一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁及其制备方法

1.本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁及其制备方法。

背景技术：

2.肝脏在人体的新陈代谢中起着重要的作用。肝脏疾病主要是由过度饮酒、病毒和化学物质所引起的。过量饮酒导致的酒精性肝病成为当今世界日益严重的公共卫生问题，全世界每年约有330万人死于过度饮酒，约占总死亡人数的5.9%，过度饮酒可引起许多代谢性疾病。正常情况下，酒精通过胃和小肠吸收，然后通过血液进入肝脏，在肝脏中，乙醇通过乙醇脱氢酶被氧化成乙醛，乙醛经乙醛脱氢酶代谢成乙酸，经尿道排出体外。大量或长期饮酒会超过肝脏的解毒能力，导致酒精和乙醛的代谢物在血液和肝脏中积累，而肝脏中过量的乙醇和乙醛的氧化代谢物激活了微粒体细胞素p450系统，增加了细胞素p4502e1的活性，产生大量活性氧（ros）。因此，氧化损伤被认为是饮酒的主要危害之一，也是慢性酒精性肝损伤（ald）发病机制中的关键靶点。
3.橄榄营养丰富，果肉内含蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素c以及钙、磷、铁等矿物质，其中维生素c的含量是苹果的10倍，梨、桃的5倍，含钙量也很高，且易被人体吸收，尤适于女性、儿童食用。冬春季节，每日嚼食两三枚鲜橄榄，可防止上呼吸道感染，故民间有“冬春橄榄赛人参”之誉。国内外研究资料表明橄榄果实中还含有滨蒿内酯，东莨菪内酯，（e）-3，3-二羟基-4，4-二甲氧基芪，没食子酸、逆没食子酸、短叶苏木酚、金丝桃苷和一些三萜类化合物，挥发油和黄酮类等化合物。据《本草纲目》记载，橄榄：生津液、止烦渴，治咽喉痛，咀嚼咽汁，能解一切鱼蟹毒。
4.益生菌是对人体有益微生物的总称。鼠李糖乳杆菌，植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，戊糖片球菌，乳酸片球菌是已经实现商业化生产的益生菌，益生菌能够调节肠道菌，调节宿主健康，对机体健康发挥着重要调控作用。
5.本发明公开了一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁及其制备方法，该方法以橄榄汁和益生菌为原料，将橄榄果实榨汁后，通过混合益生菌发酵，获得具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁，经动物实验验证，橄榄益生菌发酵物能降低小鼠血清中谷草转氨酶ast和谷丙转氨酶alt活力，降低甘油三酯tg、总胆固醇tcho含量，降低肝脏中tg和丙二醛mda含量，提高谷胱甘肽gsh含量，明显改善了肝脏组织损伤，说明该发酵物对酒精性肝损伤小鼠有保护作用。本发明可促进橄榄的开发利用，提升橄榄的附加值。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁及其制备方法，橄榄汁经益生菌发酵，所得发酵物对酒精性肝损伤具有保护作用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁的制备方法，将橄榄果实榨汁处理后，过
滤，再经巴氏杀菌获得橄榄汁，然后将益生菌菌株接种到橄榄汁发酵，制得具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁。所述益生菌菌株包括：鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌。
8.上述一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁的制备方法，具体包括如下步骤：（1）橄榄汁的工艺流程a．选择无病虫害的橄榄果实，除去杂叶和其他杂质；b．将选好的橄榄果实清洗干净；c．用沸水热烫3~5分钟，去除表皮蜡质层，使果肉组织软化；d．破碎去核，采用螺旋榨汁机榨汁；e．榨汁后将果汁和果渣过滤，制得橄榄汁；f．将橄榄汁巴氏杀菌；g．用流动水迅速冷却至室温后罐装。
9.（2）益生菌发酵橄榄汁将甘油保种的鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌，分别按2%接种量接种于灭菌的mrs液体培养基中，于37 ℃恒温培养箱静置培养24 h，反复活化两次使菌株充分恢复活力；取菌液离心弃掉上清液，加入无菌生理盐水重悬菌体，反复洗涤两次，通过菌落计数调整菌液浓度为10
6 cfu/ml，然后按1:1:1:1:1将这5种菌液混合制得混合菌悬液；将步骤（1）制得的橄榄汁用无菌水稀释1倍，加入2wt%的葡萄糖作为碳源，按照10%（v/v）的接种量接入混合菌悬液，于37 ℃静置发酵24 h，得到益生菌发酵橄榄汁。
10.一种上述方法制备所得的益生菌发酵橄榄汁。
11.一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁，所述发酵橄榄汁中含有上述益生菌发酵橄榄汁发酵物和益生菌菌体。益生菌发酵橄榄汁经过调配，可用于制成益生菌发酵橄榄汁饮品，也可以经过冻干制成益生菌发酵橄榄汁固体饮料。
12.对本发明的制备方法和原理作详细说明：据《本草纲目》记载，橄榄：生津液、止烦渴，治咽喉痛，咀嚼咽汁，能解一切鱼蟹毒。橄榄营养丰富，果肉内含蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素c以及钙、磷、铁等矿物质。果可生食或渍制，药用治喉头炎、咳血、烦渴、肠炎腹泻。
13.鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）：鼠李糖乳杆菌能调节肠道菌，提升机体免疫力，预防和腹泻。鼠李糖乳杆菌在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道，而其他大部分益生菌种在进入肠道前就已经因胃酸和胆汁的作用而死亡。
14.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）：植物乳杆菌能抑制病原菌，调节肠道微生态平衡。也有证据表明植物乳杆菌可诱导免疫反应，可保护人体免受传染病的侵害。植物乳杆菌的另一个主要优点是其有助于修复肠壁的能力。它通过使用甘露糖特异的粘附作用来做到这一点，这使其可以与革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌株竞争受体位点。
15.戊糖片球菌（pediococcus pentosaceus）：戊糖片球菌，最适生长温度35 ℃，最高生长温度42~45 ℃。分布于麦芽汁及发酵植物材料中，常应用于食品发酵中。
