一种基于Fe-S键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子及其制备方法和应用

一种基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及抗菌技术领域，具体是一种基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

2.纳米fe3o4由于尺寸表面效应、小尺寸效应以及独特的超顺磁性是目前应用较为广泛的磁性纳米材料，特别因其具有较好的生物相容性，在生物医用材料领域备受关注。然而由于表面能较大，磁性纳米颗粒之间很容易发生聚集从而丧失磁性纳米粒子的优良性能。壳-核结构的构建是防止纳米粒子聚集的常见方法。在众多壳结构中，构建具有介孔材料的外壳对于材料的功能化具有较大的促进作用。介孔材料具有极高的比表面积、高度有序的孔道结构、狭窄的孔径分布、孔径大小连续可调等特点，而将介孔材料与磁性材料结合起来，构建出一种磁性介孔复合材料，一方面使材料具有介孔材料优势，另一方面还可通过磁铁分离进行简单回收循环利用，为功能材料的高效、绿的应用提供了新的策略。
3.近年来，各种抗菌药物的迅速发展使众多因细菌感染产生的疾病得到了预防、控制及，然而在降低因细菌感染死亡率的同时，许多菌株通过变异产生了耐药基因，因此，解决细菌耐药问题是人们面临的巨大威胁与挑战。多肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，并且某些抗菌肽不仅对部分病毒，真菌，原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力，加速伤口愈合过程。然而目前抗菌肽的生产方式主要有三种：天然提取、化学合成和生物工程发酵。天然抗菌肽主要来自动植物，含量极低，提取过程甚为复杂；化学合成方法成本高昂，不适应工业化生产，因此无法进行普及应用。固定化技术为提高抗菌剂的回收利用提供了一个有效途径，经过现有技术检索发现，现有技术多数以抗菌肽小分子或将其固定在壳聚糖等载体上进行酶标定，然而功能基团固定化的稳定性以及分离操作的便宜性依然面临着极大的挑战。

