阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用

1.本发明涉及生物工程与农业产品深加工技术领域，更具体的说是涉及阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用。

背景技术：

2.食品，谷物，果蔬，饲料，中药材等基质，在种植、采收、加工、运输尤其是储藏过程中受温度、湿度、空气、微生物等多种因素的影响，易被曲霉属、青霉属等有毒真菌污染导致发霉变质的现象。真菌侵染农产品后，在适宜的温度、湿度条件下可以分解产品中的糖类、蛋白质、脂肪等成分使营养物质损失，这不仅影响农产品和中药材的品质和质量，而且产生的次级代谢产物-真菌毒素严重威胁人畜的健康和生命安全。真菌毒素是由真菌产生的的次级代谢产物，具有极强的毒性和致癌、致畸、致突变作用，主要包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素a，玉米赤霉烯酮等。储藏是农产品流通中最关键的过程，也是霉变爆发的主要阶段。因此，如何在在储藏过程中控制真菌的侵染和真菌毒素的产生，是农产品储藏过程中亟需解决的关键问题。
3.目前诸多物理化学等脱毒和防霉养护技术已有应用。物理法包括干燥、辐射、吸附法等，但在实际操作中仍存在很多问题，如干燥，吸附法成分较高，还不能真正彻底降解黄曲霉毒素的毒性，被吸附的毒素还可能二次释放；辐射法处理会使中药等农产品的成分在不同程度上受到破坏。化学法主要是使用硫磺、二甲基甲胺磷、磷化铝、吡咯苯类、咪唑类、硫氰酸类等试剂在熏蒸防霉、杀菌上取得了一定的成果，但因残留、公害、抗性等问题使用受到限制。因此，寻绿化学抑菌剂的替代品就成为了亟待解决的问题之一。植物精油及其活性成分源于自然，因其具有矫正异味、赋有香气、着等特点作为天然调味料，应用于食品等行业已有悠久的历史，能满足消费者对食品添加剂安全性的要求。植物精油，还具有抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗氧化、杀虫等多方面的生物活性，在食品、医药、农业、日化和生物农药等方面已经得到了广泛的关注。
4.阴香(cinnamomum burmanni)为樟科樟属多年生常绿乔木，主要分布在我国的中南部和东南部地区。阴香的皮、根、叶均可入药，并且还能作为香料食用。
5.因此，为了拓宽阴香叶精油的利用途径，开发绿的农产品防霉抑制剂是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉上的应用。
9.优选的：有效浓度为≧0.06ml/l。
10.本发明还提供了阴香叶精油在抗毒素累积上的应用。
11.优选的：毒素为afb1和ota。
12.优选的：阴香叶精油有效浓度范围为≧0.06ml/l。
13.优选的：当毒素为afb1时，阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.48ml/l；当毒素为ota时，阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.06ml/l。
14.本发明还提供了一种抗黄曲霉、黑曲霉或毒素累积的试剂，阴香叶精油的有效浓度为≧0.06ml/l。
15.优选的：当毒素为afb1时，阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.48ml/l；当毒素为ota时，阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.06ml/l。
16.本发明还提供了上述应用或上述试剂中阴香叶精油的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)取新鲜的阴香叶破碎；
18.(2)加入纯水，浸泡；
19.(3)水蒸气蒸馏提取，冷却，收集精油；
20.(4)将步骤(3)收集的精油除水，得阴香叶精油。
21.优选的：破碎的程度至0.2～2.0cm2以下；阴香叶和纯水的质量比为1:10～15；浸泡的时间为1～2h；提取的时间为4～10h；冷却至25～30℃；除水：加入适量无水硫酸钠。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用，取得的技术效果为本发明明确了阴香叶精油能够显著抑制黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长，对黄曲霉和黑曲霉中afb1和ota毒素的合成有较强的抑制作用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
24.图1附图为本发明提供的不同处理的菌落培养图。
25.图2附图为本发明提供的不同处理抑制黄曲霉和黑曲霉菌生长效果图，其中，a：黄曲霉；b：黑曲霉菌。
26.图3附图为本发明提供的不同处理黄曲霉和黑曲霉菌长至规定直径的天数示意图，其中，a：黄曲霉；b：黑曲霉菌。
27.图4附图为本发明提供的不同处理对afb1和ota积累的影响图(*；p《0.05；***，p《0.01)图，其中，a：afb1；b：ota。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明实施例公开了阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用。
