㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(９):１７３~１８０ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０９.０２４
收稿日期:２０２２－１２－１１
基金项目：山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２１ＱＨ２３２)ꎻ新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(２０２２Ｄ０１Ｃ５８２)
作者简介：王云雨(１９９９ )ꎬ女ꎬ山东商河人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为药物新剂型与新制剂ꎮＥ－ｍａｉｌ:１８２４３９７３３３＠ｑｑ.ｃｏｍ
王健(１９９７ )ꎬ男ꎬ山东周村人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为药物新剂型与新制剂ꎮＥ－ｍａｉｌ:６４８５４８８６１＠ｑｑ.ｃｏｍ*同为第一作者ꎮ
通信作者：周长征(１９６６ )ꎬ男ꎬ山东定陶人ꎬ教授ꎬ硕士生导师ꎬ研究方向为药物新剂型与新制剂ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｓｚｙｚｃｚ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ
及其体外抗病毒活性研究
王云雨１ꎬ王健１*ꎬ张丽２ꎬ万新焕１ꎬ牛凤菊１ꎬ周长征１
(１.山东中医药大学药学院ꎬ山东济南㊀２５０３００ꎻ２.新疆医科大学第五附属医院药学部ꎬ新疆乌鲁木齐㊀８３００１１)㊀㊀摘要：本试验比较了ＡＢ－８㊁ＮＫＡ－９㊁ＨＰＤ－１００㊁ＤＭ１３０㊁Ｄ１０１及Ｘ－５六种大孔树脂对青蒿总多酚的纯化效果ꎬ筛选出富集青蒿多酚的最佳大孔树脂型号为ＨＰＤ－１００ꎮ采用单因素试验确定其最佳工艺参数：上样液ｐＨ值为２.０ꎬ质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬꎬ上样量为１３ＢＶꎬ静态吸附２ｈꎻ洗脱液是体积分数为７０％乙醇溶液ꎬ用量为５ＢＶꎮ纯化后的青蒿总多酚纯度较纯化前增加了１.６３倍ꎮ纯化后的青蒿总多酚对ＲＳＶ㊁ＨＳＶ－１和ＨＳＶ－２ 均表现出显著的体外抗病毒活性ꎬ而对ＥＶ７１未表现出较好的抑制效果ꎮ
关键词：大孔树脂ꎻ青蒿ꎻ多酚ꎻ抗病毒活性
中图分类号:Ｓ５６７.２１＋９㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０９－０１７３－０８
ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓＤｅｓｉｇｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬｉｎｎ.ＰｏｌｙｐｈｅｎｏｌｗｉｔｈＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓＲｅｓｉｎａｎｄＳｔｕｄｙｏｎＩｔｓＡｎ
ｔｉｖｉｒａｌＡｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ
ＷａｎｇＹｕｎｙｕ１ꎬＷａｎｇＪｉａｎ１∗ꎬＺｈａｎｇＬｉ２ꎬＷａｎＸｉｎｈｕａｎ１ꎬＮｉｕＦｅｎｇｊｕ１ꎬＺｈｏｕＣｈａｎｇｚｈｅｎｇ１
