一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液及应用

一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液及应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种系统性红斑狼疮动物模型，尤其涉及一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液及应用。
(二)

背景技术：

2.系统性红斑狼疮是一种常见的以多系统的器官组织慢性炎症性损害为特征的自身免疫病，其病因和发病机制尚不完全清晰，目前认为可能由遗传，炎症，激素和环境等因素综合作用，引起机体免疫稳态失衡，调节紊乱，抗原抗体复合物，补体复合物沉积血管引起免疫反应以及血栓形成最终导致局部或全身组织器官损害。构建动物模型有助于疾病的研究，对探讨发病机制和方法具有重要意义。
3.目前系统性红斑狼疮的小鼠模型主要分为自发型小鼠模型、人工诱导型小鼠模型和基因调控小鼠模型。降植烷(pristane)为细胞膜激活剂，与脂质双分子和细胞膜结合，在一定浓度下对细胞造成毒性。自从satoh m等发现给非自发性免疫鼠balb/c注射降植烷成功诱导小鼠狼疮以来，该方法已成为人工诱导狼疮小鼠模型常用方法。但仅注射pristane诱导小鼠出现sle样症状和体征所需时长在6个月左右，造模时间长，影响到系统性红斑狼疮的动物模型实验研究效率。
4.重金属可能会增加全身性自身免疫，同时接触某些重金属可能会增加与其他接触相关的风险。镉(cd)是一种有毒的重金属元素，它可以通过空气、食物、饮用水、吸烟等被人体被吸收，随着时间的推移在多个器官和组织中积累会导致对卵巢、肝脏、肾脏和大脑等器官的损害。因此，镉元素可能是诱导某些疾病的重要因素。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液及应用，该方法具有简便、高效、迅速的优点，解决现有方法造模时间长、成本高的问题。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液，所述降植烷氯化镉纳米乳液由降植烷、氯化镉、表面活性剂和水混合而成；所述表面活性剂包括司盘80(span 80)或吐温80(tween 80)。
8.优选的，所述氯化镉以0.01-1.0mg/ml氯化镉水溶液的形式加入，所述降植烷体积终浓度为50-70％，氯化镉水溶液体积终浓度为20-40％，所述表面活性剂体积终浓度为2-8％，总量100％。更优选的，所述氯化镉以0.1mg/ml氯化镉水溶液的形式加入，所述降植烷体积终浓度为63％，氯化镉水溶液体积终浓度为32％，所述表面活性剂体积终浓度为5％。
9.优选的，所述降植烷氯化镉纳米乳液按如下方法制备：将降植烷加入表面活性剂a中，混匀形成a溶液；将氯化镉水溶液加入表面活性剂b中，混匀形成b溶液；将a溶液在超声
频率40-80khz、温度4-25℃下缓慢滴入b溶液中，滴加完毕，继续超声1h，获得降植烷氯化镉纳米乳液。所述表面活性剂a和表面活性剂b均为表面活性剂，两者可以相同，也可以不同，所述表面活性剂用量以表面活性a和表面活性剂b总量计。所述降植烷与表面活性剂a体积比为0.01-0.1:1，优选0.06:1；所述氯化镉水溶液浓度为0.1mg/ml，所述氯化镉水溶液与表面活性剂b体积比为1:0.01-0.1，优选1:0.04；所述a溶液与b溶液体积比为1:0.1-1，优选1:0.5。
10.优选的，所述超声条件为超声频率53khz、温度24℃。
11.优选的，所述每1.5ml降植烷氯化镉纳米乳液按如下方法制备：1ml降植烷中加入0.06ml的span 80，混匀形成a溶液；取浓度为0.1mg/ml的氯化镉溶液10ml，加入0.4ml tween 80，混匀形成b溶液；取1ml的a溶液放入超声机，在24℃、53khz超声条件下缓慢滴入0.5ml的b溶液，滴加完毕后，继续超声1h，获得1.5ml的降植烷氯化镉纳米乳液。
12.本发明提供一种所述降植烷氯化镉纳米乳液在快速构建系统性红斑狼疮动物模型中的应用，所述的应用是采用降植烷氯化镉纳米乳液注射小鼠，构建所述系统性红斑狼疮动物模型；所述降植烷氯化镉纳米乳液注射量为30ml/kg体重。