16.嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus）：已有研究表明，嗜酸乳杆菌可以顺利
通过胃肠高酸、高胆汁盐环境到达肠内，可作为食补因子在人体肠道中正常繁殖，形成优势菌，充分发挥促进机体健康特性，起到整肠作用。
17.乳酸片球菌（pediococcusacidilactici）：产酸，调节胃肠道菌，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有颉颃作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。
18.混合益生菌发酵橄榄汁，一方面益生菌利用橄榄汁营养物质进行增殖，另一方面，橄榄汁在益生菌的发酵作用下，产生益生菌代谢产物。发酵液中含有橄榄和益生菌发酵的有益代谢产物，可以调节肠道菌，通过肠-肝轴，改善酒精性肝损伤。
19.本发明的有益之处：1．本发明采用福州特水果橄榄为原料，因地制宜促进特水果产业的发展。
20.2．本发明采用的益生菌发酵，安全可靠，适于工业化生产。
21.3．本发明为一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁制备方法，该方法制备的产品能降低小鼠血清中谷草转氨酶ast和谷丙转氨酶alt活力，甘油三酯tg、总胆固醇tcho含量，降低肝脏中tg和丙二醛mda含量，提高了肝脏中谷胱甘肽gsh含量，对酒精肝损伤有辅助保护作用，具有较好的开发前景。
附图说明
22.图1为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠血清谷草转氨酶（ast）活力的影响。
23.图2为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶（alt）活力的影响。
24.图3为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠血清总胆固醇（tcho）含量的影响。
25.图4为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠血清甘油三酯（tg）含量的影响。
26.图5为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏丙二醛（mda）含量的影响。
27.图6为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏谷胱甘肽（gsh）含量的影响。
28.图7为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏甘油三酯（tg）含量的影响。
29.图8为益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精肝小鼠肝脏组织形态（200
×
）的影响。
具体实施方式
30.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
31.实施案例1一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁发酵制品的制备方法，包括以下步骤：（1）橄榄汁的工艺流程
a．选择无病虫害的橄榄果实，除去杂叶和其他杂质;b．将选好的橄榄果实清洗干净；c．用沸水热烫3~5分钟，去除表皮蜡质层，使果肉组织软化；d．破碎去核，采用螺旋榨汁机榨汁；e．榨汁后将果汁和果渣过滤，制得橄榄汁；f．将橄榄汁巴氏杀菌；g．用流动水迅速冷却至室温后罐装。
32.（2）益生菌发酵橄榄汁将甘油保种的鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌，分别按2%接种量接种于灭菌的mrs液体培养基中，于37 ℃恒温培养箱静置培养24 h，反复活化两次使菌株充分恢复活力；取菌液离心弃掉上清液，加入无菌生理盐水重悬菌体，反复洗涤两次，通过菌落计数调整菌液浓度为10
6 cfu/ml，然后按1:1:1:1:1将这5种菌液混合制得混合菌悬液；将步骤（1）制得的橄榄汁用无菌水稀释1倍，加入2wt%的葡萄糖作为碳源，按照10%（v/v）的接种量接入混合菌悬液，于37 ℃静置发酵24 h，得到益生菌发酵橄榄汁。
33.（3）益生菌发酵橄榄汁制品将上述益生菌发酵橄榄汁经过调配，可用于制成益生菌发酵橄榄汁饮品，也可以经过冻干制成益生菌发酵橄榄汁固体饮料。
34.实施案例2 动物实验实验方法：以spf级雄性icr小鼠为研究对象，实验小鼠经过一周的适应性喂养期后，将其随机分为四组，通过为期六周的饮食干预喂养，给予乙醇灌胃试验。试验设4组，每组12只，按200 mg/(kg
∙
bw
∙
d)剂量灌胃橄榄汁和益生菌发酵橄榄汁，自由进食和饮水，控制黑暗和光照12 h交替进行，室温25
±1ꢀ°
c。正常对照组（nc组）：上午灌胃生理盐水，下午灌胃生理盐水（10ml/kg），模型组（mc组）：上午灌胃生理盐水，下午给予50%酒精（10 ml/kg），橄榄汁组（ol组）：上午灌胃橄榄汁，下午给予50%酒精（10 ml/kg），益生菌发酵橄榄汁组（op组）：上午灌胃益生菌发酵橄榄汁，下午给予50%酒精（10 ml/kg）。给予受试样品六周后，将小鼠禁食12 h，在洁净工作台中，先通过眼球取血，将血液收集在离心管中，再断颈处理，解剖，取出小鼠肝脏组织，通过生化试剂盒测定谷丙转氨酶（alt），谷草转氨酶（ast），总胆固醇（tcho），丙二醛（mda），甘油三酯（tg），谷胱甘肽（gsh）含量。
35.实验结果如图所示，经橄榄汁和益生菌发酵橄榄汁干预的ol组和op组肝损伤小鼠的血清生化指标与正常nc组和模型mc组相比均有显著变化，橄榄汁和益生菌发酵橄榄汁均能够极显著降低小鼠血清中ast活力（图1），显著降低alt活力（图2）、降低tcho（图3）和tg（图4）含量，降低小鼠肝脏中mda含量（图5）和tg含量（图7），显著提高gsh含量（图6），橄榄汁和益生菌发酵橄榄汁均表现出显著的保肝作用。从肝脏组织病理学切片结果（图8）可以看出，nc组的肝细胞较完整，无细胞破裂、自溶或坏死的现象，肝细胞呈规则的球状。mc组中肝小叶有溶血情况，细胞形状不规则。相较于mc组，ol组和op组中肝细胞的溶血情况有所改善，表明橄榄汁和益生菌发酵橄榄汁对慢性酒精性肝损伤小鼠具有保护作用。
36.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与
修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

