一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法

1.本发明属于植物抗病性鉴定评价和资源筛选技术领域，具体涉及一种快速鉴定生防菌株对梨病防治效果的方法。

背景技术：

2.据了解，菌是植物病原真菌中最常见、最重要的属之一，几乎全世界种植的每一种作物都易受一种或多种菌的影响。梨树病，又称苦腐病，主要危害梨树的叶片和果实，初期叶片、果实表面出现一至多个“小黑点”，后逐渐变大，呈现出圆形或不规则形的轮纹状或凹陷状病斑。我国梨病的病原有12种，且研究发现引起病的病原种类在不同地理来源、梨系统和梨组织上组成不同，其中c.fructicola为优势种。病在2007年以前并不算是我国梨产区的主要病害，2008年在中国安徽省砀山县发生严重，造成约1.5亿美元的经济损失，与此同时，由于对于病防治方法的缺失，上十万亩的梨树因此被砍伐。进一步了解后发现近几年在江西、浙江、安徽、江苏、福建等省份发生的南方砂梨早期落叶也是因为病菌而造成。
3.现在世界上针对水果苦腐病最常见和最有效的策略是大量使用化学杀菌剂，最常用的化学类别是醌类外部抑制剂(qoi)和苯并咪唑类(mbcs)。但是滥用化学药剂在导致抗药性菌株发展的同时也会对自然以及人类健康产生负面影响。它们的广泛和密集使用会导致抗药性菌株的发展，并对空气、土壤和水质以及人类健康产生负面影响。如今人们愈发的注重环境保护以及果品农药残的问题，因此，生物防治作为一个环境友好型的防治方法，已成为化学用途的替代品，并已成功应用于收获后的各种水果。生物防治手段防治手段主要包括利用寄生性天敌防治、利用捕食性天敌防治、利用微生物防治。在针对植物病害发生的主要手段是利用微生物防治，通过筛选可以拮抗病原菌生长的细菌、真菌、放线菌等。
4.采用微生物防治的手段中，具有生防作用的芽孢杆菌占有重要位置，因为多种作用模式和抗应激孢子的形成，增强了它们在不同环境条件下的生存能力，同时芽孢杆菌具有抑菌谱广、安全性高等优点，生防芽孢杆菌被广泛应用到农业生产中。对梨树病的微生物研究中，刘邮洲等发现生防菌sf 628对梨病有较好的防治效果；钱鑫蕾等发现甲基型芽孢杆菌可以抑制梨树胶孢病病原菌菌丝生长和孢子萌发；赵阳等通过比较四种溶杆菌菌株，包括产酶溶杆菌oh11、抗生物溶杆菌oh13、胶溶杆菌oh17和布鲁内森溶杆菌oh23，证明其对菌系列病原体的拮抗作用；李朝辉等发现奥托威类芽胞杆菌cl01对梨果实菌的菌丝生长和分生孢子萌发具有较强的抑制作用。芽孢杆菌的种类众多，通过分离不同果园的样本可以筛选到很多有效菌株，同时一种拮抗细菌可以同时对多种病害的病原菌有抑制效果。
5.然而目前针对梨树病生物防治菌功能验证的方法较为单一，缺乏系统验证生防菌株对梨病的防治效果的方法。

技术实现要素：

6.本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种快速验证生防菌株对梨病防治效果的方法，该方法操作简单、成本低、速度快、准确性高和适宜梨树病生物防治菌的功能鉴定。
7.本发明提供了一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.步骤1、生防菌的鉴定——通过提取生防菌株的16srdna序列，采用细菌的16s区通用引物27f/1492r进行16s rdna序列扩增，并将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析；
9.步骤2、平板对峙试验——制备拮抗菌菌饼和菌菌饼，将菌菌饼和拮抗菌菌饼分别对称贴于距pda培养基边缘2cm处，恒温培养，以贴有菌饼和浸泡无菌水的pda块设为空白对照组，逐日观测菌落生长动态；
10.步骤3、孢子萌发试验——制备拮抗菌发酵液与梨孢子悬浮液，取梨孢子悬浮液与拮抗菌发酵液混合后，恒温保湿培养，以灭菌超纯水与孢子液混合为空白对照，分别在孵育后用光学显微镜观察拍照并统计孢子萌发率；
11.步骤4、叶片抑制试验——在托盘底部放置无菌纱布，并用灭菌水浸湿，叶片消毒后针刺处理，放入托盘中，在针刺伤口处滴加拮抗菌菌液与菌菌饼，用保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养后，观测叶片发病情况，以滴加灭菌水后接种菌菌饼的处理小组为空白对照；