(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５０３００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＴｈｅＦｉｆｔｈＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＵｒｕｍｑｉ８３００１１ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｆＡＢ－８ꎬＮＫＡ－９ꎬＨＰＤ－１００ꎬＤＭ１３０ꎬＤ１０１
ａｎｄＸ－５ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｓｏｎｔｈｅｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬｉｎｎ.ｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｍａｃｒｏ￣ｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｆｏｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆＡ.ａｎｎｕａ.ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓＨＰＤ－１００.Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｏｃｅｓｓｐａｒａｍｅ￣ｔｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓ:ｐＨｖａｌｕｅｏｆｌｏａｄｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎａｓ２.０ꎬｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｓ５０
ｍｇ/ｍＬꎬｌｏａｄｉｎｇｖｏｌｕｍｅａｓ１３ＢＶꎬｓｔａｔｉｃａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｆｏｒ２ｈꎬａｎｄ５ＢＶｏｆ７０％ｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｅｌｕｅｎｔ.Ａｆ￣ｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆＡ.ａｎｎｕａｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１.６３ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｂｅｆｏｒｅｐｕｒｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎ.ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＡ.ａｎｎｕａｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔＲＳＶꎬＨＳＶ￣１ａｎｄＨＳＶ￣２
ｉｎｖｉｔｒｏꎬｂｕｔｄｉｄｎｏｔｓｈｏｗｇｏｏｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔａｇａｉｎｓｔＥＶ７１.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＭａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎꎻＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬｉｎｎ.ꎻＰｏｌｙｐｈｅｎｏｌꎻＡｎｔｉｖｉｒａｌａｃｔｉｖｉｔｙ㊀㊀青蒿又名 方溃 草蒿 荻 和 菣 等[１]ꎬ为黄花蒿(ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬｉｎｎ.)的干燥地上部位ꎬ属一年生型菊科蒿属的清热解毒草本植
