(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510206458.7
(22)申请日 2015.04.28
C12N 15/113(2010.01)
C12N 15/10(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)
(71)申请人吉林农业大学
地址130118 吉林省长春市净月开发区新城
大街2888号
(72)发明人王法微 李海燕 邓宇 王南
李晓薇 董园园 陈欢 董金晔
(74)专利代理机构长春市东师专利事务所
22202
代理人张铁生
(54)发明名称
(57)摘要
GmPLC12来源于威廉姆斯82，其核苷酸序列见SEQ
ID No.1。它是以威廉姆斯82基因组DNA 为模板， 通过PCR 方法获得中间片段后，在大豆基因组中
map 到该基因启动子区域，从而获得GmPLC12基
因启动子的全长核苷酸序列。GmPLC12基因启动
低。证明GmPLC12基因启动子具有豆荚表达的特
异性；为豆荚专一性遗传信息改造提供优质的启
动元件。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图2页
(10)申请公布号CN 104789567 A (43)申请公布日2015.07.22
C N 104789567
A
1.豆荚特异性启动子GmPLC12，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.豆荚特异性启动子GmPLC12的制备方法，它是以大豆品种威廉姆斯82基因组DNA为模板，用引物F：GCCTGCTAAAAATATATTTG与R：TCATGGAGACCTCAATATAA扩增，获得。
3.一种表达载体，它是在表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的启动子。
4.豆荚特异性启动子GmPLC12在培育转基因植物的应用。
豆荚特异性启动子GmPLC12
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一个豆荚特异性启动子及其在培育转基因植物中的应用。
背景技术
[0002] 启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达的起始时间和表达程度。启动子本身并不控制基因的功能，转录因子可以与基因的启动子结合而调控基因的表达。高等植物基因启动子主要可以分为三种类型：组成型启动子、组织特异性启动子与诱导型启动子。组成型启动子是应用最早、最广泛的一类启动子。其中应用最广泛的CaMV35S启动子为广大植物学工作者所认可。该启动子从花椰菜花叶病毒中克隆得到的，在植物的大部分组织中都具有高效的表达，CaMV35S启动子是基因功能鉴定的首选启动子。诱导型启动子在正常生长条件下表达量非常低，在特定诱导条件下才可以驱动目的基因的表达。而组织特异性启动子是一种只在特定组织中表达的启动子，如：根特异性表达启动子，种子特异性启动子等。
[0003] 随着组成型启动子（如CaMV35S启动子）的广泛应用，人们发现组成型启动子并不适合通过基
因工程手段改良作物性状。因为组成型启动子不仅可以驱动目的基因的超表达，而且这种超表达没有时间与空间的限制，即：在任何时间、任何地点目的基因的表达量均很高。这将造成植物自身能量消耗变大，所以组成型超表达的转基因植株多表现出植株矮小等形状。为了避免这个问题，组织特异性启动子与诱导型启动子的开发利用成为基因工程研究的一个热点。
[0004] 植物组织特异性启动子是指能够驱动目的基因在植物的特定组织中表达的一种启动子，通过组织特异性启动子的应用将使目的基因可以按照人们的设计在某一组织中表达。目前植物组织特异性启动子应用较多的为根特异性启动子以及种子特异性启动子。根特异性启动子可以驱动一些与根部生长发育与水分及矿物质运输相关的基因在植物根部特异表达。而种子特异性启动子可以驱动一些与油脂合成以及一些调控作物产量相关的基因在种子中表达。豆荚是大豆成熟过程中包裹种子的一种植物器官，人们对豆荚特异性启动子的研究相对较少。豆荚特异性启动子可以增加外源基因在豆荚形成期荚中的表达量，能够有效减少对植物其他组织器官的不利影响，为基因工程育种的精确性和安全性提供了新的原件。本专利公开了一种大豆豆荚特异性启动子GmPLC12，该启动子在早期豆荚中的表达量非常高，而在其它组织中的表达量较低。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为解决组成型起动子超表达造成植物自身能量消耗大，转基因植株多表现出植株矮小的问题，而提供一个豆荚特异性启动子GmPLC12。
