溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用

1.本发明属于医药领域，特别是溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用。

背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是老年人痴呆症的最常见原因，以进行性记忆丧失、判断力受损、认知功能障碍和行为改变为主要病理表现，这些临床症状可能是由于神经元和突触的大量缺失导致海马和皮质严重萎缩引起的。其典型病理特征为细胞内磷酸化tau蛋白聚集形成神经纤维缠结，细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid-beta，aβ)沉积。aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，app)经水解产生的长度为38-43个氨基酸的疏水性产物，aβ沉积的发生早于其他临床病理表现，且会诱发或加剧疾病进程。
3.衰老是散发性ad的首要风险因素，85岁以上的老年人中约三分之一患有ad，目前全球ad患者超5200万，我国有1000万ad患者，随着人口老龄化的加重，预计到2050年全球ad患者数将达到1.15亿，我国的ad患者数将达到2800万。而现有的ad手段尚不能治愈或有效的控制病情发展，随着患者年龄增长，伴发复杂的年龄相关性并发症，增加了疾病的难度，造成沉重的社会负担和经济负担。
4.ad神经退行性过程的关键标志之一是aβ的产生、寡聚化和沉积，迄今为止，针对aβ代谢过程设计过多种旨在抑制或清除aβ沉积的方案，发明了多种小分子、多肽、抗体等不同类型的抑制剂，但是目前还少见对aβ沉积有良好效果的临床药物。
5.研究表明高脂血症和脑内一些脂质水平的改变是ad的危险因素，ad的典型病理特征aβ和tau蛋白沉积都与脂质失调相关。一项临床样本的血清脂质组学研究发现ad患者较认知正常的老年人血清中的磷脂类物质水平降低，利用ad模型小鼠-5
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fad转基因小鼠进行血清代谢组学分析，也发现转基因小鼠较野生型小鼠血清中磷脂类物质降低明显，其中溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,lpc)的变化引起了我们的注意，我们发现早在5
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fad小鼠脑内出现aβ沉积(2月龄)之前，血清中lpc就已经发生明显降低，并且这种改变在疾病不同阶段始终保持一致。因此我们应用lpc小分子制剂，对5
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fad转基因小鼠进行腹腔注射，惊喜地发现补充lpc可以有效减少小鼠脑内aβ沉积。

技术实现要素：

6.本发明的目的是提供溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，要解决的技术问题是如何有效抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β-淀粉样蛋白沉积，有效改善模型动物的学习记忆能力。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案；
8.本发明提供溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，用于阿尔茨海默病的溶血磷脂酰胆碱的结构式如下所示：
[0009][0010]
作为优选方案，其特征在于，甘油磷脂的磷酸端形成酰基(rco-，acyl group)，酰基结合胆碱，形成磷脂酰胆碱，在磷脂酶的作用下，减少磷脂酰胆碱的一个脂肪酸，形成溶血磷脂酰胆碱。
[0011]
本技术中所使用的溶血磷脂酰胆碱注射方式为腹腔注射，纯度≥99％。
[0012]
作为优选方案，溶血磷脂酰胆碱可制备成食品或者饮品或者药品或者保健品。
[0013]
作为优选方案，溶血磷脂酰胆碱制备成药品的剂型为颗粒剂或者胶囊剂或者片剂或者粉末剂或者口服液或者混悬液或者乳剂。
[0014]
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果。
[0015]
本发明溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，经过发明人的多次实验发现，当对模型动物腹腔注射剂量低于60μmol的溶血磷脂酰胆碱时，红细胞的数目无明显改变提示该剂量的溶血磷脂酰胆碱不表现出破坏红细胞膜的毒理作用，可见本发明所使用的溶血磷脂酰胆碱浓度安全、可长期服用。
[0016]
溶血磷脂酰胆碱可明显减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑皮层、白质区内、海马下托区的aβ沉积和扩散，保护神经元数目，增强突触传递功能和突触可塑性。同时促进少突胶质细胞成熟并发挥功能，减少髓鞘损伤，促进髓鞘修复，辅助神经元功能的正常发挥。此外通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、增生和沉积，改善脑部中枢的炎症状态和胶质增生等病理表型。极大的改善机体学习记忆及认知能力，从而阿尔茨海默病。
