一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法

1.本发明属于生物医用金属材料表面改性技术领域，具体涉及一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法。

背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.医用钛植入材料常用于临床修复和替换由创伤、感染和肿瘤等引起的硬组织缺损。通常情况下，为了改善钛金属本身固有的生物惰性以及提高其体内植入的长期稳定性，需要利用机械、物理或化学方法等手段使材料表面粗糙化或修饰活性涂层来提高其表面生物活性。然而对于较为复杂的临床病例，尤其是对患有骨质疏松症、糖尿病等全身性疾病的患者而言，具有单一功能的植体显然已不能满足复杂的临床需求。
4.干细胞旁分泌的外泌体是一种低免疫原性的囊泡样小体，其内包裹蛋白、核酸和脂质等生物活性物质，具有抗炎、抗纤维化、促血管生成和促骨生成等作用，将外泌体修饰于钛植入体表面可有效提高其生物活性。人骨无机质中含有多种微量元素，在骨新陈代谢和骨转换中有重要的地位。如锌可通过甲状腺来调节钙分泌并影响骨转换，也可促进成骨细胞样细胞的生长、分化，有助于骨的钙化；镁通过刺激破骨细胞的功能促进骨转换；锶通过增强前成骨细胞的增殖而促进成骨细胞的成骨作用，同时抑制前破骨细胞的分化，抑制破骨细胞的骨吸收作用。因此将微量元素和外泌体同时修饰于钛植入体表面，对于改善成骨微环境，促进骨组织中血管再生和矿物基质沉积具有积极作用。
5.目前尚无文献和专利报道具有同步缓释活性微量元素和外泌体特性的钛植入体的制备方法。

技术实现要素：

6.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法，能够对微量元素与外泌体进行缓释，有助于改善骨质疏松等条件下的钛植入体骨缺损修复，提高骨整合效率，缩短愈合时间。
7.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
8.一方面，一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体，钛金属表面设置磷酸盐膜层，所述磷酸盐膜层表面通过聚多巴胺负载外泌体，所述磷酸盐膜层内含有微量元素；所述磷酸盐膜层具有多孔多级结构和粗糙表面，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种。
9.本发明在钛金属表面设置含微量元素的磷酸盐膜层，膜层具有多孔多级结构和粗糙表面，可为外泌体的负载提供较大的比表面积。利用聚多巴胺分子自身黏附性将外泌体负载于钛表面。随着钛表面含微量元素磷酸盐膜层在微环境中的降解，实现微量元素和外
泌体的同步释放。
10.另一方面，一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)将钛金属浸入至含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液中，在55～75℃条件下，先进行超声处理，再进行静置处理，在钛金属表面制得含有微量元素的磷酸盐转化膜层，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种；
12.(2)将步骤(1)处理后的钛金属置于多巴胺盐酸盐溶液中，进行反应，获得聚多巴胺修饰的含微量元素磷酸盐膜层的钛金属；
13.(3)将步骤(2)处理后的钛金属浸泡于外泌体悬液中，进行孵育，即得可缓释微量元素与外泌体的钛植入体。
14.第三方面，一种上述可缓释微量元素与外泌体的钛植入体在制备修复硬组织缺损的材料中的应用。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明方法提供的钛植入体表面同时修饰含微量元素的磷酸盐膜层和外泌体。一方面外泌体可随着磷酸盐膜层的体内降解同步缓释，发挥抗炎、免疫调控和促血管化、促成骨等作用；另一方面，钛表面磷酸盐膜层的主要化学成分为掺杂微量金属元素的钙磷酸盐，在体内环境下可以缓慢降解(植入初期炎性环境ph为酸性条件下可加速降解)，向钛植入材料和骨组织周围释放ca
2+
、po