12.步骤5、果实抑制试验——果实消毒后针刺处理，然后分三组进行处理，第一组在针刺伤口处贴浸泡灭菌水的滤纸，接种菌菌饼；第二组在每个果实伤口处先贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸，再接种菌菌饼；第三组在每个果实伤口处先接种菌菌饼再贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸；接种后果实放置在托盘中，保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养，观测果实发病情况，以针刺处理后贴无菌水滤纸的处理为阴性对照，以只接种菌菌饼为阳性对照；
13.步骤6、相关防御酶活测定——在叶片和果实抑制试验处理一段时间后，保存植物样本，测定β-1、3-葡聚糖酶、几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的酶活性。
14.本发明提供了一种快速鉴定生防菌株对梨病防治效果的方法，属于植物病害生物防治领域。本发明所述方法包括梨病病原体的培养，生防菌株的体外接种试验，生防菌株体内接种试验，梨叶片与果实离体培养与接种等步骤，通过梨病病原菌(以下简称菌)与生防菌株平板对峙的方法，验证生防菌株对梨菌菌落生长的抑制效果；通过离体梨树叶片与果实接种梨菌与生防菌株，观察不同处理下梨树叶片与果实病情发展来鉴定生防菌株对梨树病病情发展的抑制效果；通过培养梨树的分生孢子，并初步提取生防菌株的发酵液，验证生防菌株发酵液对分生孢子萌发的抑制效果。本发明具有快速、全面的优点，缩短了生防菌株对梨病防治效益探究的周期(鉴定一个菌株只需20-30天即可完成)，提高了鉴定结果的准确性，节省了鉴定的人力物力，实现了鉴定的高通量，另外，该方法发病条件人为可控，通过该方法能够科学高效准确的鉴定出梨对病的抗性。
15.本发明进一步的技术方案如下：
16.所述步骤1中，16s rdna序列扩增时，pcr反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，34 个循环；72℃终延伸10min。
17.所述步骤2中，拮抗菌菌饼的制备方法如下：将拮抗菌株在lb 培养基划线后恒温培养，然后和pda培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。
18.所述步骤2、4、5中，菌菌饼的制备方法如下：将菌在 lb培养基划线后恒温培养，然后和pda培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。
19.所述的步骤3中，梨菌孢子悬浮液的制备方法如下：用pdb 液体培养基摇培梨菌的菌饼诱导其产生分生孢子，无菌滤布过滤，离心收集分生孢子用pdb液体培养基重悬；
20.拮抗菌发酵液的制备方法如下：取-80℃保存的生防菌株菌液，在lb培养基中活化，取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，过滤得到拮抗菌发酵液。
21.所述步骤4中，叶片选自培养25d的杜梨叶片中部生理状态一致的叶片，针刺位置避开叶脉，滴加菌液20μl。
22.所述步骤4和5中，消毒方法为：流水冲洗梨叶片和果实，随后使用5％naclo溶液浸泡30s，用超纯水冲洗两次以洗去naclo溶液残留。
23.所述步骤4和5中，所述步骤4和5中，拮抗菌菌液制备方法为：取-80℃保存的生防菌株菌液，在lb培养基中活化，取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，用lb培养基调整菌液为od
600
＝0.8。
24.所述步骤5中，针刺处理的方式如下：每个针刺小区为直径6mm 的圆，针刺深度3mm，针刺12下。
25.所述步骤6中，植物组织样品的保存为：在叶片实验中称取0.1 g叶片，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存；在果实试验中称取果实发病部位附近0.1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。
