黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法及其应用

1.本发明涉及纳米材料与生物传感器技术领域，尤其涉及一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法及其应用。

背景技术：

2.胰腺导管腺癌(简称胰腺癌)是一种高度恶性的消化系统肿瘤，早期诊断难，确诊时往往处于中晚期，易发生转移，手术效果差。由于瘤内乏血供、免疫抑制等特殊微环境，胰腺癌对放、化疗敏感性低且易产生耐药性，致使其难度大与预后极差，五年生存率不足10％。因此，迫切需要开发胰腺癌的高效新方法。
3.与传统胰腺癌方法相比，基于纳米探针的光热在胰腺癌中可高效消融肿瘤组织，显著抑制原发肿瘤的生长，然而由于胰腺癌肿瘤微环境处于免疫抑制状态，单一光热释放的肿瘤相关抗原难以引起高效的免疫应答，对抑制肿瘤的转移及复发效果不佳。

技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是如何提高胰腺癌效果。
5.为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针，该纳米探针以黑二氧化钛纳米粒子为载体，所述载体表面包裹介孔二氧化硅并偶联磁共振成像对比剂，所述介孔二氧化硅上负载免疫激动剂。
6.进一步地，所述磁共振成像对比剂选自以下任意一种：钆塞酸二钠、钆喷酸葡胺、钆双胺和卡地胺钠、钆特酸葡胺、钆特醇。优选为dota-gd。
7.进一步地，所述免疫激动剂为toll样受体7/8激动剂r848。
8.本发明第一方面提供上述黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
9.s1、将白二氧化钛纳米粒子还原为黑二氧化钛纳米粒子btio2；
10.s2、在btio2表面包裹介孔二氧化硅，构建btio2@msio2纳米粒子；
11.s3、对btio2@msio2表面进行氨基化修饰，得到btio2@msio
2-nh2；
12.s4、磁共振成像对比剂与btio2@msio
2-nh2发生缩合反应，得到磁共振成像对比剂修饰的纳米粒子btio2@msio2@gd；
13.s5、通过物理吸附负载免疫激动剂，得到黑氧化钛基光热免疫纳米探针。
14.进一步地，所述步骤s1中以nabh4为还原剂，还原剂与白二氧化钛纳米粒子的质量比为1:2～1:4，典型质量比为1:2、1:3、1:4等。
15.进一步地，所述步骤s2中采用teos在碱性条件下水解作为硅源，ctab作为模板剂。
16.进一步地，所述步骤s3中用aptes对btio2@msio2表面进行氨基化修饰。
17.进一步地，所述步骤s4中用六水合醋酸钆与dota-nhs-ester螯合形成gd-dota。
18.进一步地，所述步骤s4中将btio2@msio2@gd与免疫激动剂以质量比为5:1～10:1混
合在无菌水中，典型质量比为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，搅拌、离心后得到纳米探针。
19.本发明第三方面提供上述黑氧化钛基光热免疫纳米探针的应用，将其应用于光热-免疫及mri成像一体化试剂盒。
20.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
21.本发明的纳米探针将光热试剂与免疫激动剂联合，同时连接具有mri成像功能的磁共振成像对比剂，在mri成像引导下观察纳米粒子的分布情况，利用光热作用松解胰腺癌基质，促进免疫激动剂的肿瘤渗透，改善胰腺癌免疫抑制微环境，促进树突状细胞的成熟，进一步将光热释放的肿瘤相关抗原递呈给效应t细胞，提高免疫应答水平，由此能够提高胰腺癌的效果。
22.本发明的纳米探针具有良好的光热转化性能及mri成像功能，黑二氧化钛纳米粒子在近红外光照射下可将光能转化为热能，可通过光热消融肿瘤组织，磁共振成像对比剂能够有效缩短t1弛豫时间，显著提高磁共振t1弛豫率，具有理想t1显像效果，toll样受体激动剂雷西莫特(resiquimod,r848)可通过改善免疫细胞浸润来逆转胰腺癌免疫抑制微环境，纳米探针在利用光热消融肿瘤组织的同时利用toll样受体激动剂改善胰腺癌肿瘤微环境，促进树突状细胞成熟递呈光热消融肿瘤释放的肿瘤相关抗原，进一步诱导机体免疫应答，提高机体抗肿瘤能力。
附图说明
23.图1为本发明实施例1中黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备流程示意图；
24.图2为本发明实施例1中磁共振成像对比剂修饰的纳米粒子btio2@msio2纳米粒子和btio2@msio2@gd/r848纳米探针的tem图；
