羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡在促进毛发生长中的应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种活性物质的应用，更具体地，涉及羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡在促进毛发生长中的应用。

背景技术：

2.脱发是一种常见的疾病，由多种原因造成，如衰老、疾病和药物，其特征是毛囊生长期较短和休止期较长。虽然脱发不会危及生命，但是却给患者带来各种负面的社会和心理影响。成熟的毛囊被认为是一种自我更新的微型器官，能够通过由生长期、退行期和休止期组成的周期循环来产生新的毛干。毛囊生长和周期循环受上皮细胞和间充质细胞之间复杂的相互作用调节，并且需要多种刺激和抑制信号的整合。毛囊乳头在毛发生长周期期间在上皮细胞活化中起重要作用，并产生激活因子导致休止期/生长期转变。研究发现许多脱发患者的毛囊处于休止期，其中角质形成细胞和真皮乳头(dp)细胞这两个调节毛发周期的重要细胞处于不活跃状态。多种原因导致这些关键细胞失活，这种失活导致毛囊变小和脱发。
3.目前，现在脱发的方法主要是药物或毛发移植。然而，药物如米诺地尔和非那雄胺在某些情况下效果不佳，需要持续使用以维持头发生长并具有不良副作用(gomes mj,martins s,ferreira d,segundo ma,reis s.lipid nanoparticles for topical and transdermal application for alopecia treatment:development,physicochemical characterization,and in vitro release and penetration studies.int j nanomedicine 2014；9:1231-42)。毛囊单位移植是昂贵的侵入性手术，并且受到供体毛囊短缺的限制。
4.故而，目前对于脱发的方法，例如：外科手术和药物，不能满足大多数患者的满意度。毛囊移植手术受到供体毛发短缺、细胞活力降低以及手术昂贵且耗时的限制。此外，由于脱发状况的渐进性，药物结果通常是暂时的。
5.因此，在领域中，许多研究通过探索毛发再生，关注毛囊从休止期到生长期的发育机制，从而来寻更为有效的方法。