13.所述系统性红斑狼疮动物模型构建方法为：采用c57bl/6小鼠，单次腹腔注射0.6ml氯化镉浓度为0.035mg/ml的降植烷氯化镉纳米乳液注射液，注射之后，全封闭饲养于spf环境中，在温度为20～26℃、湿度为40～60％的条件下饲养，每隔2周，分别对小鼠进行尾静脉取血检测自身抗体水平，尿蛋白检测，构建系统性红斑狼疮动物模型。
14.本发明还提供一种所述系统性红斑狼疮动物模型在筛选系统性红斑狼疮药物中的应用。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
16.采用本发明降植烷氯化镉纳米乳液加速小鼠系统性红斑狼疮模型的发病进展，小鼠发病时间早，注射降植烷氯化镉纳米乳液第4周时即可检测到小鼠体内典型系统性红斑狼疮症状，即抗双链dna抗体的产生，并随着时间的延长自身抗体水平升高。模型小鼠发病进展迅速，造模第12周即出现系统性红斑狼疮典型病理特征，为系统性红斑狼疮研究提供便利动物模型。
17.本发明采用氯化镉联合降植烷构建系统性红斑狼疮动物模型，加速c57bl/6小鼠系统性红斑狼疮发病，缩短模型构建时间，从传统6个月缩短至12周。与传统造模对比，本发明模型小鼠体内自身抗体水平，小鼠淋巴组织的增生，以及后期小鼠肾脏的肾小球炎症性状改变等指标有更加明显改变，小鼠系统性系统性红斑狼疮疾病发生速度明显提前，该种方法可以提前传统系统性红斑狼疮模型发病至少4周时间，是一种简便、高效、快捷的加速系统性红斑狼疮小鼠模型发病的方法。本发明方法构建的系统性红斑狼疮动物模型发病在系统性红斑狼疮的机理研究和方面的应用。
(四)附图说明
18.图1：实施例1降植烷氯化镉纳米乳液的粒径(a)和zeta电位图(b)。
19.图2：实施例1不同温度条件下降植烷氯化镉纳米乳液的粒径变化图(a)和pdi变化曲线(b)。
20.图3：实施例2降植烷氯化钠纳米乳液的粒径(a)和zeta电位图(b)。
21.图4：实施例3各组小鼠体内的抗双链dna抗体的水平图。
22.图5：实施例3各组小鼠的蛋白尿水平图。
23.图6：实施例3各组小鼠一般病变(a)和淋巴结的外观图(b)。
24.图7：实施例3各组小鼠的脾脏指数图。
25.图8：实施例3各组小鼠肾脏组织的切片染结果图。
26.图9：实施例3各组小鼠th1细胞/th2细胞比值结果图。
27.图10：实施例4系统性红斑狼疮动物模型后小鼠体内的抗双链dna抗体的水平图。
28.图11：实施例4系统性红斑狼疮动物模型后小鼠的脾脏指数图，a为脾脏大小照片；b为脾脏指数图。
29.图12：实施例4系统性红斑狼疮动物模型后小鼠肾脏组织的切片染结果图，a空白对照组；b模型组；c中药组；d西药组。
(五)具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
31.实施例1、降植烷氯化镉纳米乳液制备及性能检测
32.(1)1ml降植烷中加入0.06ml的span 80，混匀形成a溶液。取浓度为0.1mg/ml的氯化镉水溶液10ml，加入0.4ml tween 80，混匀形成b溶液。取1ml的a溶液放入超声机，在24℃、53khz超声条件下缓慢滴入0.5ml的b溶液，滴加完毕后，继续超声1h，获得1.5ml的降植烷氯化镉纳米乳液。
33.(2)取步骤(1)制备的降植烷氯化镉纳米乳液1ml，使用激光纳米粒度分析仪测定乳液粒径及zeta电位(测试3次，取均值)，结果如图1所示，结果表明，纳米溶液的粒径为1.630
±
0.23nm，多分散系数(pdi)为0.227
±
0.01，zeta电位为31.1
±
0.54mv，纳米乳液的颗粒分散较为均匀。
34.(3)将步骤(1)制备的降植烷氯化镉纳米乳液分别放置在4℃、25℃、60℃避光条件下储存，分别在第5、10、15、20、15日检测其粒径，结果如图2所示，结果表明在低温条件下氯化镉纳米乳液的稳定性更好。
35.实施例2、降植烷氯化钠纳米乳液、降植烷空白纳米乳液的制备
36.降植烷氯化钠纳米乳液：1ml降植烷中加入0.06ml的span 80，混匀形成a溶液。取浓度为0.1mg/ml的氯化钠水溶液10ml，加入0.4ml tween 80，混匀形成b溶液。取1ml的a溶液放入超声机，在24℃、53khz超声条件下缓慢滴入0.5ml的b溶液，滴加完毕后，继续超声1h，获得1.5ml的降植烷氯化钠纳米乳液。使用激光纳米粒度分析仪测定乳液粒径及zeta电位(测试3次，取均值)，结果如图3所示，结果表明，纳米溶液的粒径为2.309