26.本发明提供一种快速且系统的鉴定生物防治菌对梨树病防治效果的方法，包括梨病病原体的培养，生防菌的鉴定，生防菌株体内试验与体外实验等步骤，本发明通过生防菌对梨菌的体内试验，验证生防菌株对梨菌菌丝生长，菌落生长，分生孢子萌发的抑制效果；通过体外实验验证生防菌株对梨叶片与果实上病病情发展的抑制效果。同时通过生防菌株的鉴定确定生防菌株的菌种。本发明与传统梨树病害生防菌株功能验证的方法不同，更适应于梨树病生物防治菌功能验证，具有系统、快速等优点。本发明所述方法在实验室中即可完成，较为系统准确，适用于大规模鉴定。同时本发明所述的方法更加迅速，可以在20-30天完成。
附图说明
27.图1为生防菌株rt30与c30培养2d后的电镜扫描图。
28.图2为基于16s rdna序列以最大似然法构建rt30的进化树图。
29.图3为基于16s rdna序列以最大似然法构建c30的进化树图。
30.图4为菌株rt30、c30与梨菌平板对峙实验图。图中a：拮抗菌株与梨菌株平板对峙图；b：梨菌落边缘菌丝图；c：不同处理梨菌落半径比较图。
31.图5为接种菌5d后梨果实的表面图。
32.图6为果实表型数据图。图中a：病斑面积图；b：抑菌率图。
33.图7为5d果实相关防御酶酶活性的结果示意图。图中a：不同处理多酚氧化酶活性图；b：不同处理β-1，3葡糖酶活性图；c：不同处理苯丙氨酸解氨酶活性图；d：不同处理几丁质酶活性图。
34.图8为拮抗菌株叶片实验的结果示意图。a：叶片病斑图；b：叶面病斑面积对比图。
35.图9为5d叶片相关防御酶酶活性的结果示意图。a：不同处理几丁质酶活性图；b：不同处理苯丙氨酸解氨酶活性图；c：不同处理β-1，3葡糖酶活性图；d：不同处理多酚氧化酶活性图。
36.图10为菌株rt30与c30对梨菌孢子萌发的抑制效果图。图中标尺＝100微米。
37.图11为分生孢子萌发率变化图。
具体实施方式
38.本发明提供一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，包括以下步骤：
39.步骤1、生防菌的鉴定。通过提取生防菌株的16srdna序列，采用细菌的16s区通用引物27f/1492r进行16s rdna序列扩增，并将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析。pcr反应的程序： 94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s， 34个循环；72℃终延伸10min。
40.步骤2、平板对峙试验。制备拮抗菌菌饼和菌菌饼，将菌菌饼和拮抗菌菌饼分别对称贴于距pda培养基边缘2cm处，置于28℃恒温箱中倒置培养，以贴有菌饼和浸泡无菌水的pda 块设为空白对照组，逐日观测菌落生长动态。
41.拮抗菌菌饼的制备方法如下：将拮抗菌株在lb培养基划线后置于28℃恒温培养箱中培养2d，然后和pda培养基活化，于28℃恒温培养7d，取出在超净工作台中用6mm灭菌打孔器打取菌饼；
42.菌菌饼的制备方法如下：将菌在lb培养基划线后置于28℃恒温培养箱中培养2d，然后和pda培养基活化，于28℃恒温培养7d，取出在超净工作台中用6mm灭菌打孔器打取菌饼。
43.步骤3、孢子萌发试验。制备拮抗菌发酵液与梨菌孢子悬浮液，取1ml梨菌孢子悬浮液与1ml拮抗菌发酵液于灭菌2ml 离心管混合后，吸取20μl混合液滴在单凹载玻片上，28℃恒温箱保湿培养。以灭菌超纯水与孢子液混合为空白对照，分别在孵育4h、 8h、12h、24h后用光学显微镜观察拍照并统计孢子萌发率。重复三次。
44.孢子悬浮液的制备方法如下：用pdb液体培养基摇培梨菌的菌饼诱导其产生分生孢子，摇培3d后用无菌滤布过滤，离心收集分生孢子备用，随后用灭菌水洗2遍，最后用pdb液体培养基重悬至od600＝1.5；
45.拮抗菌发酵液的制备方法如下：取-80℃保存的rt-30、c30菌液，在lb培养基中活化，2d后取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，4 d后在超净工作台中用0.22μl口径的有机滤膜过滤2次后得到拮抗菌发酵液。
46.步骤4、叶片抑制试验。制备菌菌饼，制备拮抗菌菌液，制备托盘，在托盘底部放置无菌纱布，并用灭菌水浸湿。叶片消毒后针刺处理，放入托盘中，12h后进行试验。在针
