ADU-S100在制备全麻低体温的药物中的应用

adu-s100在制备全麻低体温的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及adu-s100在制备全麻低体温的药物中的应用。

背景技术：

2.围手术期低温定义为围手术期体温降至《36.0℃。围手术期低温发生率为78.6％。2小时内体温过低发生率为56.6％，2小时后体温过低发生率为100％。美国麻醉师协会(asa)高分、3-4级手术、内镜手术、麻醉时间》2小时、静脉和冲洗液未经加温、输液或冲洗》1000毫升显著增加了低温的发生率。轻度的低体温可能是有益的，因为其能降低代谢速率，减少耗氧量，增加组织对局部缺血缺氧的耐受力。但是应该避免术中长时间的或者严重的低体温状态，因为可能引起患者寒颤，出现不自主的重复骨骼肌收缩。寒颤增加了机体耗氧量，引起二氧化碳增多，出现酸中毒并导致代谢加快。因此，低体温可能引起循环系统和呼吸系统方面的并发症。值得注意的是，核心温度降低1℃(即比正常值降低2.7％)会导致多种不良反应，包括输血需求增加、凝血障碍、心肌缺氧和心律失常、恢复时间延长、免疫抑制、手术部位感染易感性增加，药物动力学改变。体温过低也会影响患者的健康，从麻醉中恢复时的寒战引起的不适与术后疼痛相当。由于报道的研究数量较少，动物体温过低的后果还不太确定。心血管副作用包括心率和心输出量降低和qt间期延长。体温受激素和细胞代谢的严格调节，以维持体温的稳定。然而，围手术期低温是常见的继发于麻醉和手术暴露。预防和维持体温应在麻醉诱导前1-2小时开始，为此，主动和被动加温系统均能有效预防围手术期低温相关并发症。因此，需要在术前、术中和术后进行积极的体温管理，以降低围手术期低温的风险。