技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种全新的能够用于促进毛发生长的活性因子，即羊膜上皮细胞来源的细胞外囊泡(haecs-evs)在毛发生长中的应用。
7.本发明提供了一种活性因子的用途，其特征在于：
8.上述活性因子为：羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡；
9.上述用途为：制备用于促进毛发生长的药物。
10.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
11.上述用途还可以为：制备用于促进毛发生长激活因子表达的药物。
12.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
13.上述用途还可以为：制备基于改善皮肤组织结构，来促进皮肤的毛发再生的药物。
14.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
15.上述用途还可以为：
16.制备用于促进β-catenin表达的药物；
17.和/或
18.制备用于促进lef1表达的药物；
19.和/或
20.制备用于促进gli1表达的药物；
21.和/或
22.制备用于促进ptch1表达的药物。
23.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
24.上述用途还可以为：制备用于促进处于静止期的毛囊向生长期毛囊转变的药物。
25.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
26.上述用途还可以为：
27.制备用于激活wnt信号通路的药物；
28.和/或
29.制备用于激活shh信号通路的药物。
30.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
31.上述用途还可以为：制备用于促进毛发加粗的药物；
32.和/或
33.制备用于提高毛囊生长速度的药物。
34.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
35.上述活性因子在药物中的含量不低于2mg/ml。
36.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
37.上述活性因子的制备方法为：
38.s1.将传代至第3-5代的羊膜上皮细胞培养于培养皿中，待细胞密度达到70％-80％时，吸出含有血清的完全培养基，用缓冲液洗涤2-3次后更换无血清的培养基；
39.s2.无血清的培养基培养24h以上后，收集细胞上清液，通过100-300g离心去除培养上清中的细胞及细胞碎片收集上清；
40.s3.通过2000-3000g离心去除沉淀收集上清；
41.s4.通过100000-120000g离心弃去上清，沉淀加入缓冲液重悬，获得羊膜上皮细胞细胞外囊泡。
42.进一步地，本发明提供的一种活性因子的用途，其特征还在于：
43.上述羊膜上皮细胞的制备方法为：
44.将离体的足月健康产妇新鲜的羊膜组织经胰酶消化后分离出人羊膜上皮细胞，重悬于培养基中，接种于细胞培养皿中后置于细胞培养箱中培养；
45.当细胞融合度达到70％-80％时，使用胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于培养基中，重新调整细胞密度并接种于细胞培养皿中后置于细胞培养箱中培养。
46.本发明的作用和效果：
47.本发明提供的羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡促进毛发再生中的应用。制备羊膜上皮细胞的原料来源是健康的羊膜，与其他各种干细胞相比，发育更原始，扩增能力更强，特别是具有来源广、获取成本低、可控性强等众多优势。羊膜上皮细胞的原料来源是健康的羊膜，其采集过程无创且方便，并且羊膜来源丰富，能够满足规模化生产；分离提取羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡的方法简单、有效。
48.本发明提供的羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡促进毛发再生中的应用，采用羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡可促进静止期毛囊向生长期转化，促进毛发再生。羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡可以用作促进毛发生长的化妆品或者药物组合物中将有广阔的应用前景。
附图说明
49.图1是实施例1中羊膜上皮细胞(haecs)的光镜图。
50.图2是实施例1中羊膜上皮细胞特异性标记蛋白免疫荧光染图。
51.图3是实施例1中羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)特异性标记蛋白的western blot鉴定结果。
52.图4是实施例1中羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)直径的大小的nta鉴定结果图。
53.图5是注射实施例2羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)后促进毛发再生情况的实验结果图。
54.图6是实施例2羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)后小鼠皮肤he染的实验结果图。
55.图7是实施例2羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)后皮肤中wnt和shh信号分子表达的实验结果图。
具体实施方式
56.下面结合优选实施例进一步对本发明进行说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
57.本发明中使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明所使用的方法，如he染、western blot等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述，本发明说明书中有描述的，参照本发明中描述的方法进行。
58.实施例1
59.羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡的分离鉴定
60.1.羊膜上皮细胞细胞(haecs)的分离培养及鉴定
61.将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化15min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的dmem/f12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％co2的37℃细胞培养箱中培养；当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min并重悬于含有胎牛血清的dmem/f12培养基中，重新调整细胞密度为1
×
105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％co2的37℃细胞培养箱中培养。
62.取第3代的细胞进行后续操作，羊膜上皮细胞鉴定如图1所示，将p3代细胞置光学
显微镜下观察，细胞形态呈圆形或卵圆形，呈现铺路石状生长。图1是羊膜上皮细胞(haecs)的光镜图。图2所示，培养的p3羊膜上皮细胞均表达ck19、e-cadherin和ssea-4。图1结果说明已获得纯度较高的haecs。
63.2.羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡(haec-evs)的分离鉴定
64.(1)将p3-5代的haecs培养于培养皿中，当细胞融合达60％时，用pbs清洗细胞2次，更换无外泌体血清dmed/f12培养基，继续培养48h后收集细胞上清，在300g离心10min去除培养上清中的细胞及细胞碎片收集上清；培养上清液2000-3000g离心20min去除沉淀收集上清；培养上清液120000g离心120min弃去上清，沉淀加入pbs重悬，利用超高速离心法获得羊膜上皮细胞细胞外囊泡(haec-evs)。
65.(2)western blot检测haec-evs特异性标记物
66.在haec-evs中加入相同体积的细胞裂解液，在冰上静置20min，4℃环境下12000
×
g离心15min，上层清液即为haec-evs总蛋白。配置10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶及浓缩胶，上样量为每孔40μg，80v电泳2h，200ma转膜1h，取出pvdf膜浸润在5％bsa中封闭1h，4℃湿盒中孵育一抗cd63、cd9、alix和calnexin过夜，pbst洗涤3次后37℃孵育二抗1h，再用pbst洗涤3次，最后利用ecl化学发光系统进行拍照。结果如图3所示，羊膜上皮细胞细胞外囊泡(haec-evs)的特异性标志物cd63、cd9和alix阳性表达。
67.(3)纳米离子分析仪分析haec-evs的直径
68.采用nanosight分析仪进行分析，取500微升稀释后的待测样品，按仪器说明书进行操作，测量出微粒的大小及浓度。结果如图4所示，羊膜上皮细胞细胞外囊泡(haec-evs)大多数的直径范围为70nm至190nm。
69.实施例2
70.haec-evs改善皮肤组织微环境，促进毛发再生
71.实验动物均为6周龄c57bl/6小鼠，重约30g，以平行脊椎为长轴方向，将松香与石蜡混合加热融化涂于小鼠背部，涂抹面积约4cm x 3cm，冷却凝固后揭去，以去除背毛，造模成功的小鼠皮肤颜粉红，表面光滑，无破溃、黑素沉着等现象，确认休止期(小鼠背部皮肤呈粉红)开始给药。
72.将造模成功的小鼠随机分为2组，分别为实验组即haec-evs组和对照组组。每组5只，在造模后第二天，将haec-evs50μl(浓度为2mg/ml)或pbs皮下注射到小鼠背侧皮肤左侧的10个注射点，在后第0、7、14和21天收集了脱毛小鼠毛发再生状态的图像。
73.1.毛发再生情况观察
74.haec-evs局部皮下注射后，为确定毛发再生效果，数码相机追踪拍照毛发再生情况。
75.haec-evs促进毛发再生情况的实验结果如图5所示，在第14天haecs组的毛发再生情况高于对照组。但是，haec-evs组的侧与未侧相比没有显着差异。说明haec-evs促进了毛囊从休止期到生长期的转化，显著促进毛发再生。
76.2.he染观察皮肤组织的显微结构
77.后，从注射部位(左)和未部位(右)收集皮肤样本，4％多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为5μm。
78.如图6所示苏木精和伊红(h&e)染表明，与对照组相比，haec-evs组在
侧和未侧均促进皮肤增厚和毛球增大。说明haec-evs后，皮肤组织结构得到改善，促进了皮肤的毛发再生。
79.3.haec-evs促进体内毛囊中的wnt和shh信号分子表达
80.后取材，随后经免疫荧光染检测wnt和shh信号分子表达的变化。
81.如图7所示，与对照组相比，haec-evs的促进了侧和未侧β-catenin、lef1、gli1和ptch1的表达。但是，haec-evs组在侧和未侧之间没有显着差异。这些结果表明haec-evs增加了毛发生长激活剂的表达水平。
82.以上结果描述了本发明的原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

