第42卷第1期中国高原医学与生物学杂志Vol. 42No. 1 2021年C H IN E S E HIGH ALTITU DE M E D IC IN E A N D B IO L O G Y2021
王琦\张立雪2，李淑桢、李长兴\吴佩峰\代冬芳“
(1.青海大学医学院，青海西宁810001;2.西北民族大学医学部，甘肃兰州730000)
摘要目的研究藏药二十五味鬼臼丸对围绝经期综合征（MPS)大鼠模型血清激素及其子 宫组织雌激素受体水平的影响。方法将雌性大鼠随机分为假手术组（Sham)、模型组（0VX)、雌二 醇组（0VX+E2)、二十五味鬼臼丸组（0VX+GJ)。术后2周时灌胃（假手术组和模型组予等体积生理 盐水，雌二醇组予戊酸雌二醇〇•lmg/kg，二十五味鬼臼丸组予二十五味鬼臼丸0.36g/kg)，隔日给药，连续12周。用EU SA法检测促卵泡生成素（FSH)、黄体生成素（LH)和雌二醇（E2)的水平；用RT-PCR及免疫组化法分别检测大鼠子宫组织中雌激素受体ct(ERa)、雌激素受体(3(ER(3)mRNA和 蛋白的表达水平。结果与Sham组比较，0乂\组£2表达水平下降（/5<0.05)^8只、111表达水平增 高（P<0. 05)，子宫ERa、ER(3mRNA和蛋白表达水平降低(f<0. 05)；用雌二醇和二十五味鬼臼丸干预 后，与0VX组比较，0VX+E2组及0VX+G J组E2水平增高 （P<0. 05)，FSH、LH水平降低（/*<0■05)，OVX+E2组子宫ERa、ERpmRNA和蛋白表达水平增高（P<0. 05)，OVX+G J组ERotmRNA和蛋白表达 水平无差异（户>0.05)，£11(31111^^及蛋白表达增高（户<0.05)。结论藏药二十五味鬼臼丸对MPS 大鼠模型血清激素及其子宫组织雌激素受体水平存在影响（选择性上调E R p的表达，对ERct无明显 影响，具有“选择性雌激素受体调节剂”作用），这种影响可能是二十五味鬼臼丸有效改善MPS的分子 机制之一。
关键词：二十五味鬼臼丸；围绝经期；雌激素受体；选择性雌激素受体调节剂
中图分类号：R310. 14 文献标识码:A
DOI：10. 13452/jki.jqmc.2021.01.008
Effects of Guijiu Pill of 25 ingredients on the levels of serum
hormones and estrogen receptor in the uterine tissue with
perimenopausal syndrome of rat model*
WANG Qi1,ZHANG Lixue2,LI Changxing1,LI Shuzhen1,WU Peifeng1,DAI Dongfang1*
(1. Medical Collegeof Qinghai University,Xining810006,China；
2.Northwest MinzuUniversity,Lanzhou 730000,China)
Abstract Objective To study the effects of Tibetan medicine Guijiu Pill of25 ingredients on the levels of serum hormones and estrogen receptors in uterine tissue with perimenopausal syndrome(PMS)of rat model.Methods Female rats were randomly divided into sham operation group(Sham),OVXgroup(OVX),estradiol group(0VX+E2),
※：青海省应用基础项目（2018-ZJ-730); * ：通信作者，硕士研究生导师，E-mail:***************
王琦（1994〜），女，汉族，河南籍，在读硕士研究生
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and Guijiu Pill of25 ingredients group(OVX+GJ).The drug was given by gavage 2 weeks after the operation(Sham operation group and OVX group were given equal volume of normal saline,estradiol group was given estradiol valerate 0.lmg/kg,and Guijiu Pill of25 ingredients group was given Guijiu Pill of25 ingredients 0.36g/kg)every other day for 12 weeks in a row.ELISA was used to detect the levels of follicle-stimulating hormone(FSH),luteinizing hormone (LH)and estradiol(E2);RT- PCR and immunohistochemical methods were used to detect estrogen receptor a (E R a),estrogen receptor(3(
ERp)mRNA and the levels of protein expression.Results Compared with Sham group,the expression of E2in OVX group decreased(P<0. 05) and the expression levels of FSH and LH increased(P<0. 05). The levels of ERa and ERpmRNA and protein in the uterus decreased(P<0. 05) ；after the intervention with estradiol and GuijiuPill of25 ingredients,the E2level of OVX+E2group and the OVX+GJ group increased(P<0. 05) compared with OVX group；the levels of FSH and LH decreased(P<0. 05) ；ERa,ERp mRNA in the uterus and protein expression levels increased in OVX+E2group(P<0. 05). ERa mRNA and the levels of protein expression in OVX+GJ group were not different(P>0.05). The levels of ER(3mRNA and protein expression increased(P<0.05). Conclusion The Tibetan medicine Guijiu Pill of25 ingredients has an effect on the levels of serum hormones and estrogen receptor in the uterine tissue of MPS rat models(selectively up-regulating the expression of ERp has no significant effect on ERa,which had the effect of“selective modulator estrogen receptor”.This effect may be one of the molec-ular mechanisms by which Guijiu Pill of25 ingredients can improve MPS effectively.
