一种快速制备尿激酶原料的方法与流程

1.本发明属于生物工程及化学工程领域，涉及一种快速制备尿激酶原料的方法。

背景技术：

2.尿激酶简称uk，是一种纤溶酶原激活物，由肾脏产生并分泌到尿液中，是一种丝氨酸蛋白酶，能够特异性的识别纤维蛋白溶酶原，并催化其转变成纤维蛋白溶酶。尿激酶可使不溶的纤维蛋白分解成可溶的小肽，从而使血栓溶解。因此，临床上常用uk急性心肌梗塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞、血栓性闭塞性疾病、肺栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(54000dal)和低分子量尿激酶(33000dal)两种，高分子量尿激酶溶解血栓的临床效果比低分子量的尿激酶约高3倍，国际上把尿激酶的相对分子量作为质量标准的重要指标之一。
3.中国专利申请201510549397.4公开了一种制备尿激酶的方法，该方法直接在小便池或便斗中用装改性硅胶的滤布袋吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的滤布袋运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。本方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括改性硅胶，大孔树脂，甲壳素，离子树脂等，对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法对厕所的卫生状况无明显影响，并大幅度降低了尿液运输的成本以及带来的一系列环境问题。但以上方法中所用的改性硅胶制备方法复杂，成本高，且得到的尿激酶产品活性较低。
4.中国专利申请201510549397.4公开了一种尿激酶的制备方法及其冻干粉，具体包括以下步骤：(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯。所述步骤(3)中将步骤(2)得到的尿激酶精品溶解后，将尿激酶精品溶液加入阳离子交换层析柱进行提纯；将提纯后的尿激酶进行冻干即得到尿激酶冻干粉。但以上方法中制备尿激酶粗品使用的是普通的硅胶柱，洗脱效果较差，后续仍需要较为复杂的过滤、提纯步骤，使得生产工艺更为复杂，生产成本相对较高。
5.因此，有必要探索一种制备方法简单、生产成本低、收率高、可快速制备高质量尿激酶原料的方法。

