(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610260677.8
(22)申请日 2016.04.25
(66)本国优先权数据
201510909264.3 2015.12.10 CN
(71)申请人 中国农业大学
地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
(72)发明人 孟庆勇 张玉英 刘春城 王金金
马庆伟 柳春霞 王瑾瑾 林燕
(74)专利代理机构 北京卫平智业专利代理事务
所(普通合伙) 11392
代理人 董琪
(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
A23C 9/00(2006.01)
(54)发明名称
其用途
(57)摘要
本发明公开了一种用于确定奶牛β-酪蛋白
基因多态性位点(SNP)的引物系统或组合物。基
于该引物系统或组合物所制备的产品，可以通过
检测奶牛β-酪蛋白基因多态性位点，筛选出具有
编码蛋白质β-酪蛋白A2基因的奶牛，从而为专产
更为优质健康的A2牛奶的奶牛的筛选和相关
利用提供了指导。权利要求书2页 说明书23页序列表3页 附图16页CN 105861671 A 2016.08.17
C N 105861671
A
1.一种用于核酸质谱检测奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下：
。
2.一种用于核酸质谱检测奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的引物组，其序列如下：
。
3.权利要求1-2所述的引物组，其中，延伸引物及延伸产物的分子量如下：
。
4.权利要求1-2所述的引物组，其中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5’端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基，更优选10bp的tag：ACGTTGGATG。
5.权利要求1-4所述的引物组，其中，上述延伸引物的5’端也可以增加作为接头的碱基序列。
6.权利要求1-5所述的引物组所制备的用于确定奶牛中是否存在β-酪蛋白A2/A1基因的核酸质谱检测产品。
7.权利要求6的检测产品，其中，该检测产品为检测试剂盒，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：权利要求1-5所述的PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：权利要求1-5所述的延伸引物，耐高温的单碱基 延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
8.利用权利要求1-7所述的引物组、检测产品或试剂盒，用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因的方法，步骤包括：
(1)PCR反应：使用所述PCR引物，在一个反应体系内，得到含扩增目标区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用所述延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR 产物进行单碱基延伸；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测，得到不同SNP位点延伸产物的核酸谱图；
(6)将得到的不同SNP位点延伸产物的核酸谱图，经过质谱仪配套软件分析后，确认SNP 位点的碱基，从而判定该样本的基因型；
其中，用于奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2(8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型；和/或
A2(AC61)：[G/A]，A碱基代表A2型，G碱基代表A1型。
9.权利要求8的方法，其中用于鉴定奶牛β-酪蛋白A2/A1基因鉴定的SNP位点为：CSN2 (8101)：[C/A]，C碱基代表A2型，A碱基代表A1型。
10.一种生产β-酪蛋白A2牛奶的方法，步骤包括：
(1)根据权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，或权利要求8-9的鉴定方法，确定奶牛的β-酪蛋白A2/A1基因分型；
(2)选择只具有编码β-酪蛋白A2基因的奶牛；
(3)对筛选的奶牛进行挤奶。
11.权利要求10的方法，其中步骤(1)可以是针对奶牛胚胎、幼体或成体；和/或，
在步骤(3)之前包括对奶牛进行繁育直至生产或/及形成所需要的生产种的步骤；和/或，
在步骤(3)之后包括对奶进行加工制成奶制品的步骤(4)。
12.一种通过权利要求1-5的引物组，或权利要求6-7的检测产品，用于制备奶牛筛选、繁育中进行联合检测的产品。
13.权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛为中国荷斯坦奶牛。
14.权利要求1-12所述的引物组、检测产品和方法，其中所述奶牛的DNA可以从含有有核细胞的任何组织中得到，该组织优选为该奶牛的血液、精液、毛发或奶。
检测奶牛β-酪蛋白基因SNP的引物组合物及其用途
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因的检测方法，具体而言，即利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对奶牛的β-酪蛋白基因进行检测，确定该奶牛是否具有β-酪蛋白A2蛋白基因或者β-酪蛋白A1蛋白基因，以及它们产生含β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2牛奶的能力，涉及筛选专产β-酪蛋白A2牛奶的奶牛的筛选方法。
背景技术
[0002]牛乳蛋白主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，酪蛋白中又分为β-酪蛋白(β-CN)、K-酪蛋白(k-CN)和α-酪蛋白(α-CN)，其中，β-酪蛋白约占蛋白质总量的30％，且广泛存在于各种奶制品中，是氨基酸的重要来源，能参与矿物质转运，并且可被分解成相对分子质量更小的生物活性肽，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进其消化吸收。