25.图3为本发明实施例1中btio2@msio2、btio2@msio
2-nh2、btio2@msio2@gd和btio2@msio2@gd/r848及免疫激动剂r848的理化性能表征图；
26.图4为本发明实施例3中btio2@msio2@gd/r848纳米探针在808nm nir光照射下的光热性能测试结果图；
27.图5为本发明实施例4中btio2@msio2@gd/r848纳米探针的mr成像性能测试结果图；
28.图6为本发明实施例5中btio2@msio2@gd/r848纳米探针体外促树突状细胞成熟测试结果图。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
30.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
31.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
32.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
33.实施例1
34.本实施例制备一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针，制备流程如图1所示，包括以下步骤：
35.s1、制备btio2纳米粒子
36.以nabh4为还原剂将商用白二氧化钛纳米粒子(p25)还原为黑二氧化钛纳米粒子：将4.0g白二氧化钛纳米粒子与1.5g nabh4粉末一起加入研钵中，在室温下研磨30min使其混合均匀，将研磨好的粉末转移至刚玉舟中，并用锡纸进行包封后放至管式炉中，在氩气环境下反应3h(设置升温速率10℃/min，升温至350℃)。收集黑粉末并多次离心、超纯水洗去除残留的nabh4并收集干燥得到btio2粉末。
37.s2、合成btio2@msio2纳米粒子
38.采用teos在碱性条件下水解作为硅源，ctab作为模板剂，在btio2表面包裹介孔二氧化硅，构建btio2@msio2纳米粒子：具体地，将100mg btio2粉末分散于20ml水中，通过超声波细胞粉碎仪超声5min，加入0.5g ctab和0.3ml naoh溶液(0.1mm)，在60℃油浴磁力搅拌(200rpm)2h后加入20ml含有teos的环己烷(20v/v％)，60℃油浴磁力继续搅拌(200rpm)至24h。收集产物，水或乙醇差速离心洗涤6次。将收集后的btio2@msio2分散于50ml酸醇(浓盐酸：甲醇为20v/v％)溶液中，80℃多次回流去除ctab，并用水、乙醇交替离心洗涤，收集得到btio2@msio2纳米粒子。btio2@msio2纳米粒子的微观结构如图2a所示。
39.s3、对btio2@msio2表面进行氨基化修饰
40.aptes对btio2@msio2表面进行氨基化修饰。具体地，将20mg btio2@msio2分散于20ml无水乙醇中，加入2ml aptes在80℃油浴锅中搅拌反应12h后离心洗涤，收集样品btio2@msio
2-nh241.s4、偶联gd-dota
42.六水合醋酸钆与dota-nhs-ester螯合形成gd-dota并通过缩合反应与负载于btio2@msio
2-nh2发生缩合反应：在六水合醋酸钆溶液中加入dota-nhs-ester(摩尔比为1:2)，用0.1mm naoh溶液调节ph值至6.5，搅拌24h后，加入btio2@msio
2-nh2分散液，并调ph值至7.5～8.5，在室温下搅拌24h后，离心得到gd-dota修饰的btio2@msio2@gd纳米粒子。
43.s5、合成btio2@msio2@gd/r848纳米探针
44.通过物理吸附负载免疫激动剂r848。具体地，将btio2@msio2@gd与r848以质量比为10:1混合在无菌水中，搅拌24h后离心得到btio2@msio2@gd/r848纳米探针。纳米探针的微观结构如图2b所示。
45.实施例2
46.本实施例对实施例1中的btio2@msio2、btio2@msio
2-nh2、btio2@msio2@gd和btio2@msio2@gd/r848及免疫激动剂r848进行理化性能表征。表征方法及结果如下：
47.(1)利用动态光散射(dynamic light scattering，dls)技术检测纳米粒子的水合粒径，结果如图3a所示，经dls检测得btio2@msio2、btio2@msio
2-nh2、btio2@msio2@gd、btio2@msio2@gd/r848的平均水合粒径分别约为191.3nm、240.7nm、288.9nm、290.5nm。dls结果表明纳米粒子的粒径在每次表面修饰后逐渐增加且最终制备的纳米探针可用于生物。