技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法。利用磁性纳米材料表面的介孔结构，通过fe-s键将抗菌肽固定在介孔材料的孔道中，从而制备出抗菌性能稳定且可多次循环使用的抗菌肽。同时，基于fe3o4超顺磁性可通过简单磁分离方法进行回收，提高了抗菌肽的利用效率，降低了其应用成本。
5.该方法具体技术方案如下：
6.步骤(1)、制备磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio27.将质量比为5～10:1的十六烷基三甲基溴化铵与四氧化三铁纳米颗粒置于去离子水中，超声混合均匀，加入氢氧化钠溶液在50～60℃下机械搅拌均匀后，加入混合溶剂反应10～13h；反应结束后分离出磁性物质，用去离子水和乙醇洗涤，40～50℃下真空干燥10～
12h除去溶剂后置于氮气保护气氛中，在300～350℃下煅烧得到介孔二氧化硅包覆磁性四氧化三铁的壳核结构的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2；
8.所述混合溶剂为正硅酸乙酯、甲醇的混合液；
9.步骤(2)、制备基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10
10.将质量比为1～1.5:1的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2和抗菌多肽加入pbs缓冲液中，在室温下搅拌10～15小时；分离出磁性物质后用去离子水洗涤，冻干除去溶剂后得到基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10；
11.所述抗菌多肽为末端含有巯基的cyschhc10多肽。
12.末端含有巯基的cyschhc10多肽结构式如下：
[0013][0014]
作为优选，步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵与四氧化三铁纳米颗粒的质量比为10:1。
[0015]
作为优选，步骤(1)中机械搅拌的温度为60℃。
[0016]
作为优选，步骤(1)中混合溶剂中正硅酸乙酯与甲醇的体积比为1:2～4。
[0017]
作为优选，步骤(1)中真空干燥的温度为50℃，真空干燥时间为12h。
[0018]
作为优选，步骤(1)中煅烧温度为350℃。
[0019]
作为优选，步骤(2)中fe3o4@msio2和抗菌多肽的质量比为1:1。
[0020]
步骤(1)制备得到的介孔磁性纳米粒子材料的比表面积为205.3cm2/g,总空体积为0.2641cm3/g,平均孔径为24.22nm；步骤(2)制备得到的基于fe-s键构建可循环抗菌多肽的纳米粒子的负载率达到44％。
[0021]
本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10。
[0022]
本发明的第三个目的是提供上述基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子作为抗菌剂的应用。
[0023]
作为优选，抗菌剂针对的细菌包括大肠杆菌和金黄葡萄球菌。
[0024]
该磁性介孔抗菌肽纳米粒子对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.05mg/ml,杀菌率大于99.9％；对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.068mg/ml,杀菌率大于99.9％。
[0025]
经测试，本发明制备得到的磁性介孔抗菌肽纳米粒子对大肠杆菌以及金黄葡萄球菌的抗菌性能均可达到回收循环9次，其杀菌率仍大于99.9％。
[0026]
综上所述，本发明相比与现有技术具有以下有益效果如下：
[0027]
1.本发明提供的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子，通过在磁性fe3o4纳米粒子表面构建介孔结构，并在介孔孔道中利用抗菌多肽所含的巯基(-sh)官能团和fe3o4形成fe-s键
将抗菌肽稳定的负载到纳米粒子上，由于fe-s键的键合作用以及介孔的孔道对于多肽的保护，有效防止纳米粒子的团簇，使其具有良好的抗菌性能的同时增加了负载的稳定性，从而可以达到多次循环回收使用的目的。
[0028]
2.本发明提供的磁性纳米粒子材料，由于在负载前后仍然具有较好的超顺磁性，因此可以实现杀菌后，通过简单的磁铁分离操作，达到抗菌剂磁性介孔抗菌肽纳米粒子整体分离回收进而循环使用的目的。
[0029]
3.本发明提供的抗菌多肽是一种广谱抗菌剂，可以有效的避免耐药性，与此同时由于本发明提供的四氧化三铁纳米粒子与抗菌多肽都具有较好的生物相容性，因此为体内检测提供了可能性。
附图说明
[0030]
图1为实施例1制备的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2和可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10的sem照片及粒径分布曲线，其中a)为磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2，b)为负载抗菌多肽后的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10，c)为b)放大后的结果，d)为c)的粒径分布曲线。
[0031]
图2为实施例1制备的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2和可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10的tem图片，其中a)为磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2，b)为a)放大后的结果，c)为负载抗菌多肽后的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10，d)为c)放大后的结果。
[0032]
图3为实施例1中fe3o4、fe3o4@msio2、fe3o4@msio2@cyschhc10和cyschhc10的ir光谱图。
[0033]
图4为实施例1中fe3o4、fe3o4@msio2和fe3o4@msio2@cyschhc10的xrd谱图。
[0034]
图5为实施例1中fe3o4、fe3o4@msio2和fe3o4@msio2@cyschhc10的vsm谱图及磁铁吸附分离图片。
[0035]
图6为实施例1制备的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2的bet谱图。
[0036]
图7为实施例1制备的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2负载抗菌多肽前后的xps能谱图。