30.实施例中，未提及的原料、设备、为市售，未提及的实验步骤为常规实验步骤，例
如：阴香叶采自中国医学科学院药用植物研究所海南分所南药园，经吴明松助理研究员鉴定为阴香的新鲜叶片。黄曲霉菌株(aspergillus flavus，编号：cgmcc 3.4410)和黑曲霉菌株(aspergillus niger，编号：item-5222)，购买于中国微生物菌种保藏管理中心(北京)。黄曲霉毒素b1(afb1)，黄曲霉毒素b1内标([
13c17
]-afb1)，赭曲霉毒素a(ota)，赭曲霉毒素a内标([
13c20
]-ota)购自pribolab公司(新加坡pribolab公司)乙酸乙酯(谱纯，fisher公司)，无水硫酸钠(分析纯，西陇化工股份有限公司)，pda培养基(北京索莱宝科技有限公司)。
[0031]
agilent 7890a气相谱仪，5975c四极杆质谱仪，7683b自动进样器(美国安捷伦公司)；waterstqd三重四极杆串联质谱仪(美国waters公司)；mili-q纯水仪(美国，millipore公司)；xs105du十万分之一电子天平(上海托利多有限公司)；高压灭菌锅(上海实业有限公司)；恒温培养箱(上海一恒科学仪器公司)；光学显微镜(ix51，olympus，tokyo，japan)。
[0032]
黄曲霉菌的复苏和孢子悬浮液的配制
[0033]
用酒精棉球擦拭黄曲霉和黑曲霉冻干粉菌种管外壁，点燃酒精灯，将菌种管封口一端置外焰处烧灼，用无菌滴管吸取适量灭菌水(121℃，30min)滴在菌种管封口使其迅速冷却而炸裂。加入1ml灭菌水于菌种管内，充分溶解后，将全部菌液接种至pda培养基的无菌培养皿中，盖上盖后，移入恒温培养箱，在温度28℃，相对湿度90％条件下，培养7d。
[0034]
黄曲霉菌和黑曲霉菌培养7d后，打开上盖，在黄曲霉和黑曲霉菌孢子的培养基表面缓缓加入2ml无菌水(0.1％吐温80)，用灭菌的接种环按顺时针轻轻将孢子刮入灭菌水中，完毕后将孢子悬液母液倒入15ml灭菌离心管中(内置无菌玻璃球)，手摇充分震荡，无菌脱脂棉过滤，得孢子悬浮液。取10μl母液用无菌水稀释100倍后用血细胞计数板和倒置显微镜观察计数，最后将母液分装稀释，调节浓度为106spores/ml，制得后期实验所用的黄曲霉和黑曲霉菌的孢子悬浮液。
[0035]
在此不再一一赘述。
[0036]
实施例1
[0037]
阴香叶精油制备
[0038]
取新鲜的阴香叶剪碎(约为0.5cm2)，加入10～15倍质量的纯水，浸泡1h，水蒸气蒸馏提取6h，冷却至室温(25～30℃)，收集精油，加入适量无水硫酸钠除水，得挥发油，备用。
[0039]
实施例2
[0040]
阴香叶精油抗菌实验
[0041]
准确量取15ml已高温灭菌的pda培养基置于无菌的培养皿中，待培养基冷却凝固后，将2μl黄曲霉菌和黑曲霉菌孢子悬浮液(106spores/ml)，接种于培养基中央，将无菌滤纸片粘贴在培养皿上盖，取适量的阴香叶精油滴在无菌纸上，待吸收后，将培养皿盖上盖，对照组使用无菌水，培养皿用封口膜封口，放置于恒温(28℃)培养箱中培养(黄曲霉菌培养9d，黑曲霉菌培养7d)，每个实验平行3次。每天测量菌落的直径，采用十字交叉法测定2次，结果取平均值。
[0042]
菌丝抑制率(％)＝(dc-dt)/dc
×
100，其中dc和dt分别为对照组和处理组的菌落直径的平均值。
[0043]
结果表明：
[0044]
通过上述的熏蒸法评价阴香叶精油对黄曲霉菌和黑曲霉菌的抑制作用，为了便于抑菌效果的比较，将空白对照组菌落直径为7.5
±
0.2cm的天数为最终的培养天数，故黄曲霉菌的培养天数为9d，黑曲霉的培养天数为7d。阴香叶精油对黄曲霉和黑曲霉菌丝体的抑制作用见图1和图2。
[0045]
由图1可知，不同处理的阴香叶精油对黄曲霉菌和黑曲霉菌的菌落有显著的抑制作用。
[0046]
由图2a可知，随着精油量的增加，黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长受到了不同程度的抑制，其菌丝的生长与精油的浓度剂量呈现依赖性。精油量大于20μl(约0.24ml/l)时，对黄曲霉的抑制作用显著增强；精油量大于40μl(0.48ml/l)时，在结束培养时未观察到任何黄曲霉菌丝体的生长。精油量为5μl(0.06ml/l)，10μl(0.12ml/l)，20μl(0.24ml/l)，30μl(0.36ml/l)，40μl(0.48ml/l)，黄曲霉菌丝体的抑制率分别为10.05％，18.91％，60.31％，73.15％，92.59％。
[0047]
由图2b可知，阴香叶精油对黑曲霉有更强的抑制作用，精油量大于30μl(0.36ml/l)时，在结束培养时未观察到任何黑曲霉菌丝体的生长。精油量为5μl(0.06ml/l)，10μl(0.12ml/l)，20μl(0.24ml/l)，30μl(0.36ml/l)，黑曲霉菌丝体的抑制率分别为：15.90％，34.74％，67.18％，81.92％。结果表明阴香叶精油能够显著抑制黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长。
[0048]
实施例3
[0049]
阴香叶精油对afb1和ota的抑制作用
[0050]
实验中为了考察阴香叶精油对黄曲霉菌、黑曲霉菌所产主要真菌毒素afb1和ota的抑制作用，待不同处理的黄曲霉和黑曲霉菌的菌落直径长至7.5
±
0.2cm时，按照“毒素检测样品制备方法”制备样品溶液，uplc-ms/ms进行检测。