43-，为骨基质沉积输送养分，并与骨组织产生牢固的化学键合，同时膜层降解释放掺杂的微量活性金属离子，进一步改善成骨微环境，促进骨再生。因此，钛表面外泌体和微量元素的共同释放，不但可以显著提高钛植入初期材料表面的生物活性，而且为钛表面骨组织新生提供了温床，有利于增强骨修复的长期稳定性。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为本发明实施例制备的钛植入体的钛表面含微量元素的磷酸盐膜层的元素分布图，(a)含sr元素膜层的元素分布，(b)含zn元素膜层的元素分布；(c)含fe元素膜层的元素分布；(d)含多种微量元素膜层的元素分布。
19.图2为本发明实施例制备的钛植入体的钛表面修饰的(a)微量元素和(b)外泌体在pbs中的释放曲线；
20.图3为(a)纯钛基底和(b)本发明实施例制备的钛植入体表面培养骨髓间充质干细胞活/死染后荧光显微镜图片。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
23.为了使钛植入体具有同步缓释活性微量元素和外泌体特性，本发明提出了一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法。
24.本发明的一种典型实施方式，提供了一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体，钛金属表面设置磷酸盐膜层，所述磷酸盐膜层表面通过聚多巴胺负载外泌体，所述磷酸盐膜层内含有微量元素；所述磷酸盐膜层具有多孔多级结构和粗糙表面，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种。
25.在一些实施例中，所述磷酸盐膜层的主要成分为钙磷酸盐。
26.本发明的另一种实施方式，提供了一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，包括以下步骤：
27.(1)将钛金属浸入至含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液中，在55～75℃条件下，先进行超声处理，再进行静置处理，在钛金属表面制得含有微量元素的磷酸盐转化膜层，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种；
28.(2)将步骤(1)处理后的钛金属置于多巴胺盐酸盐溶液中，进行反应，获得聚多巴胺修饰的含微量元素磷酸盐膜层的钛金属；
29.(3)将步骤(2)处理后的钛金属浸泡于外泌体悬液中，进行孵育，即得可缓释微量元素与外泌体的钛植入体。
30.本发明通过含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液在钛金属表面形成含微量元素的磷酸盐膜层，其主要化学成分为掺杂微量金属元素的钙磷酸盐，在体内环境下可以缓慢降解，向钛植入材料和骨组织周围释放ca
2+
、po
43-以及掺杂的微量活性金属离子。在一些实施例中，含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液中，硝酸钙的浓度为0.02～0.2mol/l，磷酸二氢根离子0.05～0.5mol/l，硝酸钠0.01～0.03mol/l，微量元素离子的浓度为0.001～0.2mol/l。
31.在一些实施例中，含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液ph为2.0～5.0。采用磷酸或氢氧化钠溶液调节含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液的ph。
32.本发明采用先超声处理，再静置处理，不仅有利于微量元素进入至含微量元素的磷酸盐膜层内，而且有利于使磷酸盐膜层形成多孔多级结构并使磷酸盐膜层表面粗糙。在一些实施例中，步骤(1)中，超声处理的时间为20～30min。
33.在一些实施例中，步骤(1)中，静置处理的时间为20～30min。
34.在一些实施例中，步骤(2)中，将钛金属无叠放置于多巴胺盐酸盐溶液中。能够保证多巴胺在钛金属表面进行聚合形成聚多巴胺。
35.在一些实施例中，步骤(2)中，多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～3mg/ml。多巴胺盐酸盐溶液采用三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制，ph调节为8.3～8.7。
36.在一些实施例中，步骤(2)中，反应条件为：35～39℃，避光，反应时间为18～48h。
37.本发明所述外泌体来自干细胞，将外泌体分散于pbs缓冲液中制成外泌体悬液，在一些实施例中，步骤(3)中，外泌体悬液的浓度为10～300μg/ml。