[0003]牛奶中的β-酪蛋白有两个主要的变异型，称为A1和A2，此外，尚有一些罕见的亚变异型(如A3等)。其中，A2-β酪蛋白是现代奶牛β-酪蛋白的天然原型。最初，所有家养的牛只含有A2型β-酪蛋白，后来因自然基因突变，出现了A1蛋白质的变体，即今天全球普遍存在的A1型牛奶β-酪蛋白。A1型与A2型β-酪蛋白的区别在于第67位的氨基酸。A1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(BCM-7)。而A2型的第67位为脯氨酸，其无法裂解。
[0004]现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，并通过阿片受体影响全身和细胞活动。此外，BCM-7和其他β-酪蛋白衍生物为阿片受体的强效外源性激动剂—外啡肽，其中与μ受体的亲合力最大。因此，BCM-7可能影响多个器官/系统的活动，尤其消化系统和免疫细胞。此外，BCM-7也可能与婴幼儿的各种疾病有关，如，Ⅰ型糖尿病和呼吸功能障碍，消化功能疾病，促使产生肛瘘，免疫功能疾病，并影响中枢神经系统活动。
[0005]牛奶与母乳的蛋白质成分差异颇大。如，母乳主要含乳清蛋白，酪蛋白：乳清蛋白约为40:60(泌乳早期10:90，泌乳后期50:50)，而牛奶的酪蛋白：乳清蛋白则高达80:20。比较而言，人乳中的β-酪蛋白与牛奶中的A2型β-酪蛋白结构更为相似，人β-酪蛋白同样不会产生BCM-7，不会发生由BCM-7导致的负面影响。因此，基于与母乳更为接近、同样不产生BCM-7的A2型β-酪蛋白制成的配方奶因其不含A1型β-酪蛋白，更有利于促进婴幼儿的生长发育。筛选专产A2型β-酪蛋白的奶牛进行挤奶并用于生产只含A2型β-酪蛋白的高端优质配方奶对于改善目前的国产奶粉品质具有重要作用。
[0006]另外，乳业是一个国家发达程度和食品消费现代化水平的重要标志，其发展对优化农业结构，促进畜牧业产业升级，增加农民收入，提高国民身体素质，都具有重要意义。当前我国的乳业正处于从传统乳业向现代乳业转型的关键时期，未来乳业的发展将从注重数量型向质量型升级。由于并不是所有的奶牛都能产出只含纯净A2型β-酪蛋白而不含A1型β-酪蛋白的牛奶，因此，A2型β-酪蛋白的奶源非常稀有。现今，西方的奶牛中只有约30％的奶牛为纯正的A2奶牛，由其所产的牛奶只含100％纯净A2型β-酪蛋白。如果我国能掌握A2β-酪
蛋白的奶源的鉴定技术，根据我国庞大的奶牛牲畜资源，从中筛选出纯产A2型奶的奶牛，从而发展中国特的A2奶制品加工产业，对于提升中国的乳业行业发展水平具有不可估量的作用。
[0007]对此，中国发明专利申请03815808，发明名称“改变牛奶中脂肪酸组成的方法”公开了一种通过检
测畜中各个奶牛的第67位脯氨酸的DNA来筛选含有在67位上带有组氨酸的β-酪蛋白的牛奶的奶牛的方法。该方法包括：①提取DNA并测定牛奶的脂肪酸组成；②将用于脂肪酸分析的样品进行气相谱法进行分析，并将谱图上的峰面积进行积分以定量每个脂肪酸的水平，通过将每个峰的保留时间与已知标准相比较来确定每种脂肪酸的身份；③使用广义线性模型比较基因型之间的差异。然而，该方法需要反复筛选谱参数进行比较，同时涉及到建立模型及数学分析等过程，因此过程非常繁琐，耗时耗力，难以适应中国大规模的种畜筛查。
[0008]中国发明专利申请03817455.3，名称“动物基因分型方法”公开了确定牛是否编码β-酪蛋白A2基因或者是编码β-酪蛋白A1基因的方法，采用的不同类型的测序方法，如，寡核苷酸连接测定法，焦磷酸测序。实验结果显示，该方法所使用的测序方法能够较好地完成奶牛基因分型情况。然而，该发明中所涉及的位点AC61仍然只能适用传统的PCR测序法，在适用于最新一代的检测技术时存在一定的误差。
[0009]另外，以上技术一直独家保留在新西兰A2有限公司，同时要甄选出基因纯正的A2奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要极高的技术和专业的质量检测系统。目前该公司实施的技术壁垒和A2奶牛种质资源的封锁，势必又进一步导致了A2型β-酪蛋白的珍稀性。我国奶粉进口对新西兰依存度最高。2002～2011年，进口新西兰奶粉由7.04万t增加到36.71万t，占奶粉进口量的比例由62.98％提高到80.79％。其中，进口全脂奶粉15.74万t，同比增长384.4％，在我国市场占有率由2008年的70.5％提高到2009年的89.3％。进口脱脂奶粉4.65万t，同比增长156.7％，市场占有率达到66.0％，由此可见新西兰在我国奶
粉进口来源国中形成绝对垄断地位。其中，A2公司是全球第一也是唯一一家掌握A2型β-酪蛋白的商业化牛奶的商业化公司，垄断了我国高端婴幼儿奶粉市场。因此，“有恃无恐”地不断涨价。从2006年7月至2010年2月，洋奶粉已经先后6次上调价格，其中单次最高涨幅超过20％。即使受欧洲债务危机的影响，在欧盟地区的多个国家原料奶和“洋乳品”售价不断下跌的状况下，国内市场洋乳品价格仍居高不下。近两年，“洋奶粉”涨价时间间隔缩短，平均每季提价1次，每次涨价幅度为10％～15％。据有关资料显示，一罐800g的雀巢超级能恩1段婴儿奶粉国内售价340元，而通过海外代购渠道，其价格仅为185元；德国特福芬有机婴幼儿奶粉2段在其上价格为9.95欧元，约合81元人民币，仅仅为内地销售价格的1/4，而有的“洋奶粉”国内售价约为生产国当地卖价的3倍。
[0010]然而，自从加入WTO以后，我国乳制品关税趋于降低，非关税贸易壁垒进一步削减，而乳制品进口主要来源地却不同程度地存在倾销和补贴。针对这种国际贸易中的不公平行为，我国除了运用世贸组织规则允许的反补贴、反倾销和保障措施来维护本国乳业的利益，大力提升我国奶制品产量及质量成为振兴和发展我国乳制品行业所刻不容缓的任务。为此，发明人尝试与国内乳制品行业合作，通过建立A2奶牛饲养产业以及A2奶制品加工，为中国乳制品行业的复兴探索新的道路。
[0011]目前，对于β-酪蛋白的研究表明，β-酪蛋白(β-CN)的编码基因CSN2全长8.5kb，共
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