光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜、制备方法及应用

1.本发明属于生物医学工程领域，涉及一种光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜、制备方法及应用。

背景技术：

2.商业伤口止血敷料，如纱布、明胶海绵和绷带等，可以通过封闭出血部位的伤口表面，有效实现浅表伤口止血。然而，包括如肝脏、脆弱组织或血管组织等在内的深层组织创面，不便人工按压。因此利用上述商业止血剂处理伤口，往往无法达到理想止血效果。同时，损伤部位通常伴随较高的细菌感染风险，例如，烧伤后，抗耐药细菌感染是烧伤患者的主要并发症，发病率高，是造成病人死亡的主要因素，因此抗耐药菌感染成为烧伤病人的重要环节。
3.丝素蛋白是从蚕茧中提取的一种天然蛋白质，具有可调节的机械强度、低免疫原性以及良好相容性，已广泛用于再生医学领域。在止血方面，丝素蛋白可与纤维蛋白原和血小板结合，促进机体凝血反应。然而，缺乏有效抗菌活性限制了丝素蛋白在止血和促进伤口修复方面的进一步应用。
4.光动力疗法被认为是一种有效的杀灭耐药细菌的手段。通过光敏剂在光照射下产生的活性氧，加速细菌膜破裂以及细菌内dna和蛋白质失活，杀灭细菌(如金黄葡萄球菌)，防止脓肿，具有效率高、时空精准和对正常组织侵害性低等优势。然而，光敏剂会被人体快速代谢，抗菌时效短且效果差。同时单纯的光动力疗法在临床体内杀伤细菌的较差。
5.因此，亟需开发兼具快速止血和优良抗菌活性的多功能伤口止血材料，提高临床患者预后。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明目的在于提供一种光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜、制备方法及应用。该抗菌止血贴膜可在紫外光照下与受损组织紧密粘附，实现伤口快速止血，在贴附后，利用光具有高定位精度的优势，在近红外光照射下，精准激活患者感染处免疫反应，并与抗菌止血贴膜中二氢卟吩e6产生的活性氧，协同杀灭创面的抗耐药菌，大幅提高光动力效果，促进其修复创面，在临床上达到良好的创面修复效果。
7.本发明采用的技术方案如下：
8.一种光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜的制备方法，包括以下步骤：
9.s1.将4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯加入丝素蛋白水溶液中，室温下避光搅拌至完全溶解，反应完全后，透析，冻干，得到4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白；
10.s2.4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白溶于水，加入二氢卟吩e6、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌至完全溶解，反应完全后，旋蒸去除溶剂后透析，冻干，得到二氢卟吩e6修饰的邻硝
基苄基丝素蛋白；
11.s3.将所述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中得到纺丝液，静电纺丝得纤维膜，将所述纤维膜用无水乙醇处理，然后风干，得抗菌止血贴膜。
12.进一步的，步骤s1中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.15g/ml。
13.进一步的，步骤s1中，4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯与所述丝素蛋白水溶液的用量比为(0.15～1.5g):100ml。
14.进一步的，步骤s1中，所述反应的时间为48h。
15.进一步的，步骤s2中，二氢卟吩e6、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1:1，所述4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白、二氢卟吩e6与水的用量比为15g:(0.01～0.1)g:100ml。
16.进一步的，步骤s2中，所述反应的时间为12h。
17.进一步的，所述透析为采用超纯水透析3h。
18.进一步的，所述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白与六氟异丙醇的用量比为(5～25)g:100ml。
19.进一步的，所述静电纺丝具体为：在电场高压10kv的条件下，以1ml/h的进料速度喷射至距离喷射口15cm的平面收器上。
20.本发明还提供了一种上述的制备方法制备得到的抗菌止血贴膜。
21.本发明还提供了上述的抗菌止血贴膜在功能性止血材料中的应用，所述应用的方法具体为：利用350～400nm紫外光照射2～5分钟，然后利用600-700nm近红外光照射5～10分钟。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明的产品能够有在紫外光照射后，增加产品内部化学交联从而增强自身力学性能，且在紫外光照2分钟内，与组织中氨基发生光化学反应从而粘附在组织上，产生封闭伤口效果，有效止血。同时，利用丝素蛋白募集体内巨噬细胞的能力，本产品在近红外光照下，产生炎症激活分子(活性氧)，激活患处免疫反应，并协同产生的活性氧，进一步伤口细菌感染，显著提高了光动力抗菌效率。
附图说明
24.图1为实施例1所制得的抗菌止血贴膜的体内止血性能测试结果图；
25.图2为实施例1所制得的抗菌止血贴膜的光激活免疫反应性能测试结果图；
26.图3为实施例1所制得的抗菌止血贴膜的体内抗耐药菌性能。
具体实施方式
27.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
28.实施例1
29.将丝素蛋白溶解于超纯水中，得到0.15g/ml的溶液，然后在100ml丝素蛋白溶液中加入4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯(1.5g)，室温下避光搅拌至完全溶
解，反应48小时，用超纯水透析3天，经冻干得到4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白；