物[２]ꎮ青蒿作为一种医食两用植物[１]ꎬ除富含多糖㊁蛋白质㊁萜类等有机活性成分之外[３]ꎬ还含有抗氧化㊁抗病毒㊁抗疟㊁抗肿瘤㊁防治心血管疾病等
活性的 健康卫士 多酚类化合物[４－７]ꎮ多酚类物质的提取方式通常包括溶剂萃取法㊁超临界ＣＯ２
萃取法㊁超声波辅助提取法㊁生物酶提取法等[８－９]ꎬ其分离纯化方法则有配位沉淀法㊁分子筛层析分离法㊁大孔吸附树脂分离法及膜分离法等[７]ꎮ
目前对多酚类化合物的体外活性研究主要集中于其抗氧化活性ꎬ且研究表明其具有一定的抗病毒活性[５]ꎮ人呼吸道合胞病毒(ＲＳＶ)作为肺炎链球菌科的一种包膜病毒ꎬ是引起免疫低下人下呼吸道感染最常见的病原菌之一ꎬ且目前尚无批准的疫苗或特异物来对抗其感染[１０]ꎮ近年来以干扰素和病毒唑ＲＳＶ等病毒感染性疾病的研究屡见不鲜ꎬ但因其临床效果不太理想且价格昂贵ꎬ所以仍存在较大的争议[１１]ꎮ单纯疱疹病毒(ＨＳＶ)是α疱疹病毒亚科的病原体ꎬ一般在外周组织中增殖继而于三叉神经节的神经元细胞核中以双链－ＤＮＡ(ｄｓ－ＤＮＡ)片段体的形式建立潜伏期ꎬ被激活后可到达神经末梢感染邻近的周围上皮组织ꎬ如口腔㊁生殖器黏膜和眼上皮等[１２]ꎮ研究表明ꎬ青蒿提取物可在分子水平上发挥抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体的活性ꎬ故猜测其具有抑制潜伏期ＨＳＶ的活性[１３]ꎮ传统抗病毒药物多为化药ꎬ一般对机体刺激性较大且极易产生耐药性ꎬ故可能给患者带来二次伤害ꎮ我国传统中草药因分布广泛易得㊁药效温和且可避免耐药性的产生等优点ꎬ或将成为研制抗病毒制剂的 新星 [１４]ꎮ本研究旨在筛选适宜的大孔树脂型号及最优提纯工艺以提高青蒿中多酚类化合物的提取纯度ꎬ并采用体外试验对其抗病毒活性加以验证及进一步的研究ꎬ以期为青蒿资源的开发与应用提供一定的依据ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料与试剂
青蒿ꎬ安徽省亳州市ꎻＶｅｒｏ细胞ꎬ山东省第一医科大学微生物研究所ꎻ呼吸道合胞病毒(ＲＳＶ)㊁单纯疱疹病毒(ＨＳＶ)㊁肠道病毒７１型(ＥＶ７１)ꎬ中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室ꎮ
福林－酚(ｆｏｌｉｎ－ｃｉｏｃａｉｌｅｕ)试剂㊁胰酶㊁青链霉素混合液(１００ˑꎬｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ)双抗㊁ＭＴＴ(二苯基四氮唑溴盐)㊁大孔树脂(Ｄ１０１㊁ＤＭ１３０㊁Ｘ－５㊁ＨＰＤ－１００㊁ＮＫＡ－９㊁ＡＢ－８)ꎬ北京索莱宝科技有限公司ꎻ二甲亚砜ꎬ天津富宇精细化工有限公司ꎻ１６４０培养基ꎬＧｉｂｃｏꎻ胎牛血清㊁ＰＢＳꎬ美国ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司ꎻ利巴韦林注射液(产品批号:２１０４０３０６４１)ꎬ山东鲁抗辰欣药业有限公司ꎻ阿昔洛韦(ＣＡＳ号:５９２７７－８９－３)ꎬ上海皓鸿生物医药科技有限公司ꎻ没食子酸㊁无水乙醇㊁无水碳酸钠㊁浓盐酸㊁氢氧化钠等均为国产分析纯ꎮ
１.２㊀试验仪器
ＷＤ－９４１５Ｆ型超声波清洗器ꎬ北京六一生物科技有限公司ꎻ微型中药粉碎机ꎬ邢台润联科技开发有限公司ꎻＳＨＺ－Ｄ(Ⅲ)循环水式真空泵ꎬ郑州巩义市英峪予华仪器厂ꎻ离心机ꎬ长沙湘智离心机仪器有限公司ꎻＦＡ－１００４Ｎ电子天平ꎬ上海精密科学仪器有限公司ꎻ旋转蒸发仪ꎬ上海亚荣生化仪器厂ꎻ冷冻干燥机ꎬ北京博医康实验仪器有限公司ꎻ水浴振荡器ꎬ上海博迅医疗生物仪器股份有限公司ꎻ紫外可见分光光度计Ｘ－５型ꎬ上海元析仪器有限公司ꎻＰ３０１酸度计ꎬ山东欧莱博仪器有限公司ꎻＣＯ２恒温培