±
0.36nm，多分散系数(pdi)为0.256
±
0.07，zeta电位为-64.9
±
0.73mv，纳米乳液的颗粒分散较为均匀。
37.降植烷空白纳米乳液：1ml降植烷中加入0.06ml的span 80，混匀形成a溶液。取双蒸水10ml，加入0.4ml tween 80，混匀形成b溶液。取1ml的a溶液放入超声机，在24℃、53khz超声条件下缓慢滴入0.5ml的b溶液，滴加完毕后，继续超声1h，获得1.5ml的降植烷空白纳米乳液。
38.实施例3、系统性红斑狼疮动物模型的构建
39.1、动物模型的构建
40.(1)将6-8周龄，体重(20
±
2)g的c57bl/6小鼠随机分成4组：降植烷氯化钠乳液组简称降植烷组(pristane)，降植烷空白乳液组(pristane blank)，模型组(model)，空白对照组(blank)。
41.(2)降植烷组单次腹腔注射0.6ml实施例2方法制备的降植烷氯化钠纳米乳液；降植烷空白乳液组单次腹腔注射0.6ml降植烷空白纳米乳液；模型组单次腹腔注射0.6ml实施例1方法制备的降植烷氯化镉纳米乳液；空白对照组注射0.6ml的生理盐水。注射之后，各组全封闭饲养于浙江中医药大学实验动物中心的spf环境中，高压灭菌处理的饮用水和饲料均由浙江中医药大学动物实验中心统一提供。饲养条件始终保持稳定，温度为20～26℃，湿度为40～60％，每隔2周，分别对小鼠进行尾静脉取血，检测自身抗体水平，尿液取样检测肾脏病变。
42.2、监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况
43.(1)elisa检测小鼠血清中自身抗体水平
44.在无菌条件下，对小鼠尾静脉取血分离血清，于-80℃冰箱保存，elisa试剂盒(pm95114，上海博湖生物科技有限公司)检测小鼠血清中自身抗体水平，主要是抗小鼠双链dna抗体水平，dsdna值越高代表小鼠系统性红斑狼疮的发病越快，结果如图4所示。
45.降植烷组注射后10周起dsdna值出现明显升高，dsdna浓度达到700ng/l需11周。降植烷空白乳液组变化趋势与降植烷组基本一致，在第10周起明显升高，第11周达到700ng/l。空白对照组小鼠的dsdna值维持不变。模型组小鼠dsdna抗体自第4周开始出现明显增高，并相比较降植烷组逐周增高，第5周抗体水平接近降植烷组小鼠第11周水平，表明模型组小鼠抗体升高速度明显快于降植烷组、降植烷空白组和空白对照组。降植烷氯化镉纳米乳液能够明显加快小鼠系统性红斑狼疮建模时间。
46.(2)小鼠肾脏病变的观测
47.蛋白尿试剂盒(c035-2-1，南京建成生物工程研究所)检测小鼠尿液中尿蛋白含量，继而进行小鼠肾脏有无发生病例改变，结果如5所示，发现模型组小鼠的尿蛋白水平均比降植烷组、降植烷空白乳液组和空白对照组高。
48.(3)小鼠一般病变及病理组织学观察与检测
49.注射12周后，处死小鼠，分别取空白对照组、降植烷组和模型组小鼠淋巴结进行观察，取小鼠淋巴组织脾脏进行称重，结果如图6所示。
50.图6中a为小鼠淋巴结观察，降植烷组和模型组小鼠均出现毛发稀疏脱毛现象。图6中b对降植烷组和模型组小鼠淋巴结进行观察，发现模型组小鼠的淋巴结外观与数量均比降植烷组的大且多。
51.对空白对照组、降植烷组和模型组小鼠淋巴组织脾脏称重，结果如图7所示，发现模型组小鼠的脾脏比降植烷组重。
52.(4)小鼠病理组织切片观察：
53.模型组和空白对照组小鼠注射12周后处死，降植烷组小鼠注射20周后处死，分别取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染(masson染40
×
，pas染40
×
)，显微镜下观察，结果如8所示。
54.由图8中的masson染可观察到造模20周的降植烷组和造模12周的模型组小鼠出现不同程度肾脏血管内皮细胞侧和系膜区分布玫瑰红沉淀物，可见蓝胶原物质沉积，肾小球呈现出节段性硬化，大量细胞增生存在于肾小管中，可见大量毛细血管腔内的透明样血栓；相较于降植烷组，模型组肾小球内皮细胞下免疫复合物沉积明显多于降植烷组。
55.由图8中的pas染，观察到，与空白对照组相比，造模20周的降植烷组与造模12周的模型组均呈阳性反应。系膜细胞及基质均明显增多，肾小球系膜、基底膜及肾小管均可见大量淋巴细胞浸润。
56.(4)小鼠脾脏细胞th1/th2流式细胞术检测：