[0037]
图8为实施例1制备的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2和磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10的xps能谱的局部放大谱图。
[0038]
图9为实施例1制备的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10对于大肠杆菌和金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度。
[0039]
图10为实施例1制备的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10对于大肠杆菌和金黄葡萄球菌杀菌循环性能。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0041]
实施例1
[0066]
将500mg ctab(十六烷基三甲基溴化铵)溶于50ml去离子水中，然后将50mg fe3o4纳米颗粒加入到混合溶液中，超声作用30min。
[0067]
加入50ml 10mmnaoh和400ml去离子水，60℃机械搅拌30min，再加入2.5ml正硅酸乙酯/甲醇(v/v＝1:2)。
[0068]
60℃机械搅拌并加热合成的溶液，反应12h后，用磁铁分离，用去离子水和乙醇依次洗涤3次，50℃真空干燥12h,350℃煅烧4h，得到fe3o4@msio2。
[0069]
(2)制备可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10
[0070]
15mg fe3o4@msio2加入到含有15mg多肽cyschhc10的25mlpbs缓冲液，在25℃下搅拌12h,然后用去离子水洗涤6次，冻干得到产物。
[0071]
实施例5
[0072]
(1)制备磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2[0073]
将500mg ctab(十六烷基三甲基溴化铵)溶于50ml去离子水中，然后将50mg fe3o4纳米颗粒加入到混合溶液中，超声作用30min。
[0074]
加入50ml 10mmnaoh和400ml去离子水，60℃机械搅拌30min，再加入2.5ml正硅酸乙酯/甲醇(v/v＝1:4)。
[0075]
60℃机械搅拌并加热合成的溶液，反应12h后，用磁铁分离，用去离子水和乙醇依次洗涤3次，40℃真空干燥10h,350℃煅烧4h，得到fe3o4@msio2。
[0076]
(2)制备可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10
[0077]
15mg fe3o4@msio2加入到含有15mg多肽cyschhc10的25ml pbs缓冲液，在25℃下搅拌12h,然后用去离子水洗涤6次，冻干得到产物。
[0078]
实施例6
[0079]
(1)制备磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2[0080]
将500mg ctab(十六烷基三甲基溴化铵)溶于50ml去离子水中，然后将50mg fe3o4纳米颗粒加入到混合溶液中，超声作用30min。
[0081]
加入50ml 10mmnaoh和400ml去离子水，60℃机械搅拌30min，再加入2.5ml正硅酸乙酯/甲醇(v/v＝1:4)。
[0082]
60℃机械搅拌并加热合成的溶液，反应12h后，用磁铁分离，用去离子水和乙醇依次洗涤3次，50℃真空干燥12h,300℃煅烧4h，得到fe3o4@msio2。
[0083]
(2)制备可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10
[0084]
15mg fe3o4@msio2加入到含有15mg多肽cyschhc10的25ml pbs缓冲液，在25℃下搅拌12h,然后用去离子水洗涤6次，冻干得到产物。
[0085]
实施例7
[0086]
(1)制备磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2[0087]
将500mg ctab(十六烷基三甲基溴化铵)溶于50ml去离子水中，然后将50mg fe3o4纳米颗粒加入到混合溶液中，超声作用30min。
[0088]
加入50ml 10mmnaoh和400ml去离子水，60℃机械搅拌30min，再加入2.5ml正硅酸乙酯/甲醇(v/v＝1:4)。
[0089]
60℃机械搅拌并加热合成的溶液，反应12h后，用磁铁分离，用去离子水和乙醇依次洗涤3次，50℃真空干燥12h,350℃煅烧4h，得到fe3o4@msio2。
[0090]
(2)制备可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10
[0091]
15mg fe3o4@msio2加入到含有10mg多肽cyschhc10的25ml pbs缓冲液，在25℃下搅拌12h,然后用去离子水洗涤6次，冻干得到产物。
[0092]
对比例1
[0093]
将实施例1中四氧化三铁的纳米粒子替换成不具有磁性的二氧化硅纳米粒子，其余条件与实施例1相同，制备得到对比纳米粒子1。
[0094]
对比例2
[0095]
将实施例1中在四氧化三铁表面形成二氧化硅的介孔结构替换成二氧化硅包裹四氧化三铁的核壳结构，其余条件与实施例1相同，制备得到对比纳米粒子2。
[0096]
对比例3
[0097]
按照实施例1的方法制备对比纳米粒子3，区别在于对比纳米粒子3没有在四氧化三铁表面形成二氧化硅的介孔结构，而仅在四氧化三铁表面直接负载多肽。
[0098]
对比例4
[0099]
直接使用单一四氧化三铁测试其抗菌及循环回收性能。
[0100]
对比例5
[0101]
直接使用单一抗菌多肽cyschhc10测试其抗菌及循环回收性能。
[0102]
测试例
[0103]
本测试例中的抗菌率按照gb/t 21510-2008《纳米无机材料抗菌性能检测方法》测得，其中实验菌种为大肠杆菌cicc 10899、金黄葡萄球菌cicc 10384。
[0104]
抗菌及循环回收性能见表1.
[0105]
表1实施例1-7及对比例1-5的抗菌及循环回收性能结果
[0106]
[0107][0108]
注：
‑‑
指无抗菌性能
[0109]
根据表1数据可知，本发明提供的磁性纳米粒子抗菌剂具有较高的抗菌性能和回收性能，同时在对比实施例1和对比例1-5后可发现，基于fe-s键构建具有介孔结构的磁性纳米粒子，一方面提高了负载的稳定性增加了循环能力，另一方面避免了纳米粒子间的团簇，保证了纳米粒子的性能。不使用在四氧化三铁表面形成二氧化硅的介孔结构，无法形成fe-s键，也无法负载抗菌多肽，核壳结构的抑菌率和最低抑菌浓度相较于实施例1都偏低，循环次数也较少。