养箱ꎬ日本三洋公司ꎻ生物安全柜ꎬＴｈｅｒｍｏ公司ꎻ倒置显微镜ꎬ日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司ꎻ超低温冰箱ꎬ中科美菱低温科技股份有限公司ꎻ细胞培养瓶㊁９６孔细胞培养板ꎬ美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司ꎻ酶标仪ꎬ美国ＢｉｏＴｅｋ仪器有限公司ꎮ
１.３㊀试验方法
１.３.１㊀粗青蒿多酚样品的制备㊀称取洗净㊁烘干(３０ħ)后的粗碎青蒿３００ｇꎬ粉碎后过０.２５ｍｍ筛ꎬ精确称取２００.０ｇ粉末于圆底烧瓶中ꎬ以固液比为１ʒ１０(ｇ/ｍＬ)㊁４０％乙醇浸泡６ｈꎮ后于功率１２５Ｗ㊁４０ħ条件下水浴超声提取２次ꎬ每次３０ｍｉｎꎮ提取液以３２层纱布过滤ꎬ合并滤液ꎮ将滤液抽滤ꎬ３０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后以４０ħ减压浓缩至含生药量１ｇ/ｍＬꎮ按照样品ʒ无水乙醇(ｍＬʒｍＬ)为１ʒ０.２５㊁１ʒ０.５㊁１ʒ１㊁１ʒ２依次加入相应体积的无水乙醇以除去粗提液中的部分多糖及蛋白质ꎬ静置２ｈ后以４０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液进行减压浓缩(４０ħ)至无醇味ꎬ将浓缩液保存于－２０ħ冰箱中ꎬ后进行冷冻干燥ꎬ冻干后的粗品置于４ħ条件下备用ꎮ
１.３.２㊀提取液中多酚含量的测定㊀采用福林－酚
４７１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
比法[１５]ꎮ精密称取没食子酸标准品(ȡ９８％)
０.０１００ｇ于１００ｍＬ容量瓶中ꎬ以纯水溶解并定容ꎬ摇匀即得质量浓度为０.１ｍｇ/ｍＬ的没食子酸标准品溶液ꎮ分别移取标准品溶液０㊁０.２㊁０.４㊁０.６㊁０.８㊁１.０ｍＬ于１０ｍＬ棕容量瓶中ꎬ后分别加入１.０ｍＬ福林酚试剂㊁质量浓度为１０％的碳酸钠溶液２.０ｍＬ并以纯水定容ꎬ摇匀后避光反应２ｈꎬ测定７６０ｎｍ波长处的吸光度值ꎬ得到没食子酸标准曲线回归方程:ｙ＝１１.９８１０ｘ＋０.０４５４ꎬ相关系数Ｒ２＝０.９９９６ꎮ式中ｘ为没食子酸标准溶液的质量浓度Ｃ(ｍｇ/ｍＬ)ꎬｙ为吸光度值Ａꎮ标准曲线见图１ꎮ
移取样品溶液０.５ｍＬ于１０ｍＬ棕容量瓶中ꎬ加入１.０ｍＬ福林酚试剂与１０％碳酸钠溶液２.０ｍＬ后以纯水定容ꎬ摇匀后避光反应２ｈꎬ测定７６０ｎｍ波长处的吸光度值并代入回归方程ꎬ得其多酚质量浓度
ꎮ
图１㊀没食子酸标准曲线
１.３.３㊀大孔树脂的预处理㊀分别取１０.０ｇＤ１０１㊁ＤＭ１３０㊁Ｘ－５㊁ＨＰＤ－１００㊁ＮＫＡ－９㊁ＡＢ－８大孔树脂ꎬ以体积分数为９５％乙醇活化２４ｈꎬ搅拌均匀放出气泡后以纯水洗至无醇味ꎬ以５倍柱体积的５％ＨＣｌ浸泡２ｈ后以纯水洗至中性ꎬ以相同体积２％ＮａＯＨ浸泡２ｈ后以纯水洗至中性ꎬ最终以大量纯水浸泡ꎬ备用ꎮ
１.３.４㊀大孔树脂型号的筛选㊀取预处理的６种湿树脂各１０.０ｇ于２５０ｍＬ具塞锥形瓶中ꎬ各加入１０.０ｍＬ质量浓度为１ｇ/ｍＬ的青蒿多酚粗提液ꎬ吸附３０ｍｉｎ后置于２８ħ㊁１５０ｒ/ｍｉｎ水浴恒温振荡仪上ꎬ振荡吸附６ｈ并收集其上清液(０.５ｍＬ/ｈ)ꎮ自收集的各组(以０.５ｍＬ/ｈ收集的单个样品为一组)上清液中分别取样以测定多酚浓度Ｃ１ꎬ同时
测定初始提取液的多酚浓度Ｃ０ꎮ将吸附饱和的树脂进行抽滤ꎬ并以４０~６０ｍＬ纯水润洗２次至表面无明显残留的多酚溶液ꎮ加入１０.０ｍＬ体积分数为７０％乙醇后再次置于摇床上ꎬ相同条件下恒温振荡６ｈ并收集上清液(０.５ｍＬ/ｈ)ꎬ测其多酚浓度Ｃ２ꎮ将所得数据代入公式(１)~(３)以计算各树脂的吸附量(ｍｇ/ｇ)㊁吸附率及解吸率(％)即可筛选出最佳型号ꎮ
