一种马氏珠母贝精子低温保存方法

1.本发明属于水产动物种质保存技术领域，具体涉及一种马氏珠母贝精子低温保存方法。

背景技术：

2.马氏珠母贝(pinctada fucata martensii)：软体动物门(mollusca)，瓣鳃纲(lamellibranchia)，翼形亚纲(ptermorphia)，珍珠贝目(pterioida)，珍珠贝科(pteriidae)。主要分布于我国的广东、广西、海南等热带、亚热带海域，是我国培育海水珍珠的主要种类之一，具有较高经济价值。马氏珠母贝所培育的中小规格珍珠占我国海水珍珠总产量的95％以上，集中养殖于广东湛江、广西北海、海南陵水等华南地区的港湾海域。近年来由于环境污染、科学引导不足、近亲繁殖、盲目引种杂交等问题导致海洋生物养殖体种质退化，使得我国现有的海洋生物多样性下降。同时，种质经济性状的衰退对养殖生产造成了一定的负面影响，如：马氏珠母贝的种质退化使养殖体生长性状极大分化，珍珠产量和质量都严重下降。我国海洋生物种质方面工作急需进一步优化加强，保护、保存海洋生物优良种质资源，为我国海洋生物资源的可持续性发展利用提供夯实的基础。目前关于马氏珠母贝的研究工作主要是苗种繁育、遗传育种、分子标记等方面，在生殖特性、繁殖策略及种质保存方面的研究较少。
3.精子保存技术对水产动物的增养殖、良种培育、资源保护以及生物学研究都有重要意义。在水产动物的种质保存和良种繁育工作中，需从不同地区引种或培育新种。马氏珠母贝全人工繁育技术的过程以体外人工授精为主，不同地区的马氏珠母贝繁殖期性腺发育周期略有不同，长途运输又易导致亲贝死亡。此外，人工育苗工作遇雌贝排卵滞后时要求精子在体外存活时间长一些并与卵子发生受精作用之前保持一定活力。因此，在开展上述相关工作时最好将获得的精子进行短期保藏，避免其提前激活而使后期活力质量下降，影响实验或工作效果。适当的短期保存方法可使精子保持如新鲜精子般的原始质量，在需要之时作为原材料使用，为人工育苗、种质低温保存等工作的后期的顺利开展提供物质基础，具有一定的必要性。
4.精子保存技术为低温保存和超低温冻存，其中精子低温保存技术在猪、羊、马等家禽上开展了大量研究，并成功应用。而在国内有关于水海洋贝类精子保存的研究主要集中在超低温保存。精子短期保藏的基本原则是尽可能地保持精子的原始状态及形态，延长精子寿命。精子短期保藏中所用的稀释液类型、保存液类型、环境温度都会对保藏效果产生一定影响，短期保藏过程中精子所处环境的渗透压、ph值、离子浓度、温度等因子都会对精子活力造成影响。其中短期保藏成功的关键在于合适温度和稀释液或保存液的筛选。所用稀释液或保存液的渗透压、成分等应与精浆相似，即为精浆模拟液，这为精子在体外保持原始状态及质量提供物质保障，最大可能保证精子活力及寿命。不同种生物精子的渗透压、细胞液离子浓度都不同，故所用稀释液没有统一的标准，需要大量的实验才可筛选得出。
5.基于上述分析，筛选一种可低温保存马氏珠母贝精液的稀释液，用以延长精子的
使用时效，不仅对其种质资源保护具有重要意义，对马氏珠母贝良种选繁育也有重要应用价值。