刺伤口处滴加拮抗菌菌液与菌菌饼。接种后叶片放置在托盘中，并用保鲜膜覆盖托盘密封，于恒温培养箱内静置培养。于24h后取下菌饼，观测叶片发病情况。以滴加灭菌水后接种菌菌饼的处理小组为空白对照。每个处理作10个叶片重复，重复三次。叶片选自培养25d 的杜梨叶片中部生理状态一致的叶片，针刺位置避开叶脉，滴加菌液20μl。
47.步骤5、果实抑制试验。制备菌菌饼，制备拮抗菌菌液。制备托盘(同上)，果实消毒处理后针刺处理，放置12h。rt30与 c30组在针刺伤口处先贴浸泡灭菌水的滤纸4h后，接种菌菌饼； rt30-1与c30-1组在每个果实伤口处先贴上浸泡rt30与c30拮抗菌液的滤纸，放置4h，再接种菌；rt30-2与c30-2组则在每个果实伤口处先接种菌24h后再贴上浸泡接抗菌液的滤纸4h。接种后果实放置在托盘中，保鲜膜覆盖托盘密封，于恒温培养箱内静置培养，观测果实发病情况。以针刺处理后贴无菌水滤纸的处理为阴性对照，以只接种菌菌饼为阳性对照。每个处理作5个果实重复，重复三次。
48.步骤4和5中消毒方法为：流水冲洗梨叶片和果实，随后使用 5％naclo溶液浸泡30s，用超纯水冲洗两次以洗去naclo溶液残留。
49.拮抗菌液制备方法为：取-80℃保存的rt-30、c30菌液，在lb 培养基中活化，2d后取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，培养温度为28℃，最后用lb培养基调整菌液为od
600
＝0.8。
50.针刺处理的方式如下：每个针刺小区为直径6mm的圆，针刺深度3mm，针刺12下。
51.步骤6、相关防御酶活测定。在叶片和果实抑制试验处理一段时间5d后，保存植物样本，按照相应酶活测定试剂盒说明书要求测定β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等的酶活性。植物组织样品的保存：在叶片实验中称取0.1g叶片，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存；在果实试验中称取果实发病部位附近0.1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。
52.步骤2和5之间不存在时间上的先后顺序。
53.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
54.实施例1
55.1、供鉴定生防菌株与病原
56.实施例中供试生防菌株为rt30与c30。本研究中拮抗菌株 rt30为安徽农业大学园艺学院刘普老师所赠，c30为安徽农业大学植物保护学院羊国根老师所赠。供试梨病病原菌由江苏省农业科学院提供。
57.2、生防菌株的鉴定
58.生防菌株的鉴定分为分子学鉴定与生理生化鉴定。分子学鉴定为取-80℃保存的rt30、c30，在lb培养基中活化，2d后取单克隆菌落二次划线，送至上海生工生物技术有限公司进行菌种鉴定。采用细菌的16s区通用引物27f(5
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)/1492r(5
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tacggctaccttgttacgactt-3
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)进行16s rdna 序列扩增。pcr序列扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性 30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，34个循环；72℃终延伸10 min。将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析，并利用iqtree 作图。生理生化鉴定为参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》对菌株进行生理生化性状测定。
59.3、生防菌株平板对峙试验
60.制备菌以及拮抗菌株菌饼，准备进行平板对峙试验。将菌菌饼和拮抗菌菌饼分别对称贴于距pda培养基边缘2cm处，置于28℃恒温箱中倒置培养。以贴有菌饼和浸泡无菌水的pda 块设为空白对照组，逐日观测菌落生长动态。