[0017]
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的主要目的和其它优点可通过在说明书中所特别指出的方案来实现和获得。
附图说明
[0018]
图1为实验1中对照组和实验组小鼠红细胞数值变化结果。
[0019]
图2a为实验2通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0020]
图2b为实验2通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0021]
图3为图2a中方框区域的局部放大图。
[0022]
图4为图2b中方框区域的局部放大图。
[0023]
图5a为实验3通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0024]
图5b为实验3通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0025]
图6为图5a中方框区域的局部放大图。
[0026]
图7为图5b中方框区域的局部放大图。
[0027]
图8a为实验4通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0028]
图8b为实验4通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0029]
图9为图8a中方框区域的局部放大图。
[0030]
图10为图8b中方框区域的局部放大图。
[0031]
图11a为实验5通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0032]
图11b为实验5通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0033]
图12为图11a中方框区域的局部放大图。
[0034]
图13为图11b中方框区域的局部放大图。
[0035]
图14a为实验6通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0036]
图14b为实验6通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0037]
图15为图14a中方框区域的局部放大图。
[0038]
图16为图14b中方框区域的局部放大图。
[0039]
图17a为实验7通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的对照组示意图。
[0040]
图17b为实验7通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况的回补lpc的实验组示意图。
[0041]
图18为图17a中方框区域的局部放大图。
[0042]
图19为图17b中方框区域的局部放大图。
[0043]
图20为实验8不锈钢圆形水池中四个象限及圆柱平台的位置关系示意图。
[0044]
图21为实验8小鼠水迷宫行为学实验结果。
[0045]
图22为实验9通过免疫荧光染观察小鼠脑内海马下托区aβ沉积周围的neun阳性的神经元数目示意图。
[0046]
图23为实验10通过电镜制样后用透射电子显微镜显示的突触结构及突触结构的信号传递示意图。
[0047]
图24a、图24b、图24c、图24d分别为实验11中ng2和cc1的免疫荧光实验结果和实时荧光定量pcr实验统计结果。
[0048]
图25a和图25b分别为实验12中髓鞘的透射电镜结果示意图和小鼠脑内髓鞘厚度的g-ratio统计结果。
[0049]
图26为实验13通过免疫荧光染观察小鼠脑内离子钙结合衔接分子1阳性的小胶质细胞的形态和数目示意图。
[0050]
图27为实验14通过免疫荧光染观察小鼠脑内胶质纤维酸性蛋白的数目变化示意图。
具体实施方式
[0051]
下面结合具体实验对本发明进行详细说明。以下实验将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保
护范围。
[0052]
本技术每个实验中实验组和对照组均采用一种阿尔茨海默病模型小鼠—5
×
fad小鼠，5
×
fad小鼠购自jackson转基因小鼠保藏中心后在spf级环境中繁育；饲养温度20-24℃，按月龄、周龄、日龄环境湿度50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食和饮水。
[0053]
野生对照组则选择与其对应周龄的或同窝野生小鼠。
[0054]
下述实验中：wt表示注射pbs的野生型小鼠，tg表示注射pbs的转基因小鼠，tg lpc treated表示注射lpc的转基因小鼠。
[0055]
第一部分：溶血磷脂酰胆碱的毒性实验
[0056]
实验1：溶血磷脂酰胆碱对小鼠红细胞数值的影响
[0057]
选择5月龄转基因小鼠共6只随机分为两组即实验组(tg lpc treated)和对照组(tg)，每组3只；实验组每次腹腔注射10、20、40、60μmol溶血磷脂酰胆碱，每周注射3次，持续4周，对照组每次注射相同体积的pbs。