48.(2)利用zeta电位技术检测纳米探针的表面电荷，结果如图3b所示，四种不同修饰过程的纳米探针的相应zeta电位分别为-26.2mv、19.4mv、31.7mv、-8.5mv，r848的平均电荷约为-16mv。由zeta电位检测结果可知，搭载免疫激动剂r848后，btio2@msio2@gd的表面电荷从31.7mv明显降低至-8.5mv，btio2@msio2@gd的正电荷被r848的负电荷部分中和，说明r848成功搭载在btio2@msio2@gd上。
49.(3)通过傅里叶红外光谱仪对不同样品的红外吸收光谱进行检测，结果如图3c所示，相对于btio2@msio
2-nh2，btio2@msio2@gd在c＝o(1650cm-1
)和c-n(1450cm-1
)左右出现了峰的变化，为典型的酰胺键吸收峰，表明btio2@msio
2-nh2与dota-gd发生了酰胺反应，成功连接了dota-gd。此外btio2@msio2/r848相对于btio2@msio2@gd出现了r848的特征峰，且发生了一定的程度的红移。
50.(4)通过紫外-可见-近红外吸收光谱仪对不同样品的紫外-可见-近红外吸收光谱进行检测，结果如图3d所示，btio2@msio2、btio2@msio
2-nh2、btio2@msio2@gd和btio2@msio2@gd/r848及toll样受体激动剂r848的紫外-可见-近红外光吸收谱也都发生了不同程度的红移。傅里叶红外光谱及紫外-可见-近红外光吸收谱结果均说明r848成功搭载在btio2@msio2@gd纳米探针上。
51.实施例3
52.本实施例对实施例1的btio2@msio2@gd/r848纳米探针的光热性能进行评估。
53.利用功率密度为1.5w/cm2的808nmnir光对1ml不同ti浓度(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)的btio2@msio2@gd/r848分散液进行照射10min，通过绘制升温曲线对其光热性能进行评估。由图4a可知，在1.5w/cm2功率密度下，ti浓度为150μg/ml的溶液10min内即可升至50℃左右。接着选择功率密度为0.5w/cm2、1.0w/cm2、1.5w/cm2、2.0w/cm2的808nmnir光分别照射1mlti浓度为150μg/ml的btio2@msio2@gd/r848分散液10min。如图4b所示，功率密度越高，被激光照射的溶液升温速率越快。研究证实癌细胞暴露于50℃下几分钟即可发生死亡，为减少对周围正常组织的损伤，综合考虑，认为当808nmnir光的功率密度为1.5w/cm2，ti浓度为150μg/ml的btio2@msio2@gd/r848分散液照射10min适用于肿瘤光热。
54.光热稳定性也是光热性能的主要评价指标之一。通过功率密度为1.5w/cm2的808nmnir光在1h内每隔5min开/关循环照射。由图4c可见，加热-冷却循环过程中温度曲线几乎相似，表明该纳米探针在808nmnir光触发的光热转化中具有良好的稳定性。
55.上述结果证实，btio2@msio2@gd/r848纳米探针具有高效的光热性能，可用于肿瘤细胞的光热。
56.实施例4
57.本实施例对实施例1的btio2@msio2@gd/r848纳米探针的mri性能进行评估。
58.利用0.5t磁共振成像系统分别对合成的btio2@msio2@gd/r848纳米探针及商用mr显像剂magnevist进行扫描得到t1、t2弛豫时间。通过btio2@msio2@gd/r848及magnevist的
弛豫率拟合曲线可见，在同等gd浓度下，如图5a所示，magnevist和btio2@msio2@gd/r848的纵向弛豫率(r1)分别为4.099mm-1
s-1
和6.623mm-1
s-1
，如图5b所示，横向弛豫率(r2)分别为4.284m m-1
s-1
和7.772m m-1
s-1
。
59.与商用magnevist相比，btio2@msio2@gd/r848的r1值约为magnevist的1.8倍，可作为良好的t1对比剂。对不同浓度的btio2@msio2@gd/r848纳米探针进行了t1加权图像扫描如图5c所示。
60.实施例5
61.本实施例利用transwell共培养实验研究纳米探针体外促树突状细胞成熟情况。本实施所用panc02胰腺癌细胞、dc 2.4鼠源树突状细胞均获自中国科学院细胞研究所(中国上海)。
62.在transwell共培养体系的下室中接种dc 2.4细胞，上室接种panc02细胞并分别与dmem培养液、含btio2@msio2@gd的培养液及含btio2@msio2@gd/r848的培养液共孵育4h后，对上室分别进行光照或无光照处理，收集下室中的dc 2.4细胞，经处理后通过流式细胞仪检测树突状细胞的表达情况。