技术实现要素：

3.本发明提供了sting激动剂在制备全麻低体温的药物中的应用。
4.进一步，所述全麻包括吸入麻醉剂后的全麻、注射麻醉剂后的全麻。
5.进一步，所述麻醉剂包括七氟醚、艾司。
6.进一步，sting激动剂包括促进sting表达的试剂、促进sting蛋白活性的试剂。
7.进一步，促进sting表达的试剂包括促进sting基因表达的试剂、促进sting基因表达产物的试剂。
8.进一步，促进sting基因表达的试剂包括促进sting基因mrna表达的试剂、促进sting蛋白表达的试剂。
9.进一步，促进sting基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进sting蛋白含量的试剂；所述促进sting基因表达产物的试剂包括促进sting基因表达产物稳定性的试剂、促进sting基因表达产物活性的试剂、促进sting基因表达产物功能的试剂。
10.具体地，所述促进sting基因表达的试剂包括：含有sting基因的试剂、携带sting
基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有sting蛋白质的试剂。
11.进一步，促进sting表达的试剂包括sting过表达载体。
12.作为一个具体实施例，本发明的过表达载体是基因载体，基因载体形式将编码sting蛋白的核酸序列给药至待的主体，该基因载体即如下核酸构建体，该核酸构建体包括编码序列(包括翻译和终止密码子)，紧挨着外源性核酸表达所需的其它序列，诸如启动子、科扎比(kozak)序列、多聚腺苷酸(polya)信号等。在主体中表达外源性核酸序列的基因载体是本领域众所周知的。例如，基因载体可以是哺乳动物表达系统的一部分。现有技术中已经描述了有用的哺乳动物表达系统和表达构建体。此外，不同的制造商分售了几种哺乳动物表达系统并能用于本发明中，诸如基于质粒或病毒载体的系统，例如lenti-smarttm(invivogen)、genscripttm表达载体、padvantagetm(promega)、virapowertm慢病毒、腺病毒表达系统(invitrogen)和腺相关病毒表达系统(cellbiolabs)。
13.例如，本发明的基因载体可以是适用于将外源性核酸引入到细胞中，用于随后表达由该核酸编码的蛋白的病毒表达载体或非病毒表达载体。
14.表达载体可以是：游离型载体，即，能在宿主细胞内自主地进行自我复制的载体；或整合型载体，即，能稳定并入到细胞基因组内的载体。在宿主细胞中的表达可以是组成型或受到调节的(例如，诱导型)。
15.本发明的基因载体通常包括与编码sting蛋白的核酸功能性连接的启动子。启动子序列必须是紧凑并且保证强表达。优选地，启动子使sting蛋白在经基因载体的患者中表达。
16.作为可选的成分，基因载体可包括增加sting蛋白表达水平的增强子元件。实例包括sv40早期基因增强子和劳斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)的长末端重复序列(ltr)的增强子(gormanetal.(1982)proc.natl.acad.sci.79:6777)。载体还任选包括用于改进人和/或非人抗原的表达的转录终止序列和多聚腺苷酸序列。例如，合适的转录终止子和多聚腺苷酸信号可源自sv40(sambrooketal(1989),molecularcloning:alaboratorymanual)。
17.本领域已知的支持表达效率或特异性的任何其它元件都可添加到表达载体中，诸如土拨鼠肝炎转录后调控元件(wpre)。
18.为了进一步提高基因表达水平，可在本发明的基因载体中引入嵌合内含子。如本文所用的“嵌合内含子”指如下的内含子，该内含子包括源自两个不同基因的至少两个不同内含子的部分。
19.基因载体可以通过本领域已知的标准方法，诸如dna重组技术或化学合成进行构建和克隆。标准克隆方法描述在sambrooketal.,1989,分子克隆:实验指南(molecularcloning:a laboratorymanual),冷泉港实验室出版社(coldspringharbourlabpress)中。
20.在特别优选的方面中，基因载体是病毒表达载体。本发明使用的病毒载体通常包括其中缺失了一部分天然序列，以引入异种多核苷酸而不破坏病毒感染性的病毒基因组。由于病毒成分和宿主细胞受体之间发生特异的相互作用，病毒载体非常适于将基因高效地转移到靶细胞中。有助于基因转移到哺乳动物细胞中的合适的病毒载体是本领域众所
周知的，并且可源自不同类型的病毒，例如，源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、细小核糖核酸病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或甲病毒。对于不同病毒载体系统的概述，参见nienhuisetal.,hematology,vol.16:virusesand bonemarrow,n.s.young(ed.),353-414(1993)。
21.根据本发明，基因载体是腺病毒载体。
22.可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺病毒或腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式e1a和e1b特性)中传播，以达到在107～10
13
个病毒颗粒/ml范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。这同时适用于aav载体和腺病毒载体。
23.如下面实施例所述，与动物模型中已示出的类似，通过全身应用，例如通过载体的静脉内、动脉内或腹膜内递送，能实现本发明的基因载体转导到待的主体中(katzetal.,2012,genether19:659-669)。