61.4、生防菌株果实试验
62.制备菌菌饼，制备拮抗菌od
600
＝0.8的菌液。制备托盘，在托盘底部放置灭菌纱布喷无菌水保湿。流水冲洗翠冠梨果实，随后使用5％naclo溶液浸泡30s后用超纯水冲洗两次以洗去naclo 溶液残留。待自然晾干后在梨果实四面用一次性注射器针刺处理，每个针刺小区为直径6mm的圆，针刺深度3mm，放置12h。准备 6mm边长的滤纸，灭菌处理。rt30与c30组在针刺伤口处先贴浸泡灭菌水的滤纸4h后，接种菌菌饼；rt30-1与c30-1组在每个果实伤口处先贴上浸泡rt30与c30拮抗菌液的滤纸，放置4h，再接种菌；rt30-2与c30-2组则先接种菌24h后再贴上浸泡接抗菌的滤纸4h。接种后果实放置在托盘中，其底部放置已灭菌的纱布喷无菌水保湿，保鲜膜覆盖托盘密封，于28℃恒温培养箱内静置培养120h。于24h后取下菌饼，之后分别在48h、72h、 96h、120h观测果实发病情况。以针刺处理后贴无菌水滤纸的处理为阴性对照，以只接种菌菌饼为阳性对照。每个处理作5个果实重复，重复三次。
63.5、生防菌株叶片试验
64.制备菌菌饼，制备拮抗菌od
600
＝0.8的菌液。制备托盘，在托盘底部放置无菌纱布，并用灭菌水浸湿。流水冲洗杜梨叶片，随后使用5％naclo溶液浸泡30s后用超纯水冲洗两次以洗去naclo 溶液残留。用在叶片中央部位用一次性灭菌注射器针刺，避开叶脉，用无菌水浸湿的无菌棉球包裹叶柄，放入托盘中，12h后进行试验。在针刺伤口处滴加20μl拮抗菌菌液，再贴一个6mm的菌菌饼。接种后叶片放置在托盘中，并用保鲜膜覆盖托盘密封，于28℃恒温培养箱内静置培养120h。于24h后取下菌饼，之后分别在48h、 72h、96h、120h观测叶片发病情况。以滴加20μl灭菌水后接种菌菌饼的处理小组为空白对照。每个处理作10个叶片重复，重复三次。
65.6、孢子萌发试验
66.制备拮抗菌发酵液，取-80℃保存的rt-30、c30菌液，在lb 培养基中活化，2d后取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，4d后在超净工作台中用0.22μl口径的有机滤膜过滤2次后得到拮抗菌发酵液。
67.用pdb液体培养基摇培梨菌的菌饼诱导其产生分生孢子。摇培3d后用无菌滤布过滤，离心收集分生孢子备用，随后用灭菌水洗2遍，最后用pdb液体培养基重悬至od
600
＝1.5。取1ml孢子液与1ml拮抗菌发酵液于灭菌2ml离心管混合后，吸取20μl混合液滴在单凹载玻片上，28℃恒温箱保湿培养。以灭菌超纯水与孢子液混合为空白对照，分别在孵育后4h、8h、12h、24h用光学显微镜观察拍照并统计孢子萌发率。重复三次。
68.7、相关防御酶活性测定
69.(1)苯丙氨酸解氨酶含量测定：使用南京建成赛浩科技有限公司的苯丙氨酸解氨酶(pal)测试盒(比法)测定。
70.(2)几丁质酶含量测定：使用南京建成赛浩科技有限公司的几丁质酶(chi)测试盒(比法)测定。
71.(3)多酚氧化酶活性测定：使用南京建成赛浩科技有限公司的多酚氧化酶(ppo)测试盒(比法)测定。
72.(4)β-1，3-葡聚糖酶活性测定：使用南京迈博生物科技有限公司的β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)测试盒测定。
73.8、数据分析与作图
74.实验数据使用excel 2019和spss19.0进行方差分析，采用单因素方差分析各处理显著性水平，使用duncan’s新复极差法检验差异显著性差异，采用最小显著差数法(p《0.05)进行不同处理间均值的显著性差异比较。利用graphpad prism 8.02和adobe illustratorcs6软件进行作图。
75.9、结果分析
76.由图1所示，rt30在lb培养基上生长24h时，单克隆菌落呈不透明的乳白椭圆形，中间略有突起，表面呈淡黄，有较暗光泽，培养24h单菌落隆起呈现乳白水滴状。菌株c30在lb培养基上初期单菌落表面有光泽，乳白近椭圆形，后期菌落颜变为淡黄。
77.表1菌株rt30、c30生理生化特征
[0078][0079]
注：“+”为阳性反应；
“‑”
为阴性反应。
[0080]
note:"+"is a positive reaction；"-"is a negative reaction.