技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的提供了一种方法简单、生产成本低、收率高的快速制备尿激酶原料的方法，该方法得到的尿激酶原料活性较高。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.首先，提供了一种尿激酶原料的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)将尿液中加入改性硅胶进行吸附；
10.(2)用水冲洗改性硅胶，用洗脱液ⅰ进行洗脱，收集洗脱液；
11.(3)洗脱液中加入硫酸铵溶液，搅拌，取上清；再补加硫酸铵，搅拌溶解后，过滤，收集沉淀，制得尿激酶粗品；
12.(4)取尿激酶粗品加入磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；
13.(5)先用洗脱液ⅱ平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱，再次用洗脱液ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；
14.(6)步骤(5)中得到的洗脱液进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。
15.进一步地，步骤(1)中所述改性硅胶为硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶的一种或两种。
16.进一步地，所述硅烷偶联剂改性硅胶的制备方法包括以下步骤：50g的球形硅胶和100g的γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷分散于250ml甲苯溶液，于80℃反应2h，得到53g的硅烷偶联剂改性硅胶。
17.进一步地，所述硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶的重量比为2-2.5：1-1.5。
18.进一步地，步骤(2)中所述洗脱液ⅰ为含氯化钠、磷酸的混合液，所述洗脱的过程包括：先用含0.1-0.2mol/l氯化钠、0.1-0.15mol/l磷酸的混合液进行洗脱，再用含0.3-0.4mol/l氯化钠、0.2-0.25mol/l磷酸的混合液进行洗脱。
19.进一步地，步骤(3)中所述洗脱液、硫酸铵溶液、硫酸铵的用量比为80-100ml：80-90ml：1g。
20.进一步地，所述硫酸铵溶液的浓度为1.0-1.5mol/l。
21.进一步地，步骤(4)中所述尿激酶粗品、磷酸的用量比为1g：4-6ml。
22.进一步地，步骤(5)中所述洗脱液ⅱ为0.5-0.6mol/l的磷酸钠溶液。
23.进一步地，步骤(5)中所述吸附柱为弱阴离子交换柱，所述弱阴离子交换柱的填料包括d201、d301、d311、deae的一种或几种。
24.进一步地，步骤(6)中所述过滤为用20nm的滤芯进行过滤。
25.在一些具体的实施方式中，一种尿激酶原料的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)在尿液中加入硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶复合的改性硅胶进行吸附；
27.(2)用水冲洗改性硅胶，所得冲洗液先用含0.1-0.2mol/l氯化钠、0.1-0.15mol/l磷酸的混合液进行洗脱，再用含0.3-0.4mol/l氯化钠、0.2-0.25mol/l磷酸的混合液进行洗脱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
28.(3)洗脱液中加入1.0mol/l硫酸铵溶液，搅拌，取上清；再补加硫酸铵，搅拌溶解后，过滤，收集沉淀，制得尿激酶粗品；
29.(4)取尿激酶粗品加入0.1mol/l磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；其中尿激酶粗品、磷酸的用量比为1g：5ml；
30.(5)先用0.5mol/l的磷酸钠溶液平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱(d301)，再次用0.5mol/l的磷酸钠溶液洗脱吸附柱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
31.(6)步骤(5)中得到的洗脱液用20nm的滤芯进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。
32.相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
33.(1)本发明制备得到的尿激酶纯度高达99％，高分子尿激酶相对含量高达95％；尿激酶的活性收率高达92％，比活高达3200iu/g
·
pr；
34.(2)本发明提供的纯化方法制备方法简单、生产成本低、可快速制备得到尿激酶原料。
具体实施方式
35.值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
36.以下试剂来源，为示例性说明：
37.氨基改性硅胶，购自青岛邦凯高新技术材料有限公司，日本fuji富士球形高纯硅胶填料nh2氨基键合改性硅胶100a 20/45μm。
38.实施例1
39.(1)在尿液中加入硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶(重量比2.5：1)复合的改性硅胶进行吸附；
40.(2)用水冲洗改性硅胶，所得冲洗液先用含0.2mol/l氯化钠、0.15mol/l磷酸的混合液进行洗脱，再用含0.3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸的混合液进行洗脱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
41.(3)洗脱液中加入1.0mol/l硫酸铵溶液，搅拌，取上清；再补加硫酸铵，搅拌溶解后，过滤，收集沉淀，制得尿激酶粗品；其中洗脱液、硫酸铵溶液、硫酸铵的用量比为90ml：80ml：1g；
42.(4)取尿激酶粗品加入0.1mol/l磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；其中尿激酶粗品、磷酸的用量比为1g：5ml；
43.(5)先用0.5mol/l的磷酸钠溶液平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱(d301)，再次用0.5mol/l的磷酸钠溶液洗脱吸附柱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
44.(6)步骤(5)中得到的洗脱液用20nm的滤芯进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。