38.在一些实施例中，步骤(3)中，孵育的条件为：3～5℃，避光孵育2～24h。
39.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述可缓释微量元素与外泌体的钛植入体在制备修复硬组织缺损的材料中的应用。
40.具体地，所述的硬组织为骨骼或牙齿。
41.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
42.实施例1
43.本实施例所记载的一种可释放锶离子和外泌体的钛植入材料的制备方法，其具体步骤如下：
44.(1)配制含有锶元素的磷酸盐转化液，各成分的浓度分别为0.05mol/l ca(no3)2·
4h2o、0.1mol/l srcl2·
6h2o、0.15mol/l nah2po4·
2h2o和0.02mol/l nano3，调控ph值为4.75，将经过打磨、清洗和酸洗活化后的钛植入材料浸泡该溶液中，70℃条件下在超声场水浴条件下反应30min，然后静置水浴反应30min，经水洗干燥，获得钛表面修饰锶微量元素的磷酸盐膜层，元素分布图如图1a所示。
45.(2)用ph为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制2mg/ml多巴胺盐酸盐溶液，将步骤(1)获得的钛样本无叠放浸泡于该溶液中，37℃条件下避光震荡反应18h后取出，流动去离子水反复冲洗去除未结合的聚多巴胺，干燥后得到聚多巴胺修饰的钛样本。
46.(3)取大鼠骨髓间充质干细胞用无血清培养基培养至p3-p5代，48-72h后收集条件培养基，过滤收集上清，4℃时以3000g离心10min以去除死细胞和细胞碎片等。按培养基:试剂＝5:1的比例加入exoquick-tc外泌体沉淀液，涡旋振荡使其充分混匀，4℃冷藏孵育12小时。然后将混合液4℃条件下以10000g离心60min，弃去上清液，获取富含外泌体颗粒的沉淀物。取400μl pbs缓冲液均匀吹打沉淀物，待其均匀悬浮在pbs中后转移至新的离心管中，4℃条件下以12000g离心2min，即得外泌体颗粒粗品。将收获的粗品转入纯化柱上室中，4℃以3000g离心10min，收集纯化柱管底液体，即得纯化后的外泌体悬液。
47.(4)将步骤(2)获得的钛样本置于24孔板内，每孔板注入步骤(3)中获得的外泌体悬液10μl，4℃条件下摇床中混合避光孵育12h，最终获得修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体。
48.实施例2
49.本实施例所记载的一种可释放锌离子和外泌体的钛植入材料的制备方法，其具体步骤如下：
50.(1)配制含有锌元素的磷酸盐转化液，各成分的浓度分别为0.04mol/l ca(no3)2·
4h2o、0.15mol/l zn(h2po4)2·
2h2o、0.05mol/l nah2po4·
2h2o和0.02mol/l nano3，调控ph值为2.50，将经过打磨、清洗和酸洗活化后的钛植入材料浸泡该溶液中，70℃条件下在超声场水浴条件下反应30min，然后静置水浴反应30min，经水洗干燥，获得钛表面修饰锌微量元素的磷酸盐膜层，元素分布图如图1b所示。
51.(2)用ph为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制2mg/ml多巴胺盐酸盐溶液，将步骤(1)获得的钛样本无叠放浸泡于该溶液中，37℃条件下避光震荡反应18h后取出，流动去离子水反复冲洗去除未结合的聚多巴胺，干燥后得到聚多巴胺修饰的钛样本。
52.(3)取大鼠骨髓间充质干细胞用无血清培养基培养至p3-p5代，48-72h后收集条件培养基，过滤收集上清，4℃时以3000g离心10min以去除死细胞和细胞碎片等。按培养基:试剂＝5:1的比例加入exoquick-tc外泌体沉淀液，涡旋振荡使其充分混匀，4℃冷藏孵育12小时。然后将混合液4℃条件下以10000g离心60min，弃去上清液，获取富含外泌体颗粒的沉淀
物。取400μl pbs缓冲液均匀吹打沉淀物，待其均匀悬浮在pbs中后转移至新的离心管中，4℃条件下以12000g离心2min，即得外泌体颗粒粗品。将收获的粗品转入纯化柱上室中，4℃以3000g离心10min，收集纯化柱管底液体，即得纯化后的外泌体悬液。
53.(4)将步骤(2)获得的钛样本置于24孔板内，每孔板注入步骤(3)中获得的外泌体悬液10μl，4℃条件下摇床中混合避光孵育12h，最终获得修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体。
54.实施例3