[0081]
如表1所示，菌株rt30、c30革兰氏染反应、接触酶试验、明胶反应、淀粉水解、硝酸盐试验、柠檬酸盐利用均为阳性，对盐的耐受度都在2％以上、5％以下。而rt3o、c30的v-p试验分别为阳性、阴性，二者甲基化试验全为阴性。
[0082]
根据rt30与c30的16s rdna序列blast比对分析结果得出(如图2、3)，菌株rt30与贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)cbmb205 的同源性高达99.86％，菌株c30与解淀粉芽孢杆菌 (b.amyloliquefaciens)bcrc11601的同源性高达99.27％。
[0083]
如图4中a中所示，以灭菌水处理为对照(ck)梨菌具有较完整的菌落，而放置生防菌rt30与c30菌饼的梨菌落均出现较为明显的抑菌圈，从图4中b可以清晰的了解到放置生防菌菌饼的处理的小组与清水处理的空白对照组中梨菌菌落半径具有显著性差异。图4中c可以看出，在显微镜的视角下清水处理的菌落边缘的菌菌丝生长舒缓正常，向四周不规则辐射生长。而放置rt30与c30菌饼处理的菌菌丝生长萎缩抑
制，菌丝密集的的挤压在一起。由表2所示，拮抗菌株rt30与c30对梨菌菌落生长抑制率分别为37.83％、41.28％。
[0084]
表2拮抗菌株rt30、c30抑菌率
[0085][0086]
如图5所示，无论是先使用拮抗菌株处理再接种菌的小组 (rt30-1、c30-1)还是先接种菌后24h再使用拮抗菌株处理的小组(rt30-2、c30-2)，梨果实上病病斑大小显著小于以清水处理为空白对照组(ck)，且ck组梨果实病斑深度同样比拮抗菌株处理的小组大。与此同时通过对比rt30-1、c30-1组与rt30-2、 c30-2组，先使用拮抗菌株处理的小组病斑大小以及发病的深度均小于接种菌24h后再接种拮抗菌株的小组。
[0087]
如图6中a所示，rt30-1、c30-1组与rt30-2、c30-2组均较 ck具有显著差异，且rt30-1、c30-1组与rt30-2、c30-2组间也具有显著差异，拮抗菌株处理后的病斑面积远小于对照组。如图6中 b所示，四种处理中拮抗菌株的平均抑菌率最大的是c30-1组，高达55.08％，且rt30-1、c30-1组平均抑菌率均大于r30-2、c30-2 组。同时仅仅只用拮抗菌株处理的小组(rt30、c30)中，梨果实未出现除针刺痕迹外的其他伤害。这些结果说明，拮抗菌株rt30、 c30对于梨果实病的发生具有一定的抑制作用，在接种菌前使用拮抗菌菌液的抑菌效果更优，同时拮抗菌株rt30、c30本身对梨果实无害。
[0088]
如图7中a所示，在接种菌5d后，rt30-1、c30-1组与 rt30-2、c30-2组果实表皮中多酚氧化酶活性较空白对照组明显升高，分别上升了46％、30％、47％、37％。接种菌后，梨果皮中的多酚氧化酶酶活性有所升高，只用生防菌处理不接种菌也会导致梨果皮中多酚氧化酶活性升高。从图7中b可以看出，接种菌第五天时，用拮抗菌株处理的小组的梨果皮的苯丙氨酸解氨酶活性显著升高，rt30-1,2与c30-1,2组较ck组均提升约四倍，较处理前提升60-70倍。与此同时，仅仅只用拮抗菌株rt30c30处理的小组，梨果实表皮中的苯丙氨酸解氨酶活性也上升了80％。如图7c 所示,接种菌5d后，拮抗菌株rt30、c30处理的小组梨果皮的的β-1，3葡糖酶活性高于空白对照组，且与对照组有极显著差异。与处理前(before)组相比，使用接抗菌处理梨果实的针刺部位也会提升其β-1，3葡糖酶活性。从图7中d中可以看出，无论是先用拮抗菌株rt30、c30预处理再接种菌还是先接种菌再用拮抗菌株处理，果皮中几丁质酶活性显著升高。同时与不接种菌组对比，单独使用接抗菌处理的梨果实果皮也增强了几丁质酶活性。
[0089]
图8展示了拮抗菌株rt30、c30对于梨叶片病发生的抑制效果。如图8中a所示，空白对照组ck叶片的病斑大小远大于处理组rt30、c30组，从图8中b中可以看出，rt30组病斑面积较空白对照组ck缩小约79％，而c30组病斑面积较ck组缩小约81％。
[0090]
如图9所示，abcd图分别展现了杜梨叶片接种菌5d后几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、β-1，3葡糖酶、多酚氧化酶的活性。如图9中a图所示，试验组rt30、c30叶片中几丁质酶活