[0051]
其中，毒素检测样品制备方法
[0052]
待培养结束后，将培养皿中的所有内容物溶解于50ml的乙腈-水(84；16，v/v)溶液中，均质10min，超声(功率500w，频率40khz，室温)提取30min，过滤，滤液4℃离心15min(13000rmp/min)，取上清液过0.22μm的滤膜，uplc-ms/ms检测afb1和ota的含量。
[0053]
产毒抑制率：y＝(a-b)/a
×
100，其中a为对照组中真菌毒素的含量；b为处理组中真菌毒素含量。
[0054]
uplc-ms/ms条件
[0055]
waters acquity behc18谱柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm；waters corp.)，柱温40℃。流动相为甲醇(含0.1％甲酸，a)和水(2mmol/l甲酸铵，b)，流速为0.3ml/min，洗脱程序为0～1min，25％a；2～4min，25％～45％a；4～6min；45％～60％a；6～14min；60％～95％a；14～19min，95％a；19～20min，95～25％a。进样量：2.0μl。
[0056]
电喷雾子离子源正离子模式(esi
+
)，毛细管电压为3.5kv，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流速为500l/h，锥孔反吹气流速为50l/h，多反应监测模式采集(mrm)。afb1和ota的定量离子对分别为：313.2》241.1，404.2》105.1。
[0057]
由图3可知，不同阴香叶精油处理的黄曲霉和黑曲霉菌落直径长至7.5
±
0.2cm的天数差异明显。空白组和不同量阴香叶精油处理后afb1和ota的含量，结果见图4。
[0058]
由图可知，阴香叶可以显著抑制afb1的合成，不同处理间afb1的含量达到显著水平
(p《0.05)。精油对afb1的抑制作用呈现剂量的依赖性，随着浓度的增加，afb1的含量也在显著的降低，不同处理的afb1合成抑制率也呈上升趋势，精油量为40μl(0.48ml/l)时，抑制为47.05％。
[0059]
阴香叶精油对黑曲霉菌中ota的合成有显著的抑制作用，不同处理间ota的含量达到极显著水平(p《0.01)。精油量为5μl(0.06ml/l)，10μl(0.12ml/l)时，毒素的抑制率分别为81.18％和95.17％，20μl(0.24ml/l)时已检测不到ota，可以完全抑制ota的合成(抑制率100％)。
[0060]
上述结果表明阴香叶精油对黄曲霉和黑曲霉中afb1和ota毒素的合成有较强的抑制作用。
[0061]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0062]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉上的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，有效浓度为≧0.06ml/l。3.阴香叶精油在抗毒素累积上的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述毒素为afb1和ota。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阴香叶精油有效浓度范围为≧0.06ml/l。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，当毒素为afb1时，所述阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.48ml/l；当毒素为ota时，所述阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.06ml/l。7.一种抗黄曲霉、黑曲霉或毒素累积的试剂，其特征在于：阴香叶精油的有效浓度为≧0.06ml/l。8.如权利要求7所述的试剂，其特征在于，当毒素为afb1时，所述阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.48ml/l；当毒素为ota时，所述阴香叶精油的有效浓度范围为≧0.06ml/l。9.权利要求1～6所述应用或权利要求7～8所述试剂中阴香叶精油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜的阴香叶破碎；(2)加入纯水，浸泡；(3)水蒸气蒸馏提取，冷却，收集精油；(4)将步骤(3)收集的精油除水，得阴香叶精油。10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述破碎的程度至0.2～2.0cm2以下；所述阴香叶和纯水的质量比为1:10～15；所述浸泡的时间为1～2h；所述提取的时间为4～10h；所述冷却至25～30℃；所述除水：加入适量无水硫酸钠。

技术总结

本发明公开了阴香叶精油在抗黄曲霉、黑曲霉和毒素累积上的应用。属于生物工程与农业产品深加工技术领域。提供了应用、试剂和制备方法。本发明明确了阴香叶精油能够显著抑制黄曲霉和黑曲霉菌丝体的生长，对黄曲霉和黑曲霉中AFB1和OTA毒素的合成有较强的抑制作用。和OTA毒素的合成有较强的抑制作用。和OTA毒素的合成有较强的抑制作用。