技术实现要素：

6.目前国内有关于水产经济鱼类精子低温保存的研究较多，海洋贝类的种质低温保存研究工作相对较少，且目前主要集中在高经济价值品种上，如太平洋牡蛎、欧洲巨牡蛎(ostrea gigas thunberg)、九孔鲍(haliotis diversicolor aquatilis)等，主要运用的是超低温保存技术。针对马氏珠母贝精子低温保藏研究较少，且现有效果一般。精子的低温保藏技术相较于冷冻保存而言，具有操作简单、重复性强、保存条件温和且易满足、易于运输和操作等优点，也能够防止速冻导致细胞内冰晶的形成导致超微结构受损。而马氏珠母贝精子低温保存技术鲜见报道。鉴于上述不足，本发明要解决的技术问题是在于目前马氏珠母贝良种繁育需在繁育季节将成熟的亲本运至实验场地开展实验，运输过程中亲本易受胁迫发生死亡，且存在雌贝排卵滞后现象，造成良种材料浪费损失。为解决上述问题，本发明提供一种适用于马氏珠母贝新鲜精子的低温保藏技术(0-4℃条件下)，为马氏珠母贝良种选繁育和渔业生产提供技术支撑。该发明方法中精子低温保藏技术所涉及稀释保存液可有效抑制精子活力，延长精子寿命，可满足马氏珠母贝良种选繁育对精子的需求，为马氏珠母贝种质资源进行开发和改良、遗传育种研究提供技术支持。
7.为达上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
8.精子低温保藏技术所涉及稀释保存液包括以下组分：
9.以90ml的ca-free hbss溶液为基础液，10ml浓度为10％的丙二醇为低温保护剂，再添加100μl牛血清蛋白、18mg青霉素、3mg链霉素制成。ca-free hbss溶液购买信息：sigma，货号：h4385-6x 100ml；其成分包括：氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、葡萄糖、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钠(na2hpo4)和酚酞红。
10.其中：ca-free hbss溶液浓度为900μl/ml，丙二醇浓度为100μl/ml，牛血清蛋白浓度为1μl/ml，青霉素浓度为300iu/ml、链霉素浓度为300iu/ml。
11.本发明还公开了一种根据上述任一马氏珠母贝精子低温保存液的应用，包括：
12.(1)选取生殖期性腺饱满的马氏珠母贝，用无菌解剖针穿刺取样用于显微镜下判断雌雄，将雄性性腺完整取出置于无菌培养皿中；
13.(2)加入适量上述稀释保存液后，用无菌剪刀将性腺充分剪碎，获得精浆悬浮液；
14.(3)用300目筛绢网过滤精浆悬浮液，去除多余组织碎片，获得干净的过滤精浆悬浮液，并置于无菌离心管中保存；
15.(4)使用上述低温保存液将过滤精浆悬浮液稀释到原来体积的10倍，得到精子混合物，作好日期标记，即可放入4℃冰箱中进行低温保存。
16.进一步的，所述低温保存时间不超过4天。
17.本发明还公开了一种根据上述应用保存的马氏珠母贝精子的使用方法，包括：
18.将低温保存液与精子混合物摇匀，以1:300的体积比加入精子激活剂并混匀，激活精子后使用精子质量分析仪进行无脊椎动物模型模块精子总运动率分析。
19.进一步的，所述精子激活剂由如下方法制得：
20.取24.8370g nacl、0.6710g kcl、0.9100g cacl2、4.6760g mgcl2、6.1610g mgso4、
0.1806g nahco3完全溶于1l无菌超纯水中，再加入149.6μl的25％体积分数的浓氨水，充分混匀。
21.进一步的，所述低温保存液中的精子与精子激活剂混合后总运动率可达85.62％。
22.应当注意的是，在收集马氏珠母贝精子时，全程注意器具清洁，严防细菌及原生动物混入精浆。步骤(3)中注意该过程不能使用离心机离心，离心会使精子活性迅速降低。步骤(4)的精子保存过程应避免震动，保存精子的离心管需保持密封性。
23.本发明的有益效果在于：
24.(1)能够对马氏珠母贝精子在4℃进行低温保存，对利用本发明方法保存3d的精子进行质量检测，激活后总运动率可以达到70％以上，可满足受精要求；
25.(2)根据马氏珠母贝精子结构、渗透压的特点，通过不同基础液、冷冻保护剂、营养剂、抗生素稀释比例的梯度试验得到了最适于马氏珠母贝精子的冷冻保护液组分及配比，适用于0-4℃条件下的低温保存，有效延长离体精子的保存时间至3d，且精子激活后活力较好。
26.(3)马氏珠母贝精子低温保藏技术的研发成功，有利于在生产实践中高效地保存更多优质精液，有效降低了不同地理体马氏珠母贝杂交成本，对其良种选繁育具有重要的应用价值。
具体实施方式
