铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用

铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用。

背景技术：

2.目前，碘造影剂主要通过改变肾脏血流动力学和/或直接作用于肾小管上皮细胞导致细胞损伤和死亡，引起肾脏损伤。碘造影剂急性肾损伤(ci-aki)指血管内使用碘造影剂并排除其它原因后出现的急性肾损伤，通常以48小时内血清肌酐值较基础值增加26.5μmol/l或升高至基线值的1.5倍以上或尿量＜0.5ml/(kg
·
h)持续6小时以上作为诊断标准。随着碘造影剂的使用愈加广泛，ci-aki的发病率及致残、致死率在世界范围内呈增长趋势，严重威胁着人们的健康，为家庭和社会带来巨大经济负担。因此，如何防治ci-aki已经成为全球重大的公共卫生问题。
3.铁死亡(ferroptosis)是一种新发现的调节性细胞死亡，其主要特点是细胞内“自由铁”浓度升高，催化甘油三酯中的不饱和脂肪酸残基发生脂质过氧化反应，最终引起细胞死亡。谷胱甘肽过氧化物酶4(简写为gpx4)是铁死亡的中枢抑制因子，其活性依赖于胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白激活产生的谷胱甘肽(简写为gsh)。而gsh的消耗会导致gpx4功能障碍，从而停止将持续产生的过氧化脂质还原为醇，过氧化脂质的累积导致细胞膜损伤或细胞死亡。最近研究表明铁死亡是多种急性肾损伤中重要的细胞死亡形式。
4.ferrostatin-1(简写为fer-1)是目前公认的铁死亡抑制剂。作为含有n环已基的化合物ferrostatin-1与细胞膜磷脂双分子层有较高亲和性，能有效清除长链多不饱和脂肪酸的脂质过氧化。目前ferrostatin-1在防治心脏缺血再灌注损伤、阿霉素所致心肌毒性、金诺芬肝毒性及铁过载疾病已有相关专利。但至今尚无铁死亡及其抑制剂在ci-aki方面作用的报道。