㊀㊀㊀吸附量(ｍｇ/ｇ)＝(Ｃ０－Ｃ１)Ｖ/ｍ㊀ꎻ
(１)吸附率(％)＝(Ｃ０－Ｃ１)/Ｃ０ˑ１００㊀ꎻ
(２)解吸率(％)＝Ｃ２/(Ｃ０－Ｃ１)ˑ１００㊀ꎮ
(３)
式中ꎬｍ为湿树脂质量ꎬＶ为上样液体积ꎮ
１.３.５㊀ＨＰＤ－１００树脂的静态吸附动力学分析㊀
分别取１.３.４中ＨＰＤ－１００树脂静态吸附过程中每小时所得样液ꎬ按１.３.２中的测定方式得其多酚浓度ꎬ计算吸附率并绘制吸附曲线ꎮ
１.３.６㊀上样液质量浓度对吸附率的影响㊀取１０.０ｇ预处理的ＨＰＤ－１００湿树脂６份ꎬ加入质量浓度分别为２５㊁５０㊁１００㊁２００㊁５００㊁８００ｍｇ/ｍＬ的青蒿多酚粗提液各１０.０ｍＬꎬ密封置于２８ħ水浴恒温振荡仪上ꎬ以１５０ｒ/ｍｉｎ振荡吸附６ｈ并收集其上清液(０.５ｍＬ/ｈ)ꎬ测其多酚浓度并按公式(２)计算吸附率ꎮ
１.３.７㊀上样液ｐＨ值对吸附率的影响㊀取１０.０ｇ预处理的ＨＰＤ－１００湿树脂８份ꎬ加入ｐＨ值分别为１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８的青蒿多酚粗提液(质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬ)各１０.０ｍＬꎬ密封置于２８ħ水浴恒温振荡仪上ꎬ以１５０ｒ/ｍｉｎ振荡吸附６ｈ并收集上清液(０.５ｍＬ/ｈ)ꎬ测其多酚浓度并按公式(２)计算吸附率ꎮ１.３.８㊀乙醇体积分数对解吸率的影响㊀取１０.０ｇ预处理的ＨＰＤ－１００湿树脂７份ꎬ加入质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬ㊁ｐＨ值为２.０的青蒿多酚粗提液各１０.０ｍ
Ｌꎬ密封置于２８ħ水浴恒温振荡仪上ꎬ以１５０ｒ/ｍｉｎ振荡吸附６ｈꎬ加入体积分数分别为４０％㊁５０％㊁６０％㊁７０％㊁８０％㊁９０％㊁１００％的乙醇洗脱液
各１０.０ｍＬꎬ密封置于２８ħ水浴摇床上ꎬ以１５０ｒ/ｍｉｎ振荡６ｈ并收集其上清液(０.５ｍＬ/ｈ)ꎬ测其多酚浓度并按公式(３)计算解吸率ꎮ
１.３.９㊀ＨＰＤ－１００树脂的动态吸附与解吸㊀(１)动态吸附曲线的绘制：取２０.０ｇ预处理的ＨＰＤ－
１００湿树脂１份ꎬ以湿法装柱的方式装入半径为
５
７１㊀第９期㊀㊀㊀㊀王云雨ꎬ等：大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究
２.０ｃｍ的层析柱ꎬ以纯水平衡２４ｈ后加入质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬ㊁ｐＨ值为２.０的青蒿多酚粗提液ꎬ以２ＢＶ/ｈ(１ＢＶ＝３６.４ｍＬ)的流速过柱并测定每１ＢＶ流出液中的总多酚浓度Ｃｔꎬ当其达到泄漏点[流出液的总多酚含量(Ｃᶄｔ)开始不低于上样液中总多酚含量(Ｃᶄ０)１０％时的上样体积]停止上样并绘制动态吸附曲线ꎮ
(２)洗脱曲线的绘制：按１.３.９(１)中的方式装柱并将质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬ㊁ｐＨ值为２.０的青蒿多酚粗提液以２ＢＶ/ｈ的流速上样１３ＢＶꎬ经５ＢＶ纯水洗脱除杂后ꎬ以体积分数为７０％乙醇洗脱至无紫外吸收(２８０ｎｍ)ꎬ每０.５ＢＶ收集一次洗脱液并测定其总多酚浓度ꎬ绘制洗脱曲线ꎮ将含总多酚的洗脱液进行减压浓缩至无醇味ꎬ冷冻干燥后测定多酚纯度(混合物中总多酚的质量占其总质量的百分比)ꎮ
１.３.１０㊀青蒿多酚抗病毒活性的研究㊀(１)细胞复苏：将保存于液氮中的Ｖｅｒｏ细胞取出并置于３７ħ条件下融化ꎬ后将其放入离心机中以１５００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ弃去上清液后以１ｍＬ细胞生长液(１０％１６４０培养基)吹打后移入细胞培养瓶ꎬ补加培养液使瓶内液体容积达６ｍＬꎮ标记后置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱中培养并定时镜检(１２ｈ检１次)ꎮ