1.一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）橄榄汁的制备a．选择无病虫害的橄榄果实，除去杂质；b．将选好的橄榄果实清洗干净；c．用沸水热烫3~5分钟，去除表皮蜡质层，使果肉组织软化；d．破碎去核，采用螺旋榨汁机榨汁；e．榨汁后将果汁和果渣过滤，制得橄榄汁；f．将橄榄汁巴氏杀菌；g．用流动水迅速冷却至室温后罐装，备用；（2）益生菌发酵橄榄汁将甘油保种的鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌，分别按2%接种量接种于灭菌的mrs液体培养基中，于37 ℃恒温培养箱静置培养24 h，反复活化两次使菌株充分恢复活力；取菌液离心弃掉上清液，加入无菌生理盐水重悬菌体，反复洗涤两次，通过菌落计数调整菌液浓度为10
6 cfu/ml，然后按1:1:1:1:1将这5种菌液混合制得混合菌悬液；将步骤（1）制得的橄榄汁用无菌水稀释1倍，加入2wt%的葡萄糖作为碳源，按照10%的接种量接入混合菌悬液，于37 ℃静置发酵24 h，得到益生菌发酵橄榄汁。2.如权利要求1所述方法制备得到的具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁。

技术总结

本发明涉及一种具有保肝作用的益生菌发酵橄榄汁及其制备方法。所述益生菌发酵橄榄汁的主要原料包括橄榄汁、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌。橄榄果实榨汁经巴氏杀菌后，将已经活化的鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌接种于橄榄汁中，经恒温发酵获得益生菌发酵橄榄汁。通过构建慢性酒精肝损伤小鼠模型，益生菌发酵橄榄汁能显著降低小鼠血清中谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT活力，降低甘油三酯TG、总胆固醇TCHO、肝脏中TG和丙二醛MDA含量，提高了谷胱甘肽GSH含量，改善了酒精对小鼠肝脏造成的组织损伤，表明益生菌发酵橄榄汁对酒精性肝损伤具有辅助保护作用。酒精性肝损伤具有辅助保护作用。酒精性肝损伤具有辅助保护作用。