57.空白对照组、降植烷组和模型组的各组小鼠注射12周后处死，取脾脏组织进行th1/th2流式细胞检测，具体步骤如下：
58.1)细胞悬液：取1/3新鲜获得的脾脏组织于200目不锈钢网上研磨，用2ml pbs溶液进行来回冲洗，总共三次，收集到15ml管中，4℃，1000rpm离心8min，弃去上清。加5ml红细胞裂解液(购自r874904，上海麦克林生化科技有限公司)，轻轻吹打。静置5min后，4℃，1000rpm离心8min，弃上清，加入2ml pbs重悬细胞沉淀，再次过200目不锈钢网并用2ml pbs溶液进行来回冲洗，总共三次，收集到15ml离心管中。之后4℃，1000rpm离心8min，弃上清，用含有10％胎牛血清(10099141，gibco公司)的1640培养基(cgm112.5，cellmax)重悬沉淀，使细胞浓度为1
×
107/ml，即为细胞悬液。
59.2)流式细胞术检测：采用th1/th2试剂盒(kth201-25，杭州联科生物技术股份有限公司)，取250μl细胞悬液至流式管中，加入1μl的pma/ionomycin/bfa/monensin mixture(250x)，作为样本管；以只含细胞悬液的流式管作为对照管。分别混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀。从样本管和对照管中取100μl细胞悬液至流式细胞仪(美国beckman公司)新的流式管中，加入5μl anti-mouse cd3与fitc的混合液和5μl anti-mouse cd4与percy-5.5的混合液。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。每管加入100μl fix&perm medium a，震荡混匀，室温避光孵育15分钟。每管加入2ml预冷1xflow cytometry staining buffer，300g离心5分钟，弃上清。每管加入100μl fix&perm medium b、5μl anti-mouse ifn-γ，pe和5μl anti-mouse il-4，apc。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。每管加入2ml 1x flow cytometry staining buffer，300g离心5分钟，弃上清。每管加入500μl 1x flow cytometry staining buffer重悬，上机检测。
60.结果如图9所示，模型组小鼠造模第12周时，小鼠脾脏组织中th1细胞显著降低、th2细胞显著升高，th1细胞/th2细胞比值显著降低。与降植烷组相比，模型组小鼠th1/th2的失衡状态更为严重。
61.综上，在注射12周，模型组小鼠系统性红斑狼疮动物模型构建成功。
62.实施例4、系统性红斑狼疮动物模型效果
63.1、小鼠分组
64.将实施例3注射降植烷氯化镉纳米乳液后造模成功的小鼠随机分成3组，模型组，中药组，西药组，同时增加一组未注射降植烷氯化镉纳米乳液的c57bl/6小鼠作为空白对照组。
65.2、药物干预
66.解毒祛瘀滋阴方水煎剂(刘秋萍,王明珠,林笑颖,李海昌,温成平,何志兴.早期不
同肠道菌对解毒祛瘀滋阴方mrl/lpr狼疮小鼠的影响[j].中华中医药杂志,2021,36(04):2033-2037.)：干地黄15g，青蒿12g，炙鳖甲12g，升麻9g，赤芍12g，白花蛇舌草15g，积雪草15g，炒薏苡仁15g，佛手9g，生甘草6g。加1000g水，煎成76.9ml。
[0067]
模型组和空白对照组予蒸馏水灌胃；中药组予15.6g/kg解毒祛瘀滋阴方水煎剂灌胃；西药组予5mg/kg醋酸泼尼松灌胃。各组灌胃均每日1次，持续8周。
[0068]
3、监测小鼠系统性红斑狼疮的发病状况
[0069]
(1)elisa检测小鼠血清中自身抗体水平
[0070]
各组小鼠灌胃8周后，在无菌条件下对小鼠进行尾静脉取血分离血清，于-80℃冰箱保存，elisa检测小鼠血清中自身抗体水平，主要是抗小鼠双链dna抗体水平，结果如图10所示。模型组小鼠血清中dsdna含量明显高于空白对照组(p《0.01)，证明小鼠具有发病特征。经过药物后，中药组与西药组小鼠血清中的dsdna含量明显低于模型组(p《0.01)。
[0071]
(2)小鼠一般病变及病理组织学观察与检测