27.下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
28.实施例1：
29.马氏珠母贝新鲜精子低温保藏实验，包括以下步骤：
30.1.低温保存液的配制：配置100ml的低温保存液，其中90ml ca-free hbss溶液，10ml丙二醇溶液，添加100μl牛血清蛋白、18mg青霉素钠(青霉素300iu/ml)、3mg链霉素(链霉素300iu/ml)。配置好了，均分至10个10ml无菌冷冻管中，每个冷冻管4ml低温保存液，置于4℃冰箱中保存。
31.2.精子激活剂的配置：24.8370g nacl、0.6710g kcl、0.9100g cacl2、4.6760g mgcl2、6.1610g mgso4、0.1806g nahco3完全溶于1l无菌超纯水中，再加入149.6μl的25％浓氨水，充分混匀。
32.3.精子的采集：选取性腺成熟的雄性马氏珠母贝，用无菌解剖刀切断闭壳肌，打开贝壳，用干净纸巾吸干海水及组织液混合物，再取下性腺放入干净的无菌培养皿中，加入适量ca-free hbss基础液后用剪刀充分剪碎性腺，获得精浆悬浮液。用300目筛绢网将过滤精浆悬浮液，去除多余组织碎片，获得较干净的精子悬浮液，用无菌离心管装好、标记，待用。精子活力在80％以上的精子悬浮液用于低温保存。
33.4.精子活力观察：取少量精子悬浮液与精子激活剂以1:300的体积比在圆底离心管中混合，随后立即在显微镜下使用精子质量分析仪进行精子状态观察。以总运动率(tm，％，)作为指标来评价精子活力，将精子活力等级(mi)分为6个水平，即mi＝(0-5)，具体如表1所示：
34.表1精子活力等级划分标准
[0035][0036]
5.精子的低温保藏：将“3.精子采集”中所获得的精子悬浮液按1:10的比例用移液加入提前装有低温保存液的无菌冷冻管中，轻轻摇匀后保存在4℃冰箱中保存，保存过程中离心管保持密封，避光及避免剧烈震动。
[0037]
6.低温保藏效果检测：每隔一天检测精子活力，第3d精子用激活剂激活后运动率可达74.96％(mi＝4)，质量与活力仍可达到受精要求。
[0038]
对比实施例
[0039]
1.基础溶液与稀释比例的筛选
[0040]
分别以无菌自然海水、无菌人工海水、ca-free hbss溶液作为基础溶液，其中与基础溶液以1:5、1:10、1:20的体积比进行稀释的实验组(表2)。将精子悬浮液与基础液均匀混合得到精子浊液，精子浊液置于2ml冷冻管中，每管保存1ml，置于4℃冰箱中保存，检测24h、48h、72h、96h后精子的激活运动率。结果表明：以ca-free hbss作为基础液的实验组效果整体好于其他两个实验组。在稀释比例的筛选上，稀释比为1:10和1:20实验组保存效果显著好于其它组，综合考虑保存精液的高效性，选择1:10作为最优稀释比。数据如表2所示：
[0041]
表2不同基础液及稀释比例对精子运动率的低温保存效果
[0042][0043]
2.牛血清蛋白浓度的筛选
[0044]
以ca-free hbss溶液作为基础溶液，设置牛血清蛋白不同浓度实验组(表3)。精液
与稀释液的比例为1:10，均匀混合，随后置于2ml冷冻管中，每管保存1ml，置于4℃冰箱中保存，检测24h、48h、72h、96h后精子的激活运动率。结果表明：1μl/ml浓度的牛血清蛋白保存效果最好，且优于不添加的对照组。数据如下：
[0045]
表3不同浓度牛血清蛋白对精子运动率的低温保存效果
[0046][0047]
3.抗生素浓度的筛选
[0048]
以ca-free hbss溶液作为基础溶液，添加1μl/ml浓度的牛血清蛋白，设计不同浓度组合的青霉素、链霉素的抗生素梯度实验(表4)。精液与稀释液的比例为1:10，均匀混合，随后置于2ml冷冻管中，每管保存1ml，置于4℃冰箱中保存，检测24h、48h、72h、96h后精子的激活运动率。结果表明：添加抗生素的实验组效果整体优于不添加的对照组，添加青霉素和链霉素的实验组明显好于分别添加青霉素和链霉素的实验组，其中添加300iu/ml青霉素和300iu/ml链霉素实验组保存效果最好。数据如表4所示：
[0049]
表4不同抗生素组合对精子运动率的低温保存效果
[0050]
[0051]
4.渗透型冷冻保护剂与浓度的筛选
[0052]