45.实施例2
46.(1)在尿液中加入硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶(重量比2：1.5)复合的改性硅胶进行吸附；
47.(2)用水冲洗改性硅胶，所得冲洗液先用含0.1mol/l氯化钠、0.1mol/l磷酸的混合液进行洗脱，再用含0.4mol/l氯化钠、0.25mol/l磷酸的混合液进行洗脱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
48.(3)洗脱液中加入1.0mol/l硫酸铵溶液，搅拌，取上清；再补加硫酸铵，搅拌溶解后，过滤，收集沉淀，制得尿激酶粗品；其中洗脱液、硫酸铵溶液、硫酸铵的用量比为100ml：90ml：1g；
49.(4)取尿激酶粗品加入0.1mol/l磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；其中尿激酶粗品、磷酸的用量比为1g：5ml；
50.(5)先用0.5mol/l的磷酸钠溶液平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱(d301)，再次用0.5mol/l的磷酸钠溶液洗脱吸附柱，流速控制在100ml/min，收集洗脱液；
51.(6)步骤(5)中得到的洗脱液用20nm的滤芯进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。
52.实施例3
53.与实施例1的不同在于，步骤(1)中的改性硅胶仅用硅烷偶联剂改性硅胶(保证改性硅胶的总重量不变)，其他步骤均与实施例1相同。
54.实施例4
55.与实施例1的不同在于，步骤(1)中的改性硅胶仅用氨基改性硅胶(保证改性硅胶的总重量不变)，其他步骤均与实施例1相同。
56.实施例5
57.与实施例1的不同在于，步骤(1)中加入硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶的重量比为1.5：2，其他步骤均与实施例1相同。
58.实施例6
59.与实施例1的不同在于，步骤(3)中洗脱液、硫酸铵溶液、硫酸铵的用量比为75ml：95ml：1g，其他步骤均与实施例1相同。
60.实施例7
61.与实施例1的不同在于，步骤(3)中不加入硫酸铵固体，且洗脱液、硫酸铵溶液用量比为90ml：87.6ml(保证加入硫酸铵的摩尔量不变)，其他步骤均与实施例1相同。
62.对比例1
63.与实施例1的不同在于，步骤(3)中不加入硫酸铵溶液，且洗脱液、硫酸铵用量比为90ml：11.56g(保证加入硫酸铵的摩尔量不变)，其他步骤均与实施例1相同。
64.实验例
65.根据《中国药典》2020版二部正文品种第一部分记载的方法计算实施例1-7、对比例1得到的尿激酶中高分子尿激酶相对含量，尿激酶的纯度、活性收率、比活。测试结果见表1。
66.表1
67.实例纯度/％高分子尿激酶相对含量(％)活性收率(％)比活(iu/g
·
pr)实施例19995923200实施例29994913200实施例39290862900实施例49391862800实施例59593893100实施例69491873000实施例79391852700对比例18879712200
68.最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.一种尿激酶原料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将尿液中加入改性硅胶进行吸附；(2)用水冲洗改性硅胶，用洗脱液ⅰ进行洗脱，收集洗脱液；(3)洗脱液中加入硫酸铵溶液，搅拌，取上清；再补加硫酸铵，搅拌溶解后，过滤，收集沉淀，制得尿激酶粗品；(4)取尿激酶粗品加入磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；(5)先用洗脱液ⅱ平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱，再次用洗脱液ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；(6)步骤(5)中得到的洗脱液进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述改性硅胶为硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶的一种或两种。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂改性硅胶、氨基改性硅胶的重量比为2-2.5：1-1.5。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗脱液ⅰ为含氯化钠、磷酸的混合液，所述洗脱的过程包括：先用含0.1-0.2mol/l氯化钠、0.1-0.15mol/l磷酸的混合液进行洗脱，再用含0.3-0.4mol/l氯化钠、0.2-0.25mol/l磷酸的混合液进行洗脱。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱液、硫酸铵溶液、硫酸铵的用量比为80-100ml：80-90ml：1g。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵溶液的浓度为1.0-1.5mol/l。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述尿激酶粗品、磷酸的用量比为1g：4-6ml。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述洗脱液ⅱ为0.5-0.6mol/l的磷酸钠溶液。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述吸附柱为弱阴离子交换柱，所述弱阴离子交换柱的填料包括d201、d301、d311、deae的一种或几种。10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述过滤为用20nm的滤芯进行过滤。

技术总结

本发明公开了一种快速制备尿激酶原料的方法，属于生物工程及化学工程领域。所述尿激酶原料的制备方法，包括以下步骤：(1)将尿液中加入改性硅胶进行吸附；(2)用水冲洗改性硅胶，用洗脱液Ⅰ进行洗脱，收集洗脱液；(3)洗脱液中加入硫酸铵，收集沉淀，制得尿激酶粗品；(4)取尿激酶粗品加入磷酸进行溶解，过滤，浓缩得到浓缩液；(5)先用洗脱液Ⅱ平衡吸附柱，再将步骤(4)中得到的浓缩液上吸附柱，再次用洗脱液Ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；(6)步骤(5)中得到的洗脱液进行过滤、冷冻干燥后得到尿激酶原料。以上制备方法简单、生产成本低、收率高、且可快速制备高质量尿激酶原料。速制备高质量尿激酶原料。