24.除病毒载体外，非病毒表达构建体也可用于将编码蛋白或其功能变体或片段的基因导入细胞或人主体中。允许在靶细胞中体内表达蛋白的非病毒表达载体包括例如，诸如质粒pbk-cmv、pcdna3.1和pzeosv(invitrogen,stratagene)的载体。非病毒载体转入靶细胞的合适方法是例如脂质体转染法、磷酸-钙共沉淀法、deae-葡聚糖法和使用微玻璃管等的直接dna导入法。
25.进一步，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如cho细胞、cos细胞等。
26.在本发明的具体实施例中，sting激动剂是adu-s100。
27.根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括麻醉剂和sting激动剂。
28.进一步，所述麻醉剂包括七氟醚、艾司。
29.进一步，sting激动剂是adu-s100。
30.本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医
师技能范围之内的。
31.本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
32.本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
33.本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果或者预防效果即可。本发明的药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的效果或者预防效果作为指标来确定。
34.可与本发明的药物一起施用的其他剂包括和/或预防全麻低体温的药物。
35.本发明还提供了一种全麻低体温的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要者施用前面所述的sting激动剂。
36.本发明的术语“有需要者”包括哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，个体是人。
37.术语“”通常涉及和理疗人或动物(例如，在兽医应用中)，其中实现一些期望的效果，例如抑制疾病进展，并包括降低进展率、停止进展率、减轻疾病症状、改善疾病和治愈疾病。也包括作为预防性手段(即，预防)的。例如，术语“”也包括对尚未发生疾病但是有发生疾病的危险的病人的应用。
38.如本发明中使用的，“”(及其语法变型)指试图改变所个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。
附图说明
39.图1显示adu-s100对七氟醚吸入全身麻醉引起的直肠体温减低影响的结果图；图中：sevo+ns：七氟醚+生理盐水组；sevo+a：七氟醚+adu-s100组；与sevo+ns组相比，*p《0.05，n＝10，two-way anova；
40.图2显示adu-s100对艾司静脉全身麻醉引起的体温减低影响的结果图，图中：eske+ns：艾司+生理盐水组；eske+a：艾司+adu-s100组；与eske+ns组相比，*p《0.05，n＝10，two-way anova；
41.图3显示ucp1的western blot实验结果图；其中，a：免疫印记图；b：统计图，图中：sevo+ns：七氟醚+生理盐水组；sevo+a：七氟醚+adu-s100组；eske+ns：艾司+生理盐水组；eske+a：艾司+adu-s100组；n＝4；与sevo+ns组相比，sevo+a组*p《0.01；与eske+ns组相比，eske+a组，$p《0.01；one-way anova；
42.图4显示sting的western blot实验结果图；其中，a：免疫印记图；b：统计图，图中：sevo+ns：七氟醚+生理盐水组；sevo+a：七氟醚+adu-s100组；eske+ns：艾司+生理盐水组；eske+a：艾司+adu-s100组；n＝4；与sevo+ns组相比，sevo+a组*p《0.01；与eske
+ns组相比，eske+a组，$p《0.01；one-way anova。
具体实施方式
43.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harborlaboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
44.实施例adu-s100可有效抑制鞘内注射所诱发的瘙痒
45.一、实验步骤
46.1、实验分组
47.雄性sd小鼠24只，1月龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为4组(n＝6)：
48.七氟醚+生理盐水组(sevo+ns组)：七氟醚麻醉2.5％麻醉，随后经腹腔持续输注生理盐水0.2ml
·
kg-1
·
h-1
，共60min；
49.七氟醚+adu-s100组(sevo+a组)：七氟醚麻醉2.5％麻醉，随后经腹腔持续输注adu-s100 20mg
·
kg-1
·
h-1
，共60min；
50.艾司+生理盐水组(eske+ns组)：腹腔注射艾司100mg/kg，随后经腹腔持续输注生理盐水0.2ml
·
kg-1
·
h-1
，共60min；
51.艾司+adu-s100组(eske+a组)：腹腔注射艾司100mg/kg，随后经腹腔持续输注adu-s100 20mg
·
kg-1
·
h-1
，共60min。
52.2、直肠体温监测
53.于麻醉后即刻开始监测直肠体温：麻醉前5min(-5min)，小鼠无翻正反射消失即刻(0min)、输注开始后5，10，15，20，60min时测定直肠体温，是为核心温度。实验室内温度22℃。
54.3、western blot