[0058]
在最后一次注射后一天，取血通过血常规检测红细胞计数，取平均值，最终红细胞变化结果如图1所示。
[0059]
从图1可以看出实验组(tg lpc treated)和对照组(tg)中红细胞计数变化不大，可见，腹腔注射上述剂量的溶血磷脂酰胆碱都不表现出破坏红细胞膜的毒理作用。结合文献报道，后续实验2～实验10均采取20μmol浓度进行试验。
[0060]
第二部分：溶血磷脂酰胆碱对小鼠脑内aβ沉积的影响
[0061]
实验2：溶血磷脂酰胆碱对幼年雄性小鼠脑内aβ沉积的影响
[0062]
选择25日龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，共两组分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周至雄性5
×
fad转基因小鼠到2月龄。
[0063]
末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图2a和图2b所示。
[0064]
图2acontrol为对照组，图2b lpc treated为回补lpc的实验组，图3为图2a中方框区域的局部放大图，图4为图2a中方框区域的局部放大图。可见，早期补充lpc后，实验组2月龄小鼠海马下托区aβ斑块数量显著减少，斑块荧光强度也明显降低，且与对照组相比皮层内几乎没有aβ沉积。可看出从25日龄雄性5
×
fad转基因小鼠生命早期阶段开始补充体内lpc可以有效抑制aβ沉积的生成和扩散。
[0065]
实验3：溶血磷脂酰胆碱对成年雄性小鼠脑内aβ沉积的影响
[0066]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0067]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图5a和图5b所示。
[0068]
图5a control为对照组，图5b lpc treated为回补lpc的实验组；图6为图5a中方框区域的局部放大图，图7为图5b中方框区域的局部放大图。可见，补充lpc后，小鼠大脑皮层和白质区内的aβ沉积明显减少，海马下托区的aβ斑块数量和沉积面积也明显减少，并且
能够抑制aβ从海马下托区向皮层的扩散。实验4：溶血磷脂酰胆碱对老年(6月龄)雄性小鼠脑内aβ沉积的影响
[0069]
选择4.5月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续6周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续6周。
[0070]
在小鼠6月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图8a和图8b所示。
[0071]
图8a control为对照组，图8b lpc treated为回补lpc的实验组，图9为图8a中方框区域的局部放大图，图10为图8b中方框区域的局部放大图。可见，与对照组相比，实验组小鼠大脑海马下托区的aβ沉积数量显著减少，大脑皮层区和海马ca区aβ斑块数量也明显减少。
[0072]
实验5：溶血磷脂酰胆碱对老年(12月龄)雄性小鼠脑内aβ沉积的影响
[0073]
采用11月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续6周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续6周。
[0074]
在小鼠12月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图11a和图11b所示。
[0075]
图11a control为对照组，图11b lpc treated为回补lpc的实验组，图12为图11a中方框区域的局部放大图，图13为图11b中方框区域的局部放大图。可见，与对照组相比，实验组小鼠大脑海马区域内aβ斑块的数量、大小、总沉积面积都明显减少，大脑皮层区和白质区aβ沉积数量也减少。
[0076]
实验6：溶血磷脂酰胆碱对小鼠脑内aβ沉积的长期影响
[0077]
采用2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，持续4个月，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4个月。
[0078]
末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图14a和图14b所示。
[0079]
图14a control为对照组，图14b lpc treated为回补lpc的实验组，图15为图14a中方框区域的局部放大图，图16为图14b中方框区域的局部放大图。可见，普通6月龄小鼠脑内有很多aβ沉积，而从2月龄脑内刚刚出现aβ沉积的阶段就开始持续补充lpc，实验组海马区和大脑皮层内的aβ沉积与同月龄转基因小鼠相比减少非常明显，甚至能恢复到与3月龄5
×
fad小鼠脑内aβ沉积情况相近的程度。这一结果提示lpc使用安全性高，且从疾病早期阶段开始持续使用，能够有效抑制aβ沉积的生成和扩散，从而抑制ad疾病的发展和恶化。