30.将上述4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白溶解于超纯水中得到0.15g/ml的溶液后，在100ml溶液中，加入二氢卟吩e6(0.1g)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.1g)以及n-羟基琥珀酰亚胺(0.1g)，室温下避光搅拌至完全溶解，并反应12h。反应结束后，旋蒸去除溶剂后用超纯水透析3天，经冻干得到二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白。
31.利用静电纺丝技术，将上述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中得到浓度为0.25g/ml的溶液，在电场高压(10kv)的条件下，以1ml/h的进料速度喷射至距离喷射口15cm的平面收器上，得到纤维膜，并浸泡在无水乙醇溶液中4小时，去除杂质，后风干。
32.实施例2
33.将丝素蛋白溶解于超纯水中，得到0.15g/ml的溶液，然后在100ml丝素蛋白溶液中加入4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯(0.15g)，室温下避光搅拌至完全溶解，反应48小时，用超纯水透析3天，经冻干得到4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白；
34.将上述4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白溶解于超纯水中得到0.15g/ml的溶液后，在100ml溶液中，加入二氢卟吩e6(0.1g)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.1g)以及n-羟基琥珀酰亚胺(0.1g)，室温下避光搅拌至完全溶解，并反应12h。反应结束后，旋蒸去除溶剂后用超纯水透析3天，经冻干得到二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白。
35.利用静电纺丝技术，将上述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中得到浓度为0.25g/ml的溶液，在电场高压(10kv)的条件下，以1ml/h的进料速度喷射至距离喷射口15cm的平面收器上，得到纤维膜，并浸泡在无水乙醇溶液中4小时，去除杂质，后风干。
36.实施例3
37.将丝素蛋白溶解于超纯水中，得到0.15g/ml的溶液，然后在100ml丝素蛋白溶液中加入4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯(1.5g)，室温下避光搅拌至完全溶解，反应48小时，用超纯水透析3天，经冻干得到4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白；
38.将上述4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白溶解于超纯水中得到0.15g/ml的溶液后，在100ml溶液中，加入二氢卟吩e6(0.01g)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.01g)以及n-羟基琥珀酰亚胺(0.01g)，室温下避光搅拌至完全溶解，并反应12h。反应结束后，旋蒸去除溶剂后用超纯水透析3天，经冻干得到二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白。
39.利用静电纺丝技术，将上述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中得到浓度为0.25g/ml的溶液，在电场高压(10kv)的条件下，以1ml/h的进料速度喷射至距离喷射口15cm的平面收器上，得到纤维膜，并浸泡在无水乙醇溶液中4小时，去除杂质，后风干。
40.测试例1：纤维膜在紫外光照后的抗拉伸强度测试
41.将实施例1-3中制得的样品(抗菌止血贴膜)分别剪切成长度为3cm，宽为1cm的长方形，在365nm紫外光(50mw cm-2
)照射2分钟后，使用万能电子拉伸机，以1mm/min的位移速率直至被拉断，测定其抗拉伸强度，结果如表1所示。
42.测试例2：纤维膜在紫外光照后对组织粘附强度测试
43.将实施例-3中制得的样品(抗菌止血贴膜)分别剪切成长度为1cm，宽为3cm的长方形，并将其一端置于猪皮肤组织上，在365nm紫外光(50mw cm-2
)照射2分钟后，使用万能电子拉伸机，一端拉组织，另一端拉以1mm/min的位移速率，测定其抗拉伸强度，结果如表1所示。
44.表1.实施例1-3制得的样品的抗拉伸和组织粘附效果
45.样品实施例1实施例2实施例3抗拉伸强度(mpa)0.270.10.3组织粘附强度(kpa)68574
46.测试例3：使用小鼠肝脏模型测试产品的体内止血性能
47.将icr小鼠麻醉，并暴露肝脏，用注射器穿刺法肝脏，用实施例1中制得的抗菌止血贴膜覆盖伤口部位，并用紫外光(50mw cm-2)下照射2min。最后将预先称重的滤纸放吸取处理后伤口渗出血液，用以记录出血量，并与未作任何处理的伤口出血量对比。如图1所示，未处理的小鼠(图1左图)失血量为26.5mg，利用实施例1中制得抗菌止血贴膜处理后小鼠(图1右图)失血量仅为3.7mg，证明其具有良好的止血性能。
48.测试例4：使用小鼠背部皮肤损伤模型测试产品在近红外光照下激活患处免疫反应性能。
49.用实施例1中制得的抗菌止血贴膜覆盖小鼠背部伤口，用紫外光(50mw cm-2
)下照射2min使纤维膜贴附伤口后，利用660nm近红外光(20mw cm-2
)照射患处纤维膜10分钟，并在12小时后，取患处组织进行免疫荧光染观察免疫细胞激活情况，并与贴附纤维膜但未经660nm近红外光的小鼠组织做对比。如图2所示，红荧光标记的为激活的巨噬细胞，左图为未经660nm近红外光的小鼠组织，右图为经660nm近红外光的小鼠组织，可以发现，经过近红外光后，伤口处巨噬细胞明显被激活，证明产品具有良好的光激活免疫反应性能。
50.测试例5：使用小鼠背部皮肤损伤耐药菌感染模型测试产品在近红外光照下抗耐药菌性能。
51.用实施例1中制得的抗菌止血贴膜覆盖小鼠背部感染伤口，用紫外光(50mw cm-2
)下照射2min使纤维膜贴附伤口后，利用660nm近红外光(20mw cm-2
)照射患处纤维膜10分钟，并在3天后，取患处组织进行细菌培养，并与贴附纤维膜但未经660nm近红外光的小鼠组织做对比。如图3所示，左图为未经660nm近红外光的小鼠组织的结果图，右图为经660nm近红外光的小鼠组织的结果图。可见，经过近红外光后，伤口处耐药菌数量显著下降，证明本发明提供的抗菌止血贴膜具有良好的光照抗菌性能。

