效果是：本发明保护的是自设计脂质组分组成以及各组分之间的比例能够实现mrna-lnp在msc干细胞上的转染，目前所研究最佳处方比例为上述4、5、6、11、12、14、20、23、24、31、32、33处方，本发明创新点在于一方面自设计脂质组分比例形成mrna-lnp，另一方面这些复合表征的mrna-lnp能够实现难转染细胞msc的有效转染，mrna-lnp对msc安全性良好，孵育24h无明显细胞毒、转染过程操作简便，本发明为msc转染提供了新的简便思路，对增强基因修饰型干细胞的胞内蛋白表达提供了更佳的选择。
附图说明
21.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
22.图1是不同处方载mrna-lnp的琼脂糖凝胶；
23.图2是不同处方载mrna-lnp的msc转染24h荧光图；
具体实施方式
24.以下结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本发明中所使用的上、下、左、右等描述仅仅是相对于附图中本发明各组成部分的相互位置关系来说的。
25.本发明是通过以下技术方案实现的：
26.1.lnp所选用脂质组分包括如下：
27.a.dotap、chol、dspc、dspe-peg2000
28.b.dotap、chol、dope、dspe-peg2000
29.c.dlin-mc3-dma、chol、dspc、dspe-peg2000
30.d.dlin-mc3-dma、chol、dope、dspe-peg2000
31.2.各脂质组分之间的比例和其特性是lnp性质的主要影响因素，peg脂质的比例主要影响lnp粒径，阳离子磷脂比例主要影响lnp电位，中性辅助磷脂主要影响lnp靶向性。因此，拟调整dspc与dope的置换对比，peg脂质与阳离子磷脂比例改变，通过测定lnp粒径、pdi、电位表征筛选较优处方。
32.3.拟采用制备方法为乙醇注入法，通过微流控混合技术制备。
33.实验具体步骤
34.第一步，将化合物dlin-mc3-dma、dotap、胆固醇chol、dspc、dope或/且dspe-peg2000(均来自上海艾伟拓有限公司)溶解在无水乙醇中，制备成储备溶液；
35.第二步，按照表1的摩尔比，将相应的脂质成分混合在无水乙醇中作为有机相，至总脂质浓度为15mm，用ph＝4.5醋酸-醋酸钠缓冲液将mrna稀释至150μg/ml作为水相，将浓度为150μg/ml mrna的水相和含有不同浓度的脂质成分的有机相混合，使其n/p比分别为4/6/8，即进行阳离子脂质中的n与mrna中的p摩尔比筛选。
36.表1
[0037][0038]
第三步，采用inanol(上海迈安纳生物科技有限公司)微流控制备系统，制备工艺方案如表2：
[0039]
表2
[0040][0041]
第四步，采用zetasizer lab纳米粒度及zeta电位分析仪测定其有效粒径、多分散系数(pdi)及zeta电位，如表3所示。
[0042]
表3含不同磷脂dspc或dope和不同比例dspe-peg2000的mrna-lnp粒径电位结果
[0043]
[0044][0045]
第五步，通过凝胶电泳阻滞实验检测半定量包封率：将载mrna-lnp脂质体溶液分别与少量pbs溶液或triton x-100孵育，进行琼脂糖凝胶电泳阻滞实验，通过image j软件半定量计算mrna的脂质体包封率；
[0046]
f1.称取2g琼脂糖溶于90ml无核酸酶水中，置于微波炉中加热至完全溶解；
[0047]
f2.将溶液转移到50～60℃的水浴中，直到平衡；
[0048]
f3.在通风橱中，加入10ml northernmax
tm
10
×
变性凝胶缓冲液加入平衡的琼脂糖溶液中，混匀；
[0049]
f4.将琼脂糖溶液倒入通风橱中的制胶盘中，使其凝固，凝胶应为0.6cm，以便有效转移；
[0050]
f5.凝胶硬化后取出待用，在1
×
northernmax
tm
运行缓冲液中进行电泳；
[0051]
f6.将载mrna-lnp脂质体处方分别取适当量进行电泳上样，同时分别设置处方与triton x-100孵育10min，进行mrna-lnp裂解；
[0052]
f7.将上述样本在65℃金属浴中孵育15分钟，使rna二级结构变性；
[0053]
f8.在微型离心机中将样品旋转下来，然后放在冰上2min；
[0054]
f9.使用不含rnase的吸管头将样品加入变性甲醛琼脂糖凝胶中；
[0055]
f10.电压120mv，电流100ma，时间为30min；
[0056]
f11.电泳结束后，在凝胶成像分析仪中观察结果并拍照成像。
[0057]
半定量如表4所示，image j软件半定量计算公式为：
[0058]
包封率％＝(mrna-lnp
(tritonx-100)-mrna-lnp
(无tritonx-100)
)/mrna-lnp
(tritonx-100)
[0059]
表4不同处方载mrna-lnp的包封率半定量结果
[0060][0061][0062]
第五步，lnp递送自复制mrna-egfp至人源msc干细胞并检测egfp在细胞中的表达水平：
[0063]