[0080]
实验7：溶血磷脂酰胆碱对成年雌性小鼠脑内aβ沉积的影响
[0081]
选择2月龄雌性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0082]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内的aβ沉积情况，具体如图17a和图17b所示。
[0083]
图17a control为对照组，图17b lpc treated为回补lpc的实验组，图18为图17a中方框区域的局部放大图，图19为图18b中方框区域的局部放大图。可见，对照组雌鼠海马下托区aβ斑块面积大，沉积数量多，而给予lpc腹腔注射回补后，海马下托区内aβ斑块显著减少。lpc对于雌性小鼠同样具有减少脑内aβ沉积的作用。
[0084]
从实验2和实验6可以看出不管是25日龄雄性5
×
fad转基因小鼠还是8周龄雌性5
×
fad转基因小鼠，在早期分别是25日和2月龄刚刚出现aβ沉积的阶段就开始持续补充lpc，不管是雌性还是雄性5
×
fad转基因小鼠，从疾病早期阶段开始持续补充lpc，能够有效抑制aβ沉积的生成和扩散，从而抑制ad疾病的发展和恶化；特别是实验7还证明了lpc使用的安全性。
[0085]
从实验3-5和实验7可以看出注射了lpc的不同日龄、周龄或月龄的小鼠，其相对对照组小鼠大脑皮层和白质区内的aβ沉积明显减少，海马下托区的aβ斑块数量、大小和总沉积面积也明显减少，并且能够抑制aβ从海马下托区向皮层的扩散。大脑皮层区和海马ca区aβ斑块数量也明显减少。
[0086]
由此可见，注射lpc后的5
×
fad转基因小鼠其可明显减少小鼠大脑皮层、白质区内、海马下托区的aβ沉积和扩散，抑制ad疾病的发展和恶化。
[0087]
第三部分：溶血磷脂酰胆碱对小鼠认知的影响
[0088]
实验8：溶血磷脂酰胆碱对老年雄性小鼠认知的影响
[0089]
选择4.5月龄雄性5
×
fad转基因小鼠16只，每8只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，同时选取同窝野生型小鼠8只作为野生型对照。实验组按实验1中药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续6周，对照组和野生型对照组小鼠腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续6周。
[0090]
待小鼠到6月龄，进行水迷宫实验，以评估小鼠学习记忆能力。
[0091]
如图20所示，水迷宫为一直径1.2m、高0.5m、深0.3m的不锈钢圆形水池，水迷宫上target象限内设置有圆柱平台；利用计算机摄像系统自动监测小鼠在水池中的游泳情况，并通过软件分析获取实验数据。
[0092]
测试连续6天，前5天为训练阶段，在水池的target象限内放入直径9cm的圆柱平台，隐匿在水面下1cm，并在池水中添加钛白粉，使水呈乳白，使动物无法通过视觉辨认池内圆柱平台的位置，并控制池内水温为25-27℃，选择图20中opposite象限作为入水点。
[0093]
训练阶段每天训练3次，从入水点将小鼠面朝池壁放入池水，记录90s内小鼠从入水点到爬上圆柱平台所用的时间为逃避潜伏期。若小鼠在90s内未能到圆柱平台，则引导其至圆柱平台放置15s，引导其学习和记忆，此时逃避潜伏期记为90s。
[0094]
第6天为测试阶段，撤去水面下的圆柱平台，将小鼠从入水点面朝墙壁放入后，记录小鼠90s内在各个象限停留的时间，以及穿越圆柱平台所在位置的次数。
[0095]
图21为水迷宫结果统计图，左侧是测试阶段小鼠在四个象限停留的时间(mean
±
sem，每组n＝7-8，统计方法为two way anova(双因素方差分析)，*p《0.05)；右侧是测试阶段小鼠穿越圆柱平台所在位置的次数(mean
±
sem，每组n＝7-8，统计方法为one way anova(单因素方差分析)，**p《0.01，)。其中n表示样本数量。
[0096]
如图21所示，野生型小鼠具有正常的学习记忆能力，经过5天学习之后记住了圆柱平台所在方位，测试阶段会花费更多的时间搜寻圆柱平台所在象限，因此穿越圆柱平台所
在位置的次数更多；转基因小鼠学习记忆能力受损，经过5天的训练并没有记住圆柱平台所在方位，或者记忆能力出现偏差，导致测试阶段在目标象限停留的时间明显缩短，穿越圆柱平台所在位置的次数明显减少。
[0097]
从图21可以看出，给予lpc注射的实验组小鼠在测试阶段出现在目标象限的时间与野生型对照组小鼠相近，明显长于对照组小鼠，穿越圆柱平台所在位置的次数较转基因对照组小鼠比也明显增加；最终穿越圆柱平台次数为实验组≈野生小鼠＞对照组。可见，注射lpc对于阿尔茨海默症的学习记忆及认知能力受损疗效显著。
[0098]
实验9：溶血磷脂酰胆碱恢复神经元数目
[0099]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选3只月龄匹配的野生型小鼠作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0100]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内特别是海马下托区神经元的数目，利用神经元细胞核抗体neun对神经元进行标记。具体如图22所示。