[0072]
各组小鼠灌胃8周后，处死小鼠，取小鼠脾脏进行称重，并进行小鼠肾脏病理组织切片he和masson染观察。
[0073]
小鼠脾脏大小及重量结果如图11所示，与空白对照组对比，模型组小鼠脾脏出现明显的肿大，颜呈现暗红，有白被膜包被；西药组与解毒祛瘀滋阴方组小鼠脾脏肿大程度减轻。
[0074]
小鼠肾脏病理组织切片染结果如图12所示，与空白对照组相比较，可见模型组小鼠肾脏血管内皮细胞侧和系膜区分布玫瑰红沉淀物，可见大量蓝胶原物质沉积，肾小球呈现出节段性硬化，大量细胞增生存在于肾小管中。中药组与西药组红沉积物明显减少，肾小球形态相对正常，蓝胶原物质沉积减少，纤维化程度降低。证明由氯化镉纳米乳液诱导加速的系统性红斑狼疮动物模型成功构建，且药物其模型具有良好效果。
[0075]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：

1.一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述降植烷氯化镉纳米乳液由降植烷、氯化镉、表面活性剂和水混合而成；所述表面活性剂包括span 80或tween 80。2.如权利要求1所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述氯化镉以0.01-1.0mg/ml氯化镉水溶液的形式加入，所述降植烷体积终浓度为50-70％，氯化镉水溶液体积终浓度为20-40％，所述表面活性剂体积终浓度为2-8％，总量100％。3.如权利要求1所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述氯化镉以0.1mg/ml氯化镉水溶液的形式加入，所述降植烷体积终浓度为63％，氯化镉水溶液体积终浓度为32％，所述表面活性剂体积终浓度为5％。4.如权利要求1所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述降植烷氯化镉纳米乳液按如下方法制备：将降植烷加入表面活性剂a中，混匀形成a溶液；将氯化镉水溶液加入表面活性剂b中，混匀形成b溶液；将a溶液在超声频率40-80khz、温度4-25℃下缓慢滴入b溶液中，滴加完毕，继续超声1h，获得降植烷氯化镉纳米乳液。5.如权利要求4所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述降植烷与表面活性剂a体积比为0.01-0.1:1；所述氯化镉水溶液浓度为0.1mg/ml，所述氯化镉水溶液与表面活性剂b体积比为1:0.01-0.1；所述a溶液与b溶液体积比为1:0.1-1。6.如权利要求4所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，所述超声条件为超声频率53khz、温度24℃。7.如权利要求4所述的降植烷氯化镉纳米乳液，其特征在于，每1.5ml降植烷氯化镉纳米乳液按如下方法制备：1ml降植烷中加入0.06ml的span 80，混匀形成a溶液；取浓度为0.1mg/ml的氯化镉水溶液10ml，加入0.4ml tween 80，混匀形成b溶液；取1ml的a溶液放入超声机，在24℃、53khz超声条件下缓慢滴入0.5ml的b溶液，滴加完毕后，继续超声1h，获得1.5ml的降植烷氯化镉纳米乳液。8.一种权利要求1所述降植烷氯化镉纳米乳液在快速构建系统性红斑狼疮动物模型中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用降植烷氯化镉纳米乳液注射小鼠，构建所述系统性红斑狼疮动物模型。

技术总结

本发明公开了一种用于快速构建系统性红斑狼疮动物模型的降植烷氯化镉纳米乳液及应用，所述降植烷氯化镉纳米乳液由降植烷、氯化镉、表面活性剂和水混合而成；所述表面活性剂包括Span 80或tween 80。采用本发明降植烷氯化镉纳米乳液加速小鼠系统性红斑狼疮模型的发病进展，小鼠发病时间早，注射降植烷氯化镉纳米乳液第4周时即可检测到小鼠体内典型系统性红斑狼疮症状，即抗双链DNA抗体的产生，并随着时间的延长自身抗体水平升高。模型小鼠发病进展迅速，造模第12周即出现系统性红斑狼疮典型病理特征，为系统性红斑狼疮研究提供便利动物模型。本发明是一种简便、高效、快捷的加速系统性红斑狼疮小鼠模型发病的方法。统性红斑狼疮小鼠模型发病的方法。