55.本实施例所记载的一种可释放铁离子和外泌体的钛植入材料的制备方法，其具体步骤如下：
56.(1)配制含有铁元素的磷酸盐转化液，各成分的浓度分别为0.05mol/l ca(no3)2·
4h2o、0.1mol/l fecl3、0.15mol/l nah2po4·
2h2o和0.02mol/l nano3，调控ph值为4.75，将经过打磨、清洗和酸洗活化后的钛植入材料浸泡该溶液中，70℃条件下在超声场水浴条件下反应30min，然后静置水浴反应30min，经水洗干燥，获得钛表面修饰铁微量元素的磷酸盐膜层，元素分布图如图1c所示。
57.(2)用ph为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制2mg/ml多巴胺盐酸盐溶液，将步骤(1)获得的钛样本无叠放浸泡于该溶液中，37℃条件下避光震荡反应18h后取出，流动去离子水反复冲洗去除未结合的聚多巴胺，干燥后得到聚多巴胺修饰的钛样本。
58.(3)取大鼠骨髓间充质干细胞用无血清培养基培养至p3-p5代，48-72h后收集条件培养基，过滤收集上清，4℃时以3000g离心10min以去除死细胞和细胞碎片等。按培养基:试剂＝5:1的比例加入exoquick-tc外泌体沉淀液，涡旋振荡使其充分混匀，4℃冷藏孵育12小时。然后将混合液4℃条件下以10000g离心60min，弃去上清液，获取富含外泌体颗粒的沉淀物。取400μl pbs缓冲液均匀吹打沉淀物，待其均匀悬浮在pbs中后转移至新的离心管中，4℃条件下以12000g离心2min，即得外泌体颗粒粗品。将收获的粗品转入纯化柱上室中，4℃以3000g离心10min，收集纯化柱管底液体，即得纯化后的外泌体悬液。
59.(4)将步骤(2)获得的钛样本置于24孔板内，每孔板注入步骤(3)中获得的外泌体悬液10μl，4℃条件下摇床中混合避光孵育12h，最终获得修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体。
60.实施例4
61.本实施例所记载的一种可释放多种微量元素离子和外泌体的钛植入材料的制备方法，其具体步骤如下：
62.(1)配制含有多种微量元素的磷酸盐转化液，各成分的浓度分别为0.05mol/l ca(no3)2·
4h2o、0.015mol/lzn(h2po4)2·
2h2o、0.15mol/lsrcl2·
6h2o、0.15mol/l nah2po4·
2h2o和0.02mol/l nano3，调控ph值为3.25，将经过打磨、清洗和酸洗活化后的钛植入材料浸泡该溶液中，70℃条件下在超声场水浴条件下反应30min，然后静置水浴反应30min，经水洗干燥，获得钛表面修饰多种微量元素的磷酸盐膜层，元素分布图如图1d所示。
63.(2)用ph为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制2mg/ml多巴胺盐酸盐溶液，将步骤(1)获得的钛样本无叠放浸泡于该溶液中，37℃条件下避光震荡反应18h后取出，流动去离子水反复冲洗去除未结合的聚多巴胺，干燥后得到聚多巴胺修饰的钛样本。
64.(3)取大鼠骨髓间充质干细胞用无血清培养基培养至p3-p5代，48-72h后收集条件
培养基，过滤收集上清，4℃时以3000g离心10min以去除死细胞和细胞碎片等。按培养基:试剂＝5:1的比例加入exoquick-tc外泌体沉淀液，涡旋振荡使其充分混匀，4℃冷藏孵育12小时。然后将混合液4℃条件下以10000g离心60min，弃去上清液，获取富含外泌体颗粒的沉淀物。取400μl pbs缓冲液均匀吹打沉淀物，待其均匀悬浮在pbs中后转移至新的离心管中，4℃条件下以12000g离心2min，即得外泌体颗粒粗品。将收获的粗品转入纯化柱上室中，4℃以3000g离心10min，收集纯化柱管底液体，即得纯化后的外泌体悬液。
65.(4)将步骤(2)获得的钛样本置于24孔板内，每孔板注入步骤(3)中获得的外泌体悬液10μl，4℃条件下摇床中混合避光孵育12h，最终获得修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体。
66.将实施例1制备的修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体置于孔板中加入至pbs缓冲液(ph＝6.8)中，放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中。在每个时间点收集上清液，收集后孔板内再充入新鲜pbs缓冲液。测定收集上清液中sr元素的含量和外泌体浓度，绘制释放曲线图。结果如图2所示，图2表明，实施例1提供的修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体具有释放锶离子和外泌体的功能。