技术特征：

1.一种活性因子的用途，其特征在于：所述活性因子为：羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡；所述用途为：制备用于促进毛发生长的药物。2.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备用于促进毛发生长激活因子表达的药物。3.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备基于改善皮肤组织结构，来促进了皮肤的毛发再生的药物。4.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备用于促进β-catenin表达的药物；和/或制备用于促进lef1表达的药物；和/或制备用于促进gli1表达的药物；和/或制备用于促进ptch1表达的药物。5.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备用于促进毛囊周期从静止期向生长期转变的药物。6.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备用于激活wnt信号通路的药物；和/或制备用于激活shh信号通路的药物。7.如权利要求1所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述用途还可以为：制备用于促进毛囊加粗的药物；和/或制备用于提高毛囊生长速度的药物。8.如权利要求1-7任一所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述活性因子在药物中的含量不低于2mg/ml。9.如权利要求1-7任一所述的一种活性因子的用途，其特征在于：所述活性因子的制备方法为：s1.将传代至第3-5代的羊膜上皮细胞培养于培养皿中，待细胞密度达到70％-80％时，吸出含有血清的完全培养基，用缓冲液洗涤2-3次后更换无血清的培养基；s2.无血清的培养基培养24h以上后，收集细胞上清液，通过100-300g离心去除培养上清中的细胞及细胞碎片收集上清；s3.通过2000-3000g离心去除沉淀收集上清；s4.通过100000-120000g离心弃去上清，沉淀加入缓冲液重悬，获得羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡。10.如权利要求9所述的一种活性因子的用途，其特征在于：
所述羊膜上皮细胞的制备方法为：将离体的足月健康产妇新鲜的羊膜组织经胰酶消化后分离出人羊膜上皮细胞，重悬于培养基中，接种于细胞培养皿中后置于细胞培养箱中培养；当细胞融合度达到70％-80％时，使用胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于培养基中，重新调整细胞密度并接种于细胞培养皿中后置于细胞培养箱中培养。

技术总结

本发明涉及一种活性物质，即、羊膜上皮细胞来源细胞外囊泡通过刺激毛囊促进毛发生长的应用。本发明通过系列实验证明hAEC-EVs可以明显促进处于静止期的毛囊向生长期毛囊转变促进毛发再生。因此，hAEC-EVs在促进毛发生长中具有广阔应用前景。中具有广阔应用前景。中具有广阔应用前景。

技术研发人员：

赵敬军 金佳慧

受保护的技术使用者：

上海交通大学医学院附属新华医院

技术研发日：

2022.10.08

技术公布日：

2022/12/30