性较ck 组显著提高，分别提升3.1％、2.9％。如图9中b图所示，处理组rt30、c30叶片苯丙氨酸解氨酶活性较ck组显著升高，分别提升 19.7％、24.7％，同时空白对照组ck叶片苯丙氨酸解氨酶活性较接种前也提升15.4％。如图图9中c所示，处理组rt30、30的杜梨叶片的β-1，3葡糖酶活性与ck组相比显著升高，分别提升31.8％、 31.9％，与此同时ck组β-1，3葡糖酶活性较before组也提升了22.2％。从图图9中d中可以看出，与空白对照组ck相比，rt30、c30 组叶片的多酚氧化酶活性分别提高了45.8％、50.1％，具有显著性。而与before组对比，ck组提升了26.5％。
[0091]
如图11所示，4h时三组处理的菌孢子萌发率均不算很高，且差距并不大；处理8h时，加入lb液体培养基的ck组，孢子萌发率在70％以上，而加入rt30、c30粗提取液的处理小组孢子萌发率分别为51.6％、60.5％；处理12h时，ck组的孢子萌发率就已经超过了90％，而rt30、c30粗提取液处理的小组，萌发率则处于75％以下；即使在处理24h，ck组的孢子萌发率就已经达到了98.7％，而rt30、c30粗提取液处理的小组，萌发率则处于80％以下。与此同时，通过显微镜拍摄的图片中也可以清晰的了解到，三组处理萌发的孢子芽管均在伸长，且rt30、c30粗提取液处理的小组芽管长度均明显低于ck组。
[0092]
综上所述，本发明通过生理生化以及分子水平鉴定生防菌株 rt30为贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)、c30为解淀粉芽孢 (b.amyloliquefaciens)。生防菌株rt30与c30对梨菌菌落生长具有显著抑制效果，且对梨菌菌丝的生长、菌丝的分支有较明显的影响，其粗提取液可以抑制梨菌分生孢子的萌发以及芽管的生长。生防菌株rt30、c30对于梨果实和叶片病病情发展具有抑制作用，在接种菌前使用拮抗菌菌液的抑菌效果更优，同时拮抗菌株rt30、c30本身对梨果实无害。在梨菌侵染杜梨叶片时，四种防御酶活性都显著升高，而生防菌株rt30、c30可以提高叶片中四种防御酶的活性，抵御病害的侵袭。
[0093]
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

技术特征：

1.一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、生防菌的鉴定——通过提取生防菌株的16srdna序列，采用细菌的 16s 区通用引物27f/1492r进行16s rdna序列扩增，并将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析；步骤2、平板对峙试验——制备拮抗菌菌饼和菌菌饼，将菌菌饼和拮抗菌菌饼分别对称贴于距pda培养基边缘 2 cm处，恒温培养，以贴有菌饼和浸泡无菌水的pda块设为空白对照组，逐日观测菌落生长动态；步骤3、孢子萌发试验——制备拮抗菌发酵液与梨菌孢子悬浮液，取梨菌孢子悬浮液与拮抗菌发酵液混合后，恒温保湿培养，以灭菌超纯水与孢子液混合为空白对照，分别在孵育后用光学显微镜观察拍照并统计孢子萌发率；步骤4、叶片抑制试验——在托盘底部放置无菌纱布，并用灭菌水浸湿，叶片消毒后针刺处理，放入托盘中，在针刺伤口处滴加拮抗菌菌液与菌菌饼，用保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养后，观测叶片发病情况，以滴加灭菌水后接种菌菌饼的处理小组为空白对照；步骤5、果实抑制试验——果实消毒后针刺处理，然后分三组进行处理，第一组在针刺伤口处贴浸泡灭菌水的滤纸，接种菌菌饼；第二组在每个果实伤口处先贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸，再接种菌菌饼；第三组在每个果实伤口处先接种菌菌饼再贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸；接种后果实放置在托盘中，保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养，观测果实发病情况，以针刺处理后贴无菌水滤纸的处理为阴性对照，以只接种菌菌饼为阳性对照；步骤6、相关防御酶活测定——在叶片和果实抑制试验处理一段时间后，保存植物样本，测定β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的酶活性。