(２)细胞传代：待Ｖｅｒｏ细胞长成单层且在细胞培养瓶瓶底覆盖率约９０％时ꎬ弃去原培养液并以２ｍＬＰＢＳ冲洗２~３次ꎬ后向瓶中加入１ｍＬ０.２５％胰酶细胞消化液(含ＥＤＴＡ)ꎬ轻轻晃动使其覆盖瓶底ꎬ置于培养箱中消化５~８ｍｉｎꎮ轻轻拍打培养瓶使贴壁细胞脱落ꎬ立即加入３ｍＬ１０％１６４０终止消化ꎬ吹打均匀后以１传２的方式进行传代ꎬ标记后继续培养ꎮ
(３)病毒毒力的测定：将冻存于－８０ħ冰箱中的ＲＳＶ㊁ＥＶ７１和ＨＳＶ病毒 三冻三融 之后在１０００ｒ/ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ并收集上清液ꎬ将其进行１０倍比稀释(１００~１０１１)后依次加入
１００μＬ于被单层Ｖｅｒｏ细胞覆盖的９６孔板中ꎬ每孔平行３次并设置细胞对照组ꎬ标记后置于培养箱中静待４８ｈꎮ终止培养后弃去原培养液ꎬ以ＰＢＳ冲洗两遍后以ＭＴＴ在避光条件下染处理４ｈꎬ之后弃去ＭＴＴ并以ＤＭＳＯ进行脱ꎬ在气浴恒温振荡器中振荡１５ｍｉｎ后于酶标仪中测定Ａ４９０ꎬ采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ两氏法即式(４)计算病毒的半数细胞感染量ＴＣＩＤ５０ꎮ
细胞存活率(％)＝试验组Ａ４９０值/对照组Ａ４９０值ˑ１００㊀ꎻ
细胞病变率(％)＝１－细胞存活率㊀ꎻ
细胞比距(ｐｄ)＝(高于５０％的细胞病变率－５０％)/(高于５０％的细胞病变率－低于５０％的细胞病变率)㊀ꎻ
ＴＣＩＤ５０＝Ａｎｔｉｌｇ(ｌｇＣ＋ｐｄｌｇＣｍ)㊀ꎮ(４)式中ꎬＣ为高于５０％病变率时的首个稀释度ꎬＣｍ为倍比稀释系数ꎮ
(４)药物毒性的测定：将所得冻干青蒿多酚样品以２％１６４０配制成５０ｍｇ/ｍＬ药物后过０.２２μｍ无菌微孔滤膜除菌除杂ꎬ取１００μＬ以２倍比稀释(２０~２１１)加入长好单层Ｖｅｒｏ细胞的９６孔板中ꎬ设置细胞对照(１００μＬ２％１６４０)㊁病毒对照(５０μＬ２％１６４０＋５０μＬ病毒)和同浓度阳(ＲＳＶ与ＥＶ７１以利巴韦林为阳ꎬＨＳＶ以阿昔洛韦为阳ꎻ５０μＬ阳＋５０
μＬ２％１６４０)ꎬ标记培养ꎮ待病毒组病变达９０％时终止培养并弃去原培养液ꎬ以ＰＢＳ冲洗２遍后依次进行染㊁脱处理ꎬ脱后振荡１５ｍｉｎ并于酶标仪中测定Ａ４９０ꎬ依据式(５)计算药物的半数中毒浓度(ＴＣ５０)ꎮ
ＴＣ５０＝[Ａｎｔｉｌｇ(ｌｇ高于５０％细胞病变率的药
物稀释度的值－ｐｄ)]ˑＣ
药物首孔㊀ꎮ(５)式中Ｃ
药物首孔
表示９６孔板中首列药物的浓度ꎬ即５０ｍｇ/ｍＬꎮ
(５)青蒿多酚体外抗病毒试验：将青蒿多酚药物的最大无毒浓度设置为初始浓度ꎬ以２％１６４０依次进行２倍比稀释(２０~２１１)并各加入５０μＬ于长好Ｖｅｒｏ细胞的９６孔板中ꎬ同时设置对照组[同１.３.１０(４)的处理方式]ꎮ标记后置于培养箱中ꎬ待病毒组病变程度约为９０％时进行染㊁脱处理ꎬ经振荡后以酶标仪测定Ａ４９０ꎬ并采用Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ两氏法即式(６)(７)计算药物的半数有效浓度(ＥＣ５０)和指数(ＴＩ值)ꎮ其中ꎬＴＩ值为判定药物是否具有抗病毒效果的主要指标ꎮＥＣ５０＝[Ａｎｔｉｌｇ(ｌｇ高于５０％细胞存活率药物
稀释度的值－ｐｄ)]ˑＣ
药物首孔㊀ꎻ(６)ＴＩ＝ＴＣ５０/ＥＣ５０㊀ꎮ(７)
６７１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
１.４㊀数据整理及分析