63.利用流式细胞仪分析不同处理后树突状细胞(cd80
+
、cd86
+
)成熟的百分率，结果如图6所示：图中的
“‑”
和“+”分别表示未进行808nm nir光照处理和进行808nm nir光照处理。空白未光照组cd80
+
、cd86
+
体树突状细胞约0.59％；未搭载激动剂r848的btio2@msio2@gd组cd80
+
、cd86+体树突状细胞约17.3％，说明相对于空白未光照组，btio2@msio2@gd具有一定促进树突状细胞成熟作用；而btio2@msio2@gd/r848光照组cd80
+
、cd86
+
体树突状细胞约53.4％，相对于空白未光照组显著促进树突状细胞成熟，而btio2@msio2@gd/r848未光照组cd80
+
、cd86
+
体树突状细胞约48.5％，说明光照处理也能进一步促进树突状细胞成熟。上述实验结果说明说明btio2@msio2@gd/r848纳米探针具有很好的免疫佐剂作用，可促进免疫反应。
64.虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针，其特征在于，所述纳米探针以黑二氧化钛纳米粒子为载体，所述载体表面包裹介孔二氧化硅并偶联磁共振成像对比剂，所述介孔二氧化硅上负载免疫激动剂。2.根据权利要求1所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针，其特征在于，所述磁共振成像对比剂选自以下任意一种：钆塞酸二钠、钆喷酸葡胺、钆双胺和卡地胺钠、钆特酸葡胺、钆特醇。3.根据权利要求1所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针，其特征在于，所述免疫激动剂为toll样受体7/8激动剂r848。4.一种如权利要求1-3任一所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将白二氧化钛纳米粒子还原为黑二氧化钛纳米粒子btio2；s2、在btio2表面包裹介孔二氧化硅，构建btio2@msio2纳米粒子；s3、对btio2@msio2表面进行氨基化修饰，得到btio2@msio
2-nh2；s4、磁共振成像对比剂与btio2@msio
2-nh2发生缩合反应，得到磁共振成像对比剂修饰的纳米粒子btio2@msio2@gd；s5、通过物理吸附负载免疫激动剂，得到黑氧化钛基光热免疫纳米探针。5.根据权利要求4所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中以nabh4为还原剂，还原剂与白二氧化钛纳米粒子的质量比为1:2～1:4。6.根据权利要求4所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中采用teos在碱性条件下水解作为硅源，ctab作为模板剂。7.根据权利要求4所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中用aptes对btio2@msio2表面进行氨基化修饰。8.根据权利要求4所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中用六水合醋酸钆与dota-nhs-ester螯合形成磁共振成像对比剂gd-dota。9.根据权利要求4所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中将btio2@msio2@gd与免疫激动剂以质量比为5:1～10:1+混合在无菌水中，搅拌、离心后得到纳米探针。10.一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针的应用，其特征在于，将如权利要求1-3任一所述的黑氧化钛基光热免疫纳米探针应用于光热-免疫及mri成像一体化试剂盒。

技术总结

本发明公开了一种黑氧化钛基光热免疫纳米探针的制备方法及其应用，该纳米探针以黑二氧化钛纳米粒子为载体，所述载体表面包裹介孔二氧化硅并偶联磁共振成像对比剂，所述介孔二氧化硅上负载免疫激动剂。本发明的纳米探针将光热试剂与免疫激动剂联合，同时连接具有MRI成像功能的磁共振成像对比剂，在MRI成像引导下观察纳米粒子的分布情况，利用光热作用松解胰腺癌基质，促进免疫激动剂的肿瘤渗透，改善胰腺癌免疫抑制微环境，促进树突状细胞的成熟，进一步将光热释放的肿瘤相关抗原递呈给效应T细胞，提高免疫应答水平，由此能够提高胰腺癌的效果。胰腺癌的效果。胰腺癌的效果。