[0101]
图22免疫荧光图展示了野生型对照小鼠(wt)，转基因对照小鼠(tg)和lpc注射的转基因小鼠(tg lpc treated)海马下托区aβ沉积周围的neun阳性的神经元数目。绿荧光表示aβ，红荧光表示neun，蓝表示dapi着的细胞核。
[0102]
如图22所示，wt小鼠脑内无aβ沉积，neun阳性的神经元数量多且分布均匀；tg小鼠脑内aβ沉积多，在aβ周围，神经元被破坏，数量明显减少；而经过lpc注射后，aβ沉积减少，对神经元的损伤减小，海马下托区神经元的数目恢复。可见，lpc对于阿尔茨海默症的神经元数目的恢复疗效显著。
[0103]
实验10：溶血磷脂酰胆碱改善突触功能
[0104]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选3只月龄匹配的野生型小鼠作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0105]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，通过电镜制样后用透射电子显微镜观察突触结构。具体如图23所示。
[0106]
图23透射电镜图展示了三组小鼠海马区的突触结构，突触结构由突触前膜，突触间隙和突触后膜构成，突触前膜的囊泡中包含多种神经递质，突触囊泡被突触前膜释放进行突触间的信号传递，突触前可被释放的囊泡聚集在突触前膜，形成可释放囊泡池，图23中绿虚线圈出的部分是可释放囊泡池，其面积反应突触功能。突触后致密斑的厚度与突触可塑性相关，图23中黄箭头为突触后致密斑。
[0107]
如图23所示，与野生型小鼠相比，转基因小鼠突触前膜的可释放囊泡池面积显著缩小，突触后致密斑厚度明显降低，提示转基因小鼠的突触功能障碍，lpc注射后的实验组，可释放囊泡池面积恢复，突触后致密斑厚度增加，突触传递信号的功能恢复，突触可塑性恢复。
[0108]
实验11：溶血磷脂酰胆碱促进少突胶质细胞成熟
[0109]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选月龄匹配的野生型小鼠3只作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0110]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内与少突胶质细胞成熟性相关的cc1(可用于标志成熟少突胶质细胞)和神经胶质抗原2(neural glial antigen 2,ng2)蛋白的表达情况，具体如图24a、图24b、图24c和图24d所示。
[0111]
图24a免疫荧光实验结果展示了cc1和ng2蛋白的表达情况，cc1在成熟少突胶质细胞中表达，ng2在未成熟的少突胶质细胞前体细胞中表达。图24b是cc1的免疫荧光统计结果，n＝4(切片数)/3(小鼠)。图24c是ng2的免疫荧光统计结果，n＝4(切片数)/3(小鼠)。图24d是rt-qpcr结果展示了mbp基因在野生对照组小鼠、对照组小鼠和实验组小鼠海马内的表达情况，每组n＝3，表示3个独立的生物样本重复。(mean
±
sem，统计方法为one way anova，*p《0.05，**p《0.01)。
[0112]
如图24a、图24b、图24c和图24d所示，通过免疫荧光染观察了lpc对少突胶质细胞成熟性的影响。与野生对照组小鼠相比，对照组小鼠脑内成熟的少突胶质细胞数量明显减少，而经lpc注射的实验组小鼠可以有效地促进少突胶质细胞成熟，而表达ng2蛋白的少突胶质细胞前体细胞在三组之间变化不明显。可见，lpc主要发挥促进少突胶质细胞成熟的作用。
[0113]
进一步，如图24d所示，通过实时荧光定量pcr(real time quantitative pcr,rt-qpcr)方法可检测出小鼠海马内髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,mbp)基因的表达，mbp可以作为成熟少突胶质细胞发挥功能的指标。对照组小鼠(tg)与野生对照组(wt)小鼠相比mbp的表达明显下调，当给予lpc注射时，实验组(tg lpc treated)的mbp表达恢复。可见，lpc注射可以促进少突胶质细胞成熟并发挥功能。
[0114]
实验12：溶血磷脂酰胆碱恢复损伤的髓鞘结构
[0115]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选3只月龄匹配的野生型小鼠作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0116]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，通过电镜制样后用透射电子显微镜观察髓鞘结构，并利用image j软件统计髓鞘厚度，测量轴突直径除以包含板层结构的髓鞘直径，计算g-ratio值，通过g-ratio反应髓鞘厚度。
[0117]
如图25a所示，利用透射电镜观察海马区髓鞘结构，发现野生对照组小鼠髓鞘板层结构致密，对照组小鼠髓鞘结构松散，板层间出现崩解或空泡状凸出形态；当给予lpc注射时，髓鞘的板层结构恢复致密。图25b统计髓鞘厚度，发现转基因小鼠g-ratio值增大，提示髓鞘变薄，实验组小鼠腹腔注射lpc后髓鞘厚度增厚。可见，lpc具有恢复髓鞘形态和结构的作用。