将包裹了自复制m rna的lnp首先使用无rna酶的1x pbs缓冲液在4℃条件下透析18h，将lnp中的乙醇和醋酸钠缓冲液替换成1x pbs；然后使用10kd超滤管(millipore)进行浓缩，最后使用0.22um的膜(millipore)对lnp进行过滤除菌。将合适量的lnp加入到生长状况良好，密度合适的msc细胞中，细胞放在37℃5％条件下的co2培养箱。通过olympus ix53倒置荧光显微镜观测不同时间点msc细胞中绿荧光蛋白的产生，如图2结果显示，改良型lnp处方4、5、6、11、12、14、20、23、24、31、32、33处方体系均有良好的递送效果并且具有不同程度的荧光蛋白表达。
[0064]
实验结果分析：
[0065]
从表3看出，阳离子脂质在摩尔占比为40％条件，dspe-peg2000摩尔比增加有助于mrna-lnp的形成，5％较低比例均有析出，未形成有效的包裹结构；
[0066]
从处方1-36中优选粒径＜120nm，pdi＜0.05进行凝胶电泳实验发现，形成mrna-lnp后均有较高的mrna包封率；
[0067]
从转染效率来看，改良型lnp处方4、5、6、11、12、14、20、23、24、31、32、33处方均有不同程度的msc转染效率，但dspe-peg2000摩尔比增加不利于mrna的胞内转运，因此处方11、12msc转染效率相对较弱(dspe-peg2000摩尔比15％)，这可能是由于dspe-peg2000长循环结构致使mrna难以从囊泡中逃逸和释放出来。
[0068]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种mrna-lnp递送系统，其特征在于，包括负载一种或多种mrna的lnp非病毒载体，所述lnp非病毒载体包括可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂或/且peg脂质。2.根据权利要求1所述的mrna-lnp递送系统，其特征在于，所述可电离阳离子脂质为dlin-mc3-dma或dotap；所述中性辅助磷脂为dspc或dope；所述peg脂质为dspe-peg2000。3.根据权利要求1或2所述的mrna-lnp递送系统，其特征在于，所述可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂以及peg脂质之间的摩尔比例为40:40:10:(5-15)；优选为40:40:10:5、40:40:10:10、40:40:10:10中的一种。4.根据权利要求1所述的mrna-lnp递送系统，其特征在于，负载mrna的lnp非病毒载体的平均粒径为76.46nm-196.34nm，其zeta电位为-0.95mv-+47.34mv，其pdi为0.212-0.319。5.一种所述的mrna-lnp递送系统的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：s1.将可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂或/且peg脂质溶解在无水乙醇中，制备成储备溶液；s2.将相应的脂质成分混合在无水乙醇中作为有机相，至总脂质浓度为10mm，用ph＝4.5醋酸-醋酸钠缓冲液将mrna稀释至150μg/ml作为水相；s3.采用微流控制备系统将步骤s2中水相和有机相进行混合、乳化，得到负载一种或多种mrna的lnp非病毒载体的颗粒悬液；优选的，步骤s2中，mrna中的p元素与阳离子脂质中的n元素的摩尔比为(8-4):1。6.根据权利要求5所述的mrna-lnp递送系统的制备工艺，其特征在于，步骤s3制备得到的颗粒悬液需要进行如下实验：采用纳米粒度仪及zeta电位分析仪测定其有效粒径、多分散系数(pdi)及zeta电位。7.根据权利要求5所述的mrna-lnp递送系统的制备工艺，其特征在于，步骤s3制备得到的颗粒悬液需要进行如下实验：通过凝胶电泳阻滞实验检测半定量包封率：将载mrna-lnp脂质体悬液分别与少量pbs溶液或triton x-100孵育，进行琼脂糖凝胶电泳阻滞实验，通过image j软件半定量计算mrna的脂质体包封率。8.根据权利要求7所述的mrna-lnp递送系统的制备工艺，其特征在于，步骤s3制备得到的颗粒悬液需要进行如下实验：lnp递送自复制mrna-egfp至人源msc干细胞并检测egfp在细胞中的表达水平。9.一种根据权利要求1-4任一所述的系统在人源间充质干细胞中的应用。

技术总结

本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及一种mRNA-LNP递送系统、递送工艺及其在人源间充质干细胞应用，包括负载一种或多种mRNA的LNP非病毒载体，所述LNP非病毒载体包括可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂或/且PEG脂质，所述可电离阳离子脂质为Dlin-MC3-DMA或DOTAP；所述中性辅助磷脂为DSPC或DOPE；所述PEG脂质为DSPE-PEG2000。本发明创新点在于一方面自设计脂质组分比例形成mRNA-LNP，另一方面这些复合表征的mRNA-LNP能够实现难转染细胞MSC的有效转染，mRNA-LNP对MSC安全性良好，孵育24h无明显细胞毒、转染过程操作简便，本发明为MSC转染提供了新的简便思路，对增强基因修饰型干细胞的胞内蛋白表达提供了更佳的选择。择。