以ca-free hbss溶液作为基础溶液，添加1μl/ml浓度的牛血清蛋白、300iu/ml青霉素和300iu/ml链霉素，以不同浓度二甲基亚砜(dmso)、乙二醇(eg)、丙二醇(pg)、甲醇(met)为渗透型冷冻保护剂，共配制了16种低温保存液(表5)。精液与稀释液的比例为1:10，均匀混合，随后置于2ml冷冻管中，每管保存1ml，置于4℃冰箱中保存，检测24h、48h、72h、96h后精子的激活运动率。结果表明：适宜浓度的冷冻保护剂可有效提高精子的低温保藏效果。dmso和met实验组数据明显低于不添加保护剂的对照组，而eg和pg实验组低温保藏效果优于对照组，可有效延长马氏珠母贝精子的保存时间，其中10％pg效果最优。数据如表5所示：
[0053]
表5不同冷冻保护剂类型与浓度对精子运动率的低温保存效果
[0054][0055]
通过上述实验可知，以ca-free hbss作为基础溶液，添加1μl/ml浓度的牛血清蛋白、300iu/ml青霉素和300iu/ml链霉素，以10％ pg(v:v)作为低温冷冻保护剂，以1:10比例稀释保存马氏珠母贝精子的冷冻保藏效果最好(即实验组14)，3d后遇精子激活剂运动率仍然可以达到74.96％(mi＝4)，其曲线运动速率(vcl)、直线运动速率(vsl)、平均路径运动速率(vap)分别为126.43μm/s、106.12μm/s、125.72μm/s。即使到了第4d时，该实验组的激活后运动率仍可达53.86％。
[0056]
综上所述，只有在本发明配方下制得的低温保存液以及本发明特定的方法对马氏珠母贝精子进行0-4℃的低温保存，不仅能有效延长离体精子的保存时间至3d，且精子激活后活力较好，激活后总运动率可以达到70％以上，有效满足受精要求；同时在生产实践中高效地保存更多优质精液，降低了不同地理体马氏珠母贝杂交成本，对其良种选繁育具有重要的应用价值。
[0057]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种马氏珠母贝精子低温保存液，包括：90ml ca-free hbss溶液；10ml丙二醇；100μl牛血清蛋白；以及21mg抗生素。2.根据权利要求1所述的保存液，其中：所述抗生素包括：18mg青霉素；以及3mg链霉素。3.根据权利要求2所述的保存液，其中：所述ca-free hbss溶液浓度为900μl/ml，丙二醇浓度为100μl/ml，牛血清蛋白浓度为1μl/ml，青霉素浓度为300iu/ml，链霉素浓度为300iu/ml。4.根据权利要求1所述的保存液，其中：所述ca-free hbss溶液成分包括：氯化钠、氯化钾、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和酚酞红。5.一种根据权利要求1～4任一所述马氏珠母贝精子低温保存液的应用，包括：(1)选择生殖期性腺饱满的马氏珠母贝，将雄性性腺完整取出置于无菌培养皿中；(2)加入保存液后，用无菌剪刀将性腺充分剪碎，获得精浆悬浮液；(3)精浆悬浮液过300目筛绢网，得到过滤精浆悬浮液，并置于无菌离心管中保存；(4)使用低温保存液将过滤精浆悬浮液稀释至原体积的10倍，得到精子混合物，并置于4℃下低温保存。6.根据权利要求5所述的应用，其中：所述保存时间不超过4天。7.一种根据权利要求5或6所述应用保存的马氏珠母贝精子的使用方法，包括：将低温保存液与精子混合物摇匀，以1:300的体积比加入精子激活剂并混匀，激活精子后使用精子质量分析仪进行无脊椎动物模型模块精子总运动率分析。8.根据权利要求7所述的使用方法，其中：所述精子激活剂由如下方法制得：取24.8370g nacl、0.6710g kcl、0.9100g cacl2、4.6760g mgcl2、6.1610g mgso4、0.1806g nahco3溶于1l无菌超纯水中，再加入149.6μl的25％体积分数的浓氨水，混匀即得。9.根据权利要求7所述的使用方法，其中：所述低温保存液中的精子与精子激活剂混合后总运动率达85.62％。

技术总结

本发明属于水产动物种质保存技术领域，具体涉及一种马氏珠母贝精子低温保存方法，包括：以Ca-free HBSS溶液为基础液配制的低温保存液(900μl/ml的Ca-free HBSS溶液，100μl/mL丙二醇，1μl/ml牛血清蛋白，300IU/ml青霉素、300IU/ml链霉素)以及马氏珠母贝精子激活剂(24.8370g/L NaCl、0.6710g/L KCl、0.9100g/L CaCl2、4.6760/L g MgCl2、6.1610g/L MgSO4、0.1806g/L NaHCO3、149.60μL/L浓氨水)。将精子悬浮液与低温保存液按照稀释比为1:10混合。本发明提供了一种适用于马氏珠母贝精子低温保藏技术(0-4℃条件下)，为马氏珠母贝良种选繁育和渔业生产提供技术支撑。该发明方法可有效延长精子体外寿命，保存3d的精子激活后总运动率在70％以上，可满足马氏珠母贝良种选繁育过程对精子的需求。过程对精子的需求。