Keywords ：Guijiu Pill of25 ingredients；perimenopause；estrogen receptor；selective modulators of estrogen receptor
有研究发现，二十五味鬼臼丸对围绝经期综合 征（peri m enopausal syndrome，MPS)有良好的预防及
作用+3]，但机制不明。本研究以MPS大鼠模 型为研究对象，检测二十五味鬼臼丸对大鼠模型血 清激素的变化及子宫组织中雌激素受体（estrogen receptor，ER)亚型的表达的影响。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
3月龄SD雌性大鼠48只，体质量200〜220 g，由西安交通大学医学部实验动物中心所提供，动物 许可证号:SCXK(陕)2017-003。
1.1.2实验药物及试剂
戊酸雌二醇片（生产批号：201710BJ125)由拜 耳医药保健有限公司生产；二十五味鬼臼丸（国药 准字Z20140539)由青海省藏医院生产；大鼠雌二醇 (E2)ELISA试剂盒、黄体生成素（LH)ELISA试剂 盒、促卵泡素（FSH)ELISA试剂盒由江苏酶标生物 科技有限公司生产；TRIzol Reagent由Ambion公司 提供;PCR引物由TaKaRa公司提供;RNA提取试剂 盒、荧光定量PCR试剂盒由天根生化科技公司提供；p-actin、大鼠ER a、ER(3多克隆抗体由Abeam 公司提供；兔S P试剂盒由中杉金桥公司提供；
1.1.3实验仪器
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离心机由Eppendorf公司提供；多功能酶标仪由 BioRad公司提供；Nanodrop(2000)由Thermo公司提 供;Light Cycler96实时荧光定量PCR仪由Roche公 司提供；荧光显微镜由Nikon公司提供。
1.2实验方法
1.2. 1分组、造模及给药方法
将大鼠适应性饲养一周后，随机分为假手术组 (Sham)、模型组（OXV)、雌二醇组（0VX+E2)、二十 五味鬼臼丸组（OVX+GJ)，每组12只。根据苗明三 等[4]提供的方法制备MPS动物模型，Sham组切除 卵巢旁等体积脂肪组织，不摘卵巢，其余各组结扎血 管后完整切除双侧卵巢。术后给予青霉素(20万U/只，肌肉注射，每天1次，连续3天）。术后第5天对动 物逐只进行阴道涂片，连续5天若动物不出现动情期 反应则表示造模成功，0VX组有10只，0VX+ E2和 OVX+GJ组各有9只造模成功。术后2周开始给 药,0VX+E2组予戊酸雌二醇（0.lmg/kg，蒸馏水配 成0.01 mg/m L的混悬液），OVX+ G J组予二十五味 鬼臼丸（360mgAg，蒸馏水配成0. 36g/m L的混悬 液）；Sham组和0VX组予等体积生理盐水（灌胃，持 续给药12周）。给药完成后于腹主动脉取血并分 离获得上清液，取部分子宫组织置4%多聚甲醛液 固定，取部分子宫置液氮保存。
1.2.2血清FSH、LH、E2含量检测方法
严格按照试剂盒说明书测定血清FSH、LH、E2含量，将酶标仪测得的〇D值绘制标准曲线并计算 样本浓度。
1.2. 3子宫ERct、ERpmRNA的表达检测方法
取约100 m g子宫组织，按照RNA提取试剂盒 说明提取总RNA、反转录试剂盒说明将RNA反转 录成cDNA，用核酸分析仪检测RNA浓度及纯度后 表1
Table 1检测吸光度。实时荧光定量PCR反应条件:42 t, 15 min;95 X!，3 min，共 40 个循环。以p-actin为内 参基因，记录各样本C t值。运用2_AAa相对定量法 计算目的基因相对表达差异值，每个样本的ACt=
匸1目的基因—Ct内参，AACt= ACt实验组-*ACt对照组，基因序列见表1。
R T-P C R弓丨物序列
Primer sequences of RT-PCR
Gen e P r i mer(5,-3,)Primer( 3’-5’）Product (bp) E R a5,-C A C T C G A T C A T T C G A G C A C A T T C-3,5，-A A G G G T C A T G G T C A T G G T C A G-3f191
E R p5，-G C T G C T G G A T G G A G G T G C T A A-3' 57-T C G C C A G G A G C A T G T C A A A G-3,150