67.将实施例1制备的修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体置于24孔板中，接种骨髓间充质干细胞培养1天后，弃原培养基，pbs缓冲液冲洗两遍，加入活/死细胞染试剂，37℃条件下避光孵育30min后，在荧光显微镜下观察染效果，结果如图3所示，图3表明，纯钛基底和实施例1提供的修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体表面皆无死细胞，但实施例1提供的修饰微量元素磷酸盐转化膜和外泌体的钛植入体表面活细胞数量显著多余纯钛基底，表明具有良好的细胞相容性。
68.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体，其特征是，钛金属表面设置磷酸盐膜层，所述磷酸盐膜层表面通过聚多巴胺负载外泌体，所述磷酸盐膜层内含有微量元素；所述磷酸盐膜层具有多孔多级结构和粗糙表面，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种。2.如权利要求1所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体，其特征是，所述磷酸盐膜层的主要成分为钙磷酸盐。3.一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)将钛金属浸入至含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液中，在55～75℃条件下，先进行超声处理，再进行静置处理，在钛金属表面制得含有微量元素的磷酸盐转化膜层，所述微量元素为fe、zn、sr、al、mg、mn、zr中的一种或多种；(2)将步骤(1)处理后的钛金属置于多巴胺盐酸盐溶液中，进行反应，获得聚多巴胺修饰的含微量元素磷酸盐膜层的钛金属；(3)将步骤(2)处理后的钛金属浸泡于外泌体悬液中，进行孵育，即得可缓释微量元素与外泌体的钛植入体。4.如权利要求3所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，含有微量元素可溶性盐的磷酸盐转化液中，硝酸钙的浓度为0.02～0.2mol/l，磷酸二氢根离子0.05～0.5mol/l，硝酸钠0.01～0.03mol/l，微量元素离子的浓度为0.001～0.2mol/l。5.如权利要求3所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，步骤(1)中，超声处理的时间为20～30min。6.如权利要求3所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，步骤(2)中，将钛金属无叠放置于多巴胺盐酸盐溶液中。7.如权利要求3所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，多巴胺盐酸盐溶液采用三羟甲基氨基甲烷盐酸tris-hcl配制。8.如权利要求3所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体的制备方法，其特征是，将外泌体分散于pbs缓冲液中制成外泌体悬液。9.一种权利要求1或2所述的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体或者权利要求3～8任一所述的制备方法获得的可缓释微量元素与外泌体的钛植入体在制备修复硬组织缺损的材料中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述的硬组织为骨骼或牙齿。

技术总结

本发明属于生物医用金属材料表面改性技术领域，具体涉及一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法。钛金属表面设置磷酸盐膜层，所述磷酸盐膜层表面通过聚多巴胺负载外泌体，所述磷酸盐膜层内含有微量元素；所述磷酸盐膜层具有多孔多级结构和粗糙表面，所述微量元素为Fe、Zn、Sr、Al、Mg、Mn、Zr中的一种或多种。本发明能够对微量元素与外泌体进行缓释，有助于改善骨质疏松等条件下的钛植入体骨缺损修复，提高骨整合效率，缩短愈合时间。缩短愈合时间。缩短愈合时间。