55.每只小鼠于最后1次体温测试后处死小鼠，取小鼠下丘脑，采用western blot法测定下丘脑ucp1，sting和gapdh蛋白的表达。下丘脑加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为下丘脑组织总蛋白。将抽提的蛋白95℃下变性5min。应用10％sds-page电泳分离，上样量为15μl，将蛋白转至pvdf膜上，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，洗膜后分别加入一抗，抗兔ucp1，sting抗体和抗兔gapdh抗体(均为1：1000，abcam公司，美国)，4℃孵育过夜，tbst清洗3次，每次5min，加入羊抗兔二抗或羊抗鼠二抗(稀释度1：2000，北京中杉金桥生物有限公司)室温孵育2h，tbst清洗3次，每次5min，暗室内加发光试剂曝光，扫描成像。采用gene tools图像分析软件分析条带灰度值，以ucp1，sting蛋白条带灰度值与gapdh条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平
56.4、统计学分析
57.采用spss 23.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数
±
标准差(
±
s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，p《0.05为差异具有统计学意义。
58.二、实验结果
59.(1)全身麻醉会引起围术期低体温
60.与麻醉前5min相比，应用七氟醚吸入全身麻醉或者艾司静脉全身麻醉都可以引起后输注后体温降低从全麻后5min开始，持续到第20min基本稳定，在全麻后60min体温与麻醉后第20min无统计学差异。说明全麻后20min体温下降最快并达到较低水平。(所有p《0.05)(图1)。
61.(2)adu-s100输注可降低全身麻醉后低体温
62.结果如图1所示，七氟醚全身麻醉联合adu-s100输注(sevo+a)后5min，体温较单纯七氟醚麻醉(sevo+ns)升高了0.27℃；七氟醚全身麻醉联合adu-s100输注(sevo+a)后10min，体温较单纯七氟醚麻醉(sevo+ns)升高了0.42℃；七氟醚全身麻醉联合adu-s100输注(sevo+a)后15min，体温较单纯七氟醚麻醉(sevo+ns)升高了0.35℃；七氟醚全身麻醉联合adu-s100输注(sevo+a)后20min，体温较单纯七氟醚麻醉(sevo+ns)升高了0.3℃；七氟醚全身麻醉联合adu-s100输注(sevo+a)后60min，体温较单纯七氟醚麻醉(sevo+ns)升高了0.25℃。
63.结果如图2所示，艾司全身麻醉联合adu-s100输注(eske+a)后5min，体温较单纯艾司麻醉(eske+ns)升高了0.25℃；艾司全身麻醉联合adu-s100输注(eske+a)后10min，体温较单纯艾司麻醉(eske+ns)升高了0.35℃；艾司全身麻醉联合adu-s100输注(eske+a)后15min，体温较单纯艾司麻醉(eske+ns)升高了0.36℃；艾司全身麻醉联合adu-s100输注(eske+a)后20min，体温较单纯艾司麻醉(eske+ns)升高了0.42℃；艾司全身麻醉联合adu-s100输注(eske+a)后60min，体温较单纯艾司麻醉(eske+ns)升高了0.35℃。
64.直肠温度监测证实了adu-s100全身麻醉后体温降低的积极作用，有明显的体温保护作用。腹腔持续输注adu-s100 20mg
·
kg-1
·
h-1
可降低全身麻醉引起的体温降低。
65.(3)adu-s100可能通过增加ucp1表达，从而减轻全身麻醉引起的低体温
66.结果如图3所示，adu-s100可以升高小鼠ucp1的表达，提示adu-s100可能是通过增加ucp1的表达增加棕脂肪产热。另外，发现sting在给与adu-s100输注后表达升高，可能是通过减轻全身炎症反应，从而改善全身低体温(图4)。
67.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

技术特征：

1.sting激动剂在制备全麻低体温的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述全麻包括吸入麻醉剂后的全麻、注射麻醉剂后的全麻。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述麻醉剂包括七氟醚、艾司。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，sting激动剂包括促进sting基因表达的试剂、增强sting蛋白活性的试剂。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，促进sting基因表达的试剂包括促进sting基因mrna表达的试剂、促进sting蛋白表达的试剂。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，sting激动剂是adu-s100。7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括麻醉剂和sting激动剂。8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述麻醉剂包括七氟醚、艾司。9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述sting激动剂是adu-s100。10.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

技术总结

本发明公开了ADU-S100在制备全麻低体温的药物中的应用。本发明的研究发现了ADU-S100的新药理作用—防治全身麻醉后体温降低；其机制可能是通过上调发热相关蛋白Ucp1，可逆转全身麻醉药引起的Ucp1降低，并通过提高STING的表达减轻全身炎症反应来改善全麻低体温。提示ADU-S100是预防和全麻后低体温的一种新型途径。一种新型途径。一种新型途径。