技术特征：

1.一种基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤(1)、制备磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2将质量比为5～10:1的十六烷基三甲基溴化铵与四氧化三铁纳米颗粒置于去离子水中，超声混合均匀，加入氢氧化钠溶液在50～60℃下机械搅拌均匀后，加入混合溶剂反应10～13h；反应结束后分离出磁性物质，用去离子水和乙醇洗涤，40～50℃下真空干燥10～12h除去溶剂后置于氮气保护气氛中，在300～350℃下煅烧得到介孔二氧化硅包覆磁性四氧化三铁的壳核结构的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2；所述混合溶剂为正硅酸乙酯、甲醇的混合液；步骤(2)、制备基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10将质量比为1～1.5:1的磁性介孔表面纳米粒子fe3o4@msio2和抗菌多肽加入pbs缓冲液中，在室温下搅拌10～15小时；分离出磁性物质后用去离子水洗涤，冻干除去溶剂后得到基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子fe3o4@msio2@cyschhc10；所述抗菌多肽为末端含有巯基的cyschhc10多肽。2.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵与四氧化三铁纳米颗粒的质量比为10:1。3.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中机械搅拌的温度为60℃。4.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶剂中正硅酸乙酯与甲醇的体积比为1:2～4。5.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中真空干燥的温度为50℃，真空干燥时间为12h。6.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中煅烧温度为350℃。7.根据权利要求1所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中fe3o4@msio2和抗菌多肽的质量比为1:1。8.一种基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子，由权利要求1-7任一项所述方法制备得到。9.权利要求8所述的基于fe-s键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子作为抗菌剂的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，抗菌剂针对的细菌包括大肠杆菌和金黄葡萄球菌。

技术总结

本发明公开了一种基于Fe-S键构建的可循环磁性介孔抗菌肽纳米粒子及其制备方法和应用。本发明提供了一种抗菌性能好，合成工艺简单且可多次简单回收循环的磁性纳米粒子抗菌剂，通过在磁性Fe3O4纳米粒子表面构建介孔结构并在介孔孔道中利用抗菌多肽所含的巯基(-SH)官能团和Fe3O4形成Fe-S键将抗菌肽稳定的负载到纳米粒子上，本发明一方面可提高纳米粒子负载稳定性从而提升循环能力，另一方面也可以有效防止纳米粒子的团簇，从而达到持久的抗菌效果与良好的抗菌稳定性。菌效果与良好的抗菌稳定性。菌效果与良好的抗菌稳定性。