p-actin 5,-C C T A A G G C C A A C C G T G A A A A-3f5，-C A G A G G C A T A C A G G G A C A A C A C-3f103
1.2.4 ERa、E R p蛋白表达检测方法
将5 |xm子宫石蜡切片烤片（6(n：，2h)，用二甲 苯脱蜡、梯度乙醇水化、PBS(PH7.4)在脱摇床上 洗涤（3次，每次5min)。以高压行抗原修复后，滴 加一抗 ER a(1:200)、ERp(1:200)孵育（4丈）过夜。次日用PBS冲洗（3次，每次3m in)后加人生物素标 记的二抗，室温孵育（30m in)，用PBS冲洗（3次，每 次3min)。每组切片在相同视野下（X200)选取3 张，用Image 6.0软件计算阳性结果灰度平均值。1.3统计学方法
应用SPSS25. 0统计学软件，对于满足正态性 表2检验的结果以表达，组间比较采用单因素方差 分析，对于方差不齐的结果，以M(P25，P75)表达, 组间比较采用Welch检验；多重两两比较采用LSD-« 检验。P<0. 05表示差异具有统计学意义。
2.结果
2. 1二十五味鬼臼丸对MPS大鼠模型血清FSH、LH、E2表达的影响
结果显示，与Sham组比较，0VX组大鼠血清E2 降低（P<〇.〇5)，而 LH、FSH 增高（P<0.05)。与 0VX组比较，0VX+E2组和0VX+G J组血清E2增 高（/><0•05 ),LH、FSH降低（P<0.05)，见表 2。
二十五味鬼臼丸对大鼠血清E2、LH、FSH水平的影响结果（x±s)
Table 2Effects of Guijiu Pill of 25 ingredients on the levels of E2, LH and FSH in the serum of rats (jc±s) group n E2(ng/L)L H(I U/L)F S H(I U/L) S h a m12116.23±14.55 1.49±0.64 1. 10±0. 46 o v x1068.31±7.22* 3.57±0. 76* 2. 44±0. 38* o v x+e2999.74±8. 87*2. 20±0. 60# 1.54±0. 55# O V X+G J980. 23±9.59# 2. 80±0. 54# 1.91±0. 36# F-37. 12417.09314.955
P-<0.001<0.001<0.001
* ：与假手术组比较，P<〇.〇5;#：与模型组比较，P<〇.〇5
2.2二十五味鬼臼丸对MPS大鼠模型子宫ER a、ER(3mRNA表达的影响
结果显示，0VX组ERamRNA、ERpmRNA表达 低于Shan组（R O.05)，0VX+E2组表达高于0VX组 (P<0. 05)。与 0VX组比较，0VX+GJ 组 ERamRNA 表达差异无统计学意义(P>〇.〇5)，ER(3mRNA表达升高(P<0.05)，见表 3。
2.3 二十五味鬼臼丸对MPS模型大鼠子宫ERa 和ER(3蛋白表达的影响
免疫组化结果显示，E R a在Sham组主要定位 于子宫内膜腺上皮细胞，ER(3在除0VX组以外的 各组大鼠子宫的腺上皮中均有表达，见图1。与
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Sham组大鼠比较，O V X组ERa、E R p的蛋白表达水 OVX+GJ组ER«表达未见统计学差异(P>0.05)，ERp 平下降（尸<0.05)。给药12周后，与O V X组比较，的蛋白表达水平增高(P<〇.〇5)，见表4。
OVX+E2组ERa、ER(3的蛋白表达水平增高(P<0.05)，
表3 各组子宫ERa、ERpmRNA相对表达量（x m)
Table 3 Relative expression of ERa and ERpmRNA in uterus in the each group(x±s)
group n ERa ERp
Sham121.00±0. 26 1.00±0. 13
OVX100. 17±0. 02*0.08±0.02*
ov x+e29 1.63±0.03#0.48±0. 12*
OVX+GJ90. 52±0. 080. 28±0. 08#
F-34. 92749.722
P-<0.001<0.001 * ：与手术组比较，p<0. 05;#：与模型组比较，p<0. 05