采用ＳＰＳＳ２０.０对试验数据进行显著性分析ꎬ以Ｏｒｉｇｉｎ２０２２与ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ作图ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀六种大孔树脂性能的比较
相关研究表明ꎬ树脂的主要功能基(极性)及其孔径㊁孔隙率㊁比表面积等因素是影响其性能的关键所在ꎬ而被吸附化合物的分子量也是影响大孔树脂 去粗取精 不可忽略的因素[１６]ꎮ如表１所示ꎬ一般来说酚类化合物应在极性树脂上具有较好的性能ꎬ但本试验结果表明ＮＫＡ－９的性能并不出众ꎬ推测青蒿多酚的化合物分子量偏小ꎬ即影响其吸附㊁解吸效果的主要是孔容㊁比表面积等空间因素ꎮＨＰＤ－１００在这６种树脂中的平均孔径最小且平均孔容和比表面积最大ꎬ故其吸附青蒿多酚的纯度最高且解吸性能最
佳ꎮ６种树脂的吸附率不存在较大差异ꎬ但ＨＰＤ－１００的解吸率优于其他５种树脂ꎮ综合考虑ꎬＨＰＤ－１００是纯化青蒿多酚的最适树脂ꎮ
㊀㊀表１㊀六种大孔树脂空间结构、吸附与解吸性能等的比较
型号极性平均孔径/ｎｍ平均孔容/(ｍＬ/ｇ)比表面积/(ｍ２/ｇ)吸附量/(ｍｇ/ｇ)吸附率/％解吸率/％ＡＢ－８弱极性１３.０~１４.００.７３~０.７７４８０~５２０８.８３ʃ０.０１６６.１２ʃ０.０１３３.０７ʃ０.０５ＮＫＡ－９极性１５.５~１６.５１.００~１.０４２５０~２９０８.８０ʃ０.０２６５.７９ʃ０.０３３０.３４ʃ０.０６Ｄ１０１非极性９.０~１０.０１.１８~１.２４４８０~５５０８.９３ʃ０.２３６６.７９ʃ０.０２３２.１８ʃ０.０１ＤＭ１３０弱极性９.０~１０.００.８１~０.８８５００~５５０８.７４ʃ０.０４６５.４０ʃ０.０３３８.０９ʃ０.１０Ｘ－５非极性２９.０~３０.０１.２０~１.２４５００~６００８.６２ʃ０.１１６４.４８ʃ０.０３３４.５２ʃ０.０３ＨＰＤ－１００非极性８.５~９.０１.３５~１.６５６５０~７００８.４６ʃ０.４１６３.２９ʃ０.０４４３.５９ʃ０.０２
２.２㊀ＨＰＤ－１００树脂的静态吸附饱和曲线
如图２所示ꎬ自吸附开始的０.５ｈ内青蒿多酚被迅速吸附至ＨＰＤ－１００树脂内部使其吸附率迅速升至４６.７０％ꎬ至２ｈ后达到饱和状态ꎬ此后吸附率几乎不再变化ꎮ故选择２ｈ为青蒿总多酚的ＨＰＤ－１００最佳吸附时间ꎮ
图２㊀ＨＰＤ－１００树脂的静态吸附饱和曲线２.３㊀上样液质量浓度对吸附率的影响
如图３所示ꎬ当青蒿多酚上样液的质量浓度为５０ｍｇ/ｍＬ时其在ＨＰＤ－１００树脂上的吸附率明显优于其他浓度ꎮ低于该浓度时吸附率较小的主要原因是树脂上的吸附位点仍有剩余ꎬ从而降低了树脂的利用率ꎮ当质量浓度高于５０ｍｇ/ｍＬ时化合物堵塞引起传质阻力增大ꎬ进而影响物质的扩散和吸附ꎬ造成多酚化合物的损失ꎮ故确定５０ｍｇ/ｍＬ是其最佳上样浓度ꎮ
图３㊀上样液质量浓度对吸附率的影响２.４㊀上样液ｐＨ值对吸附率的影响
如图４所示ꎬ当上样液的ｐＨ值为１~３时多酚吸附质主要以分子状态存在ꎬ此时其在ＨＰＤ－１００树脂上的吸附率高于９０％ꎬ且不存在显著性差异(Ｐ>０.０５)ꎮ上样液的ｐＨ值不低于７时青蒿多酚主要以离子态分布ꎬ此时不易被树脂所吸附[１７]ꎮ当ｐＨ值为４~６或８时部分苷键发生断裂形成了苷元和糖ꎮ一方面ꎬ糖类化合物占领了部分吸附位点ꎬ造成了多酚的损失ꎻ另一方面ꎬ多酚苷元释放后被吸附ꎬ导致此时多酚吸附率较中性条件时更高ꎮ故认为ｐＨ＝２.０时青蒿多酚在
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㊀第９期㊀㊀㊀㊀王云雨ꎬ等：大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究
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