2.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤1中，16s rdna序列扩增时，pcr反应的程序为：94℃预变性 3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，34个循环；72
°
c终延伸10 min。3.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤2中，拮抗菌菌饼的制备方法如下：将拮抗菌株在lb培养基划线后恒温培养，然后和pda培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。4.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤2、4、5中，菌菌饼的制备方法如下：将菌在lb培养基划线后恒温培养，然后和pda培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。5.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述的步骤3中，梨菌孢子悬浮液的制备方法如下：用pdb液体培养基摇培梨菌的菌饼诱导其产生分生孢子，无菌滤布过滤，离心收集分生孢子用pdb液体培养基重悬；拮抗菌发酵液的制备方法如下：取-80℃保存的生防菌株菌液，在lb培养基中活化，取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，过滤得到拮抗菌发酵液。6.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤4中，叶片选自培养25d的杜梨叶片中部生理状态一致的叶片，针刺位置避开叶脉，滴加菌液20
ꢀµ
l。7.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征
在于，所述步骤4和5中，消毒方法为：流水冲洗梨叶片和果实，随后使用5% naclo 溶液浸泡30 s，用超纯水冲洗两次以洗去naclo溶液残留。8.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤4和5中，拮抗菌菌液制备方法为：取-80℃保存的生防菌株菌液，在lb培养基中活化，取单克隆菌落于lb液体培养基摇培，用lb培养基调整菌液为od
600
=0.8。9.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤5中，针刺处理的方式如下：每个针刺小区为直径6 mm的圆，针刺深度3 mm，针刺12下。10.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤6中，植物组织样品的保存为：在叶片实验中称取0.1 g叶片，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存；在果实试验中称取果实发病部位附近0.1 g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

技术总结

本发明公开了快速鉴定生防菌株对梨病防治效果的方法，该方法通过梨病病原菌与生防菌株平板对峙的方法，验证生防菌株对菌菌落生长的抑制效果；通过离体梨树叶片与果实接种梨菌与生防菌株，观察不同处理下梨树叶片与果实病情发展来鉴定生防菌株对梨树病病情发展的抑制效果；通过培养梨树菌的分生孢子，并初步提取生防菌株的发酵液，验证生防菌株发酵液对分生孢子萌发的抑制效果。本发明具有快速、全面的优点，缩短了生防菌株对梨病防治效益探究的周期，提高了鉴定结果的准确性，节省了鉴定的人力物力，实现了鉴定的高通量。了鉴定的高通量。了鉴定的高通量。