Sham OVX 0VX+E2OVX+GJ
图1二十五味鬼臼丸对子宫组织中ER«、E R p蛋白表达的影响图（X200)
Figure 1Effects of Guijiu Pill of 25 ingredients on the protein expression of ERa and ERp in the uterine tissue ( x200) 表4 各组子宫E R a、E R p蛋白表达量
Table 4 Results of protein expression of ERa and ERp protein in the uterine tissue in each group group n ERa ERp
Sham12157.22±12.4850. 73±6.01
OVX1053. 24土5. (XT22. 63±3.07*
o vx+e29150. 30±9. 60#91.34±10.60#
OVX+GJ963. 11 ±4. 7639. 87±6. 22#
F-124. 56751.995
P—<0.001<0.001 * ：与假手术组比较，p<0. 〇5;#：与模型组比较，p<0. 05
3.讨论 进而影响受体配体复合物转录的活性[5]。SERMs
E R是类固醇激素受体超家族的成员之一，能与 雌激素特异性结合，其亚型有和ERp，前者主 要分布在子宫、乳腺、膀胱、脑、垂体、卵巢，后者分布 于心脏、骨、前列腺、唾液腺、睾丸等。“选择性雌激 素受体调节剂 ”（selective estrogen receptor modula-t〇rs，SERMs)是指对ERa或E R p有激动作用而对 另一亚型无作用的药物，其选择性的关键是SERMs 与E R形成复合体与蛋白联合调解因子相互作用，的激动作用可通过转录激活因子1( activating transcription factor,AF- 1)路径激活基因转录分子机制 来实现，SERMs拮抗雌激素作用是通过其与KR竞 争性结合，阻止或抑制基因转录的辅调节蛋白因子 与转录激活因子 2(activating transcription factor，AF-2)表面的结合而实现。鬼臼与哺乳动物的类固醇激素 17p-雌二醇是具有相似结构的多羟基化合物，因此 在体内能与E R结合。研究发现[6_7]，鬼臼类木脂素
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对E R p的亲和力髙于ER a，对E R a的亲和力约为 内源性雌激素的4%，对E R p的亲和力约为内源性 雌激素的87%；在转录水平发现，其对ER(3的转录 激活作用较E R a强1000倍。因此，推测ER(3可能 是鬼臼类木脂素发挥作用的靶点。MPS最早表现 为卵巢功能衰退，继而表现为下丘脑-垂体功能退 化、激素水平改变（E2，FSH,LH)，使其分泌抑制垂 体的因子减少，导致下丘脑-垂体负反馈功能障碍，继而使下丘脑-垂体-卵巢轴失衡，影响植物神经中 枢及其支配下的各脏器功能，出现一系列不同程度 的躯体症状〜9]。
本研究中的MPS模型大鼠血清E2表达水平降 低，FSH、LH表达水平增高;ER a、ERpmRNA及蛋白 水平下降。本研究结果与Katherine等[1~的结论一致。用二十五味鬼臼丸对模型大鼠连续干预12周 后，血
清E2表达水平增高、FSH、LH表达水平降低，说明二十五味鬼臼丸可有效降低因卵巢切除而引起 的LH、FSH增高，这对于调节绝经后内分泌紊乱具 有重要意义；RT-PC R结果显示，大鼠子宫组织中 ERconRNA水平的表达无明显上调，而E R p的表达 上调；免疫组化研究表明，ERct、ER p可定位于子宫 内膜腺上皮细胞、间质细胞及平滑肌细胞，与模型组 组比较，二十五味鬼臼组的E R p染强度明显大于 ERa，本研究与唐雨晴等[11]的研究结果一致，说明 二十五味鬼臼丸在大鼠子宫组织中与E R p的亲和 力较高，通过提高ER(3表达水平，改善MPS大鼠激 素水平。
本研究结果显示，二十五味鬼臼丸对MPS大鼠 血清激素及子宫组织E R p具有调控作用，表现出 “选择性雌激素受体调节剂”作用，这可能是其防治 绝经后MPS的作用机制之一。
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修回日期2020-11-5
(责任编辑：陈苽）
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