技术实现要素：

5.本发明通过对ci-aki肾小管上皮细胞铁死亡关键性相关蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)、核受体共激活因子4(ncoa4)、铁蛋白重链1(fth1))表达明显降低和肾组织肾小管上皮细胞超微结构改变(线粒体内膜固缩，线粒体嵴数量减少且结构模糊，线粒体膜密度增加，细胞核完整)的研究，证实了ci-aki肾小管上皮细胞铁死亡的发生。因此，本发明目的在于提供一种铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用，具体技术方案如下：
6.铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用。
7.进一步的，在所述应用中，所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1的用量为2.5～5.0mg/kg体重。
8.进一步的，在所述应用中，向腹腔注射所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1。
9.进一步的，在碘造影剂使用前30～60分钟，注射所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1。
10.应用本发明的技术方案，至少具有以下有益效果：
11.本发明通过铁死亡抑制剂ferrostatin-1抑制碘造影剂诱导的铁死亡来改善ci-aki肾功能损伤，缓解肾小管上皮细胞超微结构改变，提高细胞活力。这说明了铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防ci-aki相关疾病方面具有广泛的临床应用价值。
12.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
13.构成本技术的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
14.图1是本发明体内实验中的小鼠血清肌酐水平图；
15.图2是本发明体内实验中的小鼠血清尿素氮水平图；
16.图3是本发明体内实验中的小鼠肾脏病理he染图；
17.其中，在图1-3中出现的“**”表示p《0.01；
18.图4是本发明体内实验中的大鼠血清肌酐水平图i；
19.图5是本发明体内实验中的大鼠血清肌酐水平图ii；
20.图6是本发明体内实验中的大鼠肾小管上皮细胞透射电镜图；
21.其中，在图4-6中出现的“*”表示p《0.05，“**”表示p《0.01，“n.s.”为无明显统计学差异；
22.图7是本发明体外实验中的hk-2细胞活性图；
23.图8是本发明体外实验中的hk-2细胞内铁死亡相关蛋白表达图；
24.图9是本发明体外实验中的hk-2细胞ros水平检测图(图中出现的灰亮点表示荧光点)；
25.其中，在图7-9中出现的“**”表示p《0.01。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.1、材料与方法
28.1.1、体内实验
29.1)实验动物及分组
30.8周龄c57bl/6j雄性小鼠(下文简称小鼠)及250g左右sd雄性大鼠(下文简称大鼠)均购自上海斯莱克实验动物有限公司，中南大学湘雅医学院动物学部spf环境饲养，标准环境(符合昼夜节律)适应性喂养1周。
31.将小鼠随机分为3组，每组4只：
32.a1、对照组；
33.a2、碘海醇组；
34.a3、铁死亡抑制剂干预组(碘海醇+ferrostatin-1)。
35.将大鼠随机分为4组，每组6只：
36.b1、对照组；
37.b2、碘海醇组；
38.b3、碘克沙醇组；
39.b4、铁死亡抑制剂干预组(碘海醇+ferrostatin-1)。
40.2)药物及处理
41.化合物单体ferrostatin-1购自上海selleck公司。动物药物处理：将二甲基亚砜(简写为dmso)溶于玉米油中得到混合溶剂，其中，dmso在混合溶剂中的体积分数为5％。以5mg/kg体重的ferrostatin-1剂量在混合溶剂中充分溶解后，在碘造影剂静脉注射前30分钟腹腔注射。碘造影剂为碘海醇和碘克沙醇，均购自上海通用电气药业。
42.3)碘造影剂急性肾损伤动物模型
43.3.1)小鼠碘造影剂急性肾损伤动物模型：
44.小鼠经麻醉剂(具体为，用量为50mg/kg体重)麻醉，背部皮肤脱毛、碘酊消毒后置于控温操作台；
45.剪开右侧背部皮肤并分离肌肉，暴露并切除右侧肾脏，术后逐层缝合肌肉和皮肤；腹腔注射0.5ml生理盐水补充术中丢失液体量；
46.喂养3周后禁水24小时，后予以尾静脉注射呋塞米(10ml/kg体重)；
47.20分钟后对小鼠尾静脉注射碘海醇(10ml/kg体重)诱导小鼠建立ci-aki动物模型。
48.24h后麻醉小鼠并对小鼠眼球取血，处死小鼠后取肾脏组织。
49.对照组a1：同上述3.1)方法切除右侧肾脏。3周后禁水24小时，后予以尾静脉注射呋塞米(10ml/kg体重)；20分钟后尾静脉注射生理盐水(10ml/kg体重)。
50.3.2)大鼠碘造影剂急性肾损伤动物模型：
51.将大鼠适应性喂养一周，同3.1)中大鼠麻醉后进行内眦静脉采血；
52.对大鼠禁水48小时后，予以尾静脉注射呋塞米(10ml/kg体重)；
53.30分钟后对大鼠尾静脉注射15ml/kg体重碘海醇或15ml/kg体重碘克沙醇诱导大鼠建立ci-aki动物模型。
54.24h后对大鼠麻醉后腹主动脉取血，处死大鼠后取肾脏组织。
55.对照组b1：同上述3.2)方法及剂量对大鼠予以禁水和注射呋塞米，30分钟后尾静脉注射生理盐水(15ml/kg体重)。
56.4)急性肾损伤评估：
57.4.1)收集小鼠和大鼠的血清，采用肌酐、尿素氮检测试剂盒(bioassaysys,usa)检测血清中肌酐和尿素氮的水平；
58.4.2)收集肾组织，用4％多聚甲醛固定后，对肾组织样本进行常规处理，并用石蜡包被；对肾组织石蜡切片进行常规he染，分析肾组织形态、肾小管损伤与坏死，采用半定量分析评估肾组织损伤。
59.4.3)透射电镜观察：
60.4.3.1透射电子显微镜肾脏组织取材方法
61.先从大鼠肾脏上极剪下一块尽量小的组织，在预置室温2.5％戊二醛的塑料板上使用双面刀片将该组织切成1条长条，组织厚度≤1mm，直接切成多片1
×
1mm的小方块，然后再投入盛有4℃2.5％戊二醛的ep管中继续4℃固定4～24小时后送电镜室。
62.4.3.2透射电子显微镜肾脏组织片制作方法
63.(1)0.1mol/lpbs漂洗，10min
×
2次.
64.(2)固定：2.5％戊二醛中将肾右下级组织固定2小时或更长时间，然后用0.1m磷酸漂洗液漂洗15min
×
3次；1％锇酸固定液固定1～2小时后用0.1m磷酸漂洗液漂洗15min
×
3次；