技术特征：

1.一种光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.将4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯加入丝素蛋白水溶液中，室温下避光搅拌至完全溶解，反应完全后，透析，冻干，得到4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白；s2.4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白溶于水，加入二氢卟吩e6、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌至完全溶解，反应完全后，旋蒸去除溶剂后透析，冻干，得到二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白；s3.将所述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白溶解于六氟异丙醇中得到纺丝液，静电纺丝得纤维膜，将所述纤维膜用无水乙醇溶液处理，然后风干，得抗菌止血贴膜。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.15g/ml。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯与所述丝素蛋白水溶液的用量比为(0.15～1.5)g:100ml。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述反应的时间为48h。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，二氢卟吩e6、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1:1，所述4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸修饰的丝素蛋白、二氢卟吩e6与水的用量比为15g:(0.01～0.1)g:100ml。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述反应的时间为12h。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氢卟吩e6修饰的邻硝基苄基丝素蛋白与六氟异丙醇的用量比为(5～25)g:100ml。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝具体为：在电场高压10kv的条件下，以1ml/h的进料速度喷射至距离喷射口15cm的平面收器上。9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的抗菌止血贴膜。10.权利要求9所述的抗菌止血贴膜在功能性止血材料中的应用，所述应用的方法具体为：利用350～400nm紫外光照射2～5分钟，然后利用600-700nm近红外光照射5～10分钟。

技术总结

本发明属于生物医学工程领域，公开了一种光照激活免疫反应的抗菌止血贴膜、制备方法及应用。本发明将丝素蛋白依次用4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯和4-(4-羟甲基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸甲酯修饰后，采用静电纺丝工艺，制备纤维膜，然后采用无水乙醇处理，得到抗菌止血贴膜。该抗菌丝素纤维止血贴膜可在紫外光照下与受损组织紧密粘附，实现伤口快速止血，在贴附后，近红外光照照射下，精准激活患者感染处免疫反应，并与纤维膜中二氢卟吩e6产生的活性氧，协同杀灭创面的抗耐药菌，大幅提高光动力效果，促进其修复创面，在临床上达到良好的创面修复效果。在临床上达到良好的创面修复效果。在临床上达到良好的创面修复效果。