[0118]
图25a是透射电镜结果展示了野生对照组小鼠和对照组小鼠以及实验组小鼠的髓鞘结构示意图。
[0119]
图25b是髓鞘厚度的g-ratio统计，对照组野生型小鼠n＝100(轴突)/3(小鼠)，对照组转基因小鼠n＝118(轴突)/3(小鼠)，lpc注射的实验组转基因小鼠n＝101(轴突)/3(小鼠)。(mean
±
sem，统计方法为one way anova(单因素方差分析)，*p《0.05，****p《0.0001)。
[0120]
实验13：溶血磷脂酰胆碱减轻小胶质细胞相关的炎症反应
[0121]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选3只月龄匹配的野生型小鼠作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0122]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,iba1)阳性的小胶质细胞的形态和数目，具体如图26所示。
[0123]
图26为免疫荧光图，可看出海马下托区aβ沉积周围的iba1阳性的小胶质细胞的形态和数目，aβ用红荧光展示，iba1用绿荧光展示，蓝表示dapi着的细胞核。
[0124]
如图26所示，在转基因小鼠脑内aβ沉积处周围的iba1阳性小胶质细胞较野生对照组的数目明显增多，且细胞形态呈激活状态，突起增多并延长，说明此时中枢神经系统处于炎症状态。
[0125]
当lpc注射后，aβ斑块体积减小，数量减少，周围的小胶质细胞数目显著减少，激活状态减弱，lpc可以缓解中枢神经系统的炎症反应。
[0126]
实验14：溶血磷脂酰胆碱缓解中枢神经系统的胶质增生
[0127]
选择2月龄雄性5
×
fad转基因小鼠6只，每3只为一组，随机分组，分为实验组和对照组，另选3只月龄匹配的野生型小鼠作为野生对照。野生型小鼠腹腔注射pbs作为野生对照，实验组按实验1中药物浓度药物剂量进行腹腔注射，每周3次，连续4周，同时对照组腹腔注射同等剂量的pbs，每周3次，持续4周。
[0128]
在小鼠3月龄时，末次给药后灌注取脑，做冰冻切片，通过免疫荧光染观察小鼠脑内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,gfap)的数目，反应中枢胶质增生情况。具体如图27所示。
[0129]
图27为免疫荧光图，展示的是野生型对照组(wt)，转基因对照组(tg)和lpc注射的实验组小鼠(tg lpc treated)海马下托区gfap阳性的星形胶质细胞数目。gfap用绿荧光展示。
[0130]
如图27所示，转基因小鼠脑内gfap阳性的星形胶质细胞数目显著增加，反应此时中枢神经系统处于胶质增生的病理状态，lpc注射后的实验组，星形胶质细胞沉积的数目明显减少，表明lpc可以有效改善胶质增生。
[0131]
综上所述，从实验8的结果可以看出，注射lpc对于阿尔茨海默症的学习记忆及认知能力受损疗效显著。从实验9至实验14的实验结果可以看出溶血磷脂酰胆碱可以同时影响神经元和胶质细胞从而改善ad相关的病理表征，对神经元的影响具体表现为保护神经元数目，增强突触传递功能和突触可塑性，此外还可以通过促进少突胶质细胞成熟并发挥功能，形成包裹在神经元轴突外的髓鞘结构，辅助神经元功能的正常发挥。对另两种导致胶质增生的胶质细胞，即小胶质细胞和星形胶质细胞的作用表现为减少胶质细胞的激活、增生和沉积，减轻中枢的炎症状态和胶质增生病理表征。
[0132]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：

1.溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，其特征在于，用于阿尔茨海默病的溶血磷脂酰胆碱的结构式如下所示：2.如权利要求1所述的溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，其特征在于，溶血磷脂酰胆碱的纯度≥99％。3.如权利要求2所述的溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，其特征在于，溶血磷脂酰胆碱可制备成食品或者饮品或者药品或者保健品。4.如权利要求3所述的溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，其特征在于，溶血磷脂酰胆碱制备成药品的剂型为颗粒剂或者胶囊剂或者片剂或者粉末剂或者口服液或者混悬液或者乳剂。

技术总结

本发明公开了溶血磷脂酰胆碱在阿尔茨海默病中的应用，补充低剂量的溶血磷脂酰胆碱可用于阿尔茨海默病；本发明可有效抑制阿尔茨海默病模型动物大脑中的β-淀粉样蛋白沉积，保护神经元数目，增强突触传递功能和突触可塑性。同时促进少突胶质细胞成熟并发挥功能，减少髓鞘损伤，促进髓鞘修复，辅助神经元功能的正常发挥。此外通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、增生和沉积，改善脑部中枢的炎症状态和胶质增生等病理表型。从而有效改善模型动物的学习记忆能力。模型动物的学习记忆能力。模型动物的学习记忆能力。