65.(3)丙酮逐步脱水：50％丙酮10-15分钟，70％丙酮10-15分钟，90％丙酮10-15分钟，100％丙酮15～20分钟，中间更换一次；
66.(4)浸泡与包埋：浸泡于纯丙酮+包埋液(1：1比例混合)37℃12小时，再浸泡于纯包埋液中37℃10～12小时；
67.(5)固化：37℃烘箱内过夜，60℃烘箱内12～24小时；
68.(6)超薄切片机切片50-100nm；
69.(7)3％醋酸铀及硝酸铅双染；
70.(8)日立h7700透射电镜观察ci-aki大鼠肾小管上皮细胞线粒体形态与超微结构，并拍片。
71.1.2、体外实验
72.1)药物及处理
73.化合物单体ferrostatin-1和erastin购自上海selleck公司。细胞药物处理：将ferrostatin-1和erastin分别溶于dmso中，其中，ferrostatin-1对应的母液浓度为1mmol/l，erastin对应的母液浓度为10mmol/l。将上述母液分别溶于完全培养基中稀释1000倍，得到1μmol/l的ferrostatin-1稀释液和10μmol/l的erastin稀释液；其中，在造影剂(具体为200mg i/ml)干预前1小时将细胞完全培养基替换为含1μmol/l的ferrostatin-1和10μmol/l的erastin的完全培养基进行预处理。完全培养基为含10％体积分数胎牛血清和5mm低葡萄糖的dmem-f12的培养液
74.2)碘造影剂诱导的细胞损伤模型建立及分组
75.以人肾小管上皮细胞株(简写为hk-2细胞)(来源于发明人实验室)作为体外研究细胞模型，其中，hk-2细胞按常规方法传代，培养，具体如下：
76.hk-2细胞培养在完全培养基中，放置在培养箱中培养，该培养箱采用的培养条件为37℃、5％体积分数co2和饱和湿度条件下培养。
77.待细胞贴壁后，分别取等量的hk-2细胞按以下分组进行处理：
78.c1、对照组：等剂量培养液进行处理；
79.c2、碘造影剂组：用200mg i/ml碘海醇处理hk-2细胞6小时：
80.c3、铁死亡抑制剂干预组：在加入碘造影剂前1小时用1μmol/lferrostatin-1对hk-2细胞进行处理；
81.c4、erastin组：10μmol/l erastin处理hk-2细胞。
82.细胞计数试剂(cell counting kit-8，简写cck-8)：上述分组处理的hk-2细胞通过cck-8比法检测细胞活力，cck-8试剂盒购自上海碧云天(c0038)。
83.ros水平检测：在对hk-2细胞培养及处理后，采用dcfh(invitrogen-molecular probes)探针，按说明书方法进行活细胞染，用荧光显微镜下观察荧光着和形态。
84.总蛋白提取及western blot检测：采用经典ripabuffer(sigma)方法提取细胞总蛋白，并用bca试剂盒检测蛋白浓度。将总蛋白加至sds-page胶，转膜，封闭，加gpx4(1:5000)、fth1(1:1000)、ncoa4(1:1000)一抗，4℃过夜，pbst漂洗，加入相应二抗，用amersham eclwesternblot system进行检测。
85.2、实验结果：
86.2.1、体内实验：
87.参见图1-2，与对照组a1相比，碘海醇组a2中的血清肌酐及尿素氮水平显著升高；与碘海醇组a2相比，铁死亡抑制剂干预组a3中使用ferrostatin-1后血清肌酐水平明显降低；
88.参见图3，与对照组a1相比，碘海醇组a2中的小鼠肾小管上皮细胞出现大量空泡变性；与碘海醇组a2相比，铁死亡抑制剂干预组a3中的小鼠肾小管上皮细胞空泡变性数目明显减少，即肾小管损伤分数显著降低，证实了ferrostatin-1的使用可以明显改善ci-aki小鼠肾损伤。
89.参见图4，与基线肌酐值比较，碘海醇组b2中的大鼠血清肌酐水平显著升高，碘克沙醇组b3中的血清肌酐水平无明显升高；
90.参见图5，与基线肌酐值比较，铁死亡抑制剂干预组b4中的大鼠血清肌酐水平明显低于碘海醇组b2；
91.参见图6，与对照组b1相比，碘海醇组b2中的大鼠肾小管上皮细胞内的线粒体内膜固缩，线粒体嵴数量减少且结构模糊，线粒体膜密度增加，细胞核完整；与碘海醇组b2相比，铁死亡抑制剂干预组b4可减轻上述超微结构改变。
92.2.2、体外实验：
93.参见图7，采用cck-8检测细胞活力，结果发现碘造影剂组c2处理后hk-2细胞活力下降，而铁死亡抑制剂干预组c3处理后hk-2细胞活力上调，证明hk-2细胞受损伤程度降低；
94.参见图8(图8中gapdh表示内参)，采用western blot检测铁死亡相关蛋白(gpx4、ncoa4和fth1)表达，结果发现在碘造影剂组c2，碘海醇处理后hk-2细胞中上述蛋白水平明显下降；
95.参见图9，采用dcfh染检测hk-2细胞内ros水平，结果显示：在碘造影剂组c2，碘海醇处理后hk-2细胞内ros水平升高，产生了相似于erastin组c4诱导hk-2细胞铁死亡的效果，而铁死亡抑制剂干预组c3处理后hk-2细胞明显降低ros水平，说明了铁死亡抑制剂可有效降低碘海醇诱导的ros水平。
96.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用。2.根据权利要求1所述的铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用，其特征在于，在所述应用中，所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1的用量为2.5～5.0mg/kg体重。3.根据权利要求2所述的铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用，其特征在于，在所述应用中，向腹腔注射所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1。4.根据权利要求3所述的铁死亡抑制剂ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用，其特征在于，在碘造影剂使用前30～60分钟，注射所述铁死亡抑制剂ferrostatin-1。

技术总结

本发明提供了铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤中的应用。所述铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的用量为2.5～5.0mg/kg体重。本发明通过铁死亡抑制剂Ferrostatin-1抑制碘造影剂诱导的铁死亡来改善碘造影剂急性肾功能损伤，缓解肾小管上皮细胞超微结构改变，提高细胞活力。这说明了铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在预防碘造影剂急性肾损伤相关疾病方面具有广泛的临床应用价值。疾病方面具有广泛的临床应用价值。疾病方面具有广泛的临床应用价值。