[0006] 豆荚特异性启动子GmPLC12，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。[0007] 豆荚特异性启动子GmPLC12的制备方法，它是以大豆品种威廉姆斯82基因组DNA
为模板用引物F：GCCTGCTAAAAATATATTTG与R：TCATGGAGACCTCAATATAA扩增，获得。[0008] 一种表达载体，它是在表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的启动子。[0009] 本发明的又一个目的是提供的豆荚特异性启动子GmPLC12在培育转基因植物的应用。
[0010] 本发明提供了豆荚特异性启动子GmPLC12来源于大豆品种威廉姆斯82，其核苷酸序列见SEQ ID No.1。它是以威廉姆斯82基因组DNA为模板，通过PCR方法获得中间片段后，在大豆基因组中map到该基因启动子区域，从而获得GmPLC12基因启动子的全长核苷酸序列。GmPLC12基因启动子在早期豆荚中特异表达，而在其他部位表达较低。证明GmPLC12基因启动子具有豆荚表达的特异性；为豆荚专一性遗传信息改造提供优质的启动元件。
附图说明
[0011] 图1为大豆豆荚特异性启动子GmPLC12的PCR检测，M：DNA Marker DL2000；1：启动子PCR产物；
图2为GmPLC12基因组织表达量分析结果；
图3为GmPLC12基因启动子与GUS融合表达载体图；
图4为GUS活性测定结果。
具体实施方式
[0012] 实施例1 提取大豆基因组DNA
将大豆“威廉姆斯82”（购买于种子公司）种子播在液体营养钵中，放在培养室中进行培养。取生长大豆幼苗嫩叶，按照植物基因组DNA小量提取试剂盒进行提取大豆基因组DNA。提取步骤如下：
（1）在 65℃水浴中预热buffer S1，同时预热洗脱缓冲液（EB）。
[0013] （2）取适量鲜嫩的大豆叶片，在液氮中充分碾磨。
[0014] （3） 转移研磨成功的细粉（约100 mg）到一个新的的1.5 ml EP管中，加入550 µL 65℃预热buffer S1和7 µL RNA酶，涡旋震荡至完全混合，室温条件下静止放置10分钟。[0015] （4）在离心管中加入130 µL的buffer S2，需要涡旋震荡至完全混合，放入离心机内12000 rpm离心5 分钟。
[0016] （5）吸取上清置于蓝分离柱A中，12000 rpm 离心1分钟，收集下液。[0017] （6）加入1.5倍
体积buffer S3后立即缓慢的上下颠倒数次至充分混合。[0018] （7）将已得混合物（包括可能出现的白絮状沉淀）加入至白吸附柱AC中，12000 rpm离心1分钟，弃废液。
[0019] （8）加入700 µL 漂洗液WB，12000 rpm 离心1分钟，弃废液。
[0020] （9）重复步骤（8）一次。
[0021] （10）将吸附柱AC放回收集管中，12000 rpm 离心30秒。
[0022] （11）将吸附柱AC置于无核酸酶的EP管中，用事先预热的洗脱缓冲液EB洗脱，室温放置1-2分钟，12000 rpm 离心30秒，收集大豆基因组DNA。
[0023] 实施例2 大豆GmPLC12基因启动子的克隆
以大豆基因组DNA为模板，利用引物PLC12-F（GCCTGCTAAAAATATATTTG）与PLC12-R
（TCATGGAGACCTCAATATAA）对GmPLC12基因启动子进行克隆，PCR体系见表1，PCR程序为94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，延伸2分钟，共进行35个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测（结果见图1）后，连接克隆载体pEASY-T1（购自全式金生物技术有限公司）生成pEASY-GmPLC12后进行测序，测序结果见SEQ ID No.1。
[0024]
实施例3 大豆GmPLC12基因在不同组织中的表达量鉴定
(1) 植物材料的培养
将大豆（威廉姆斯82）种子播种与营养钵中进行培养，待生长至30天时采集部分大豆的根、茎以及叶片。利用液氮将植物材料迅速冷冻后置于-80℃冰箱中储存。剩余大豆材料继续生长，在不同生长阶段中分别取花、花后10天的早期豆荚、花后30天的晚期豆荚、花后10天的未成熟种子、花后30天的微成熟种子以及完全成熟的种子，同样液氮速冻后用于RNA的提取。
[0025] (2) RNA的提取
本实验用购自Takara公司的RNAiso 裂解液进行大豆叶片和根组织的RNA的提取。此方法使得提取的RNA结构完整且包含miRNA，为接下来的实验奠定了良好的基础。RNAiso 方法提取大豆总RNA步骤如下：
1）取大豆根或叶片100 mg，在液氮中充分研磨后放入到1.5 ml离心管中加1 mL RNAiso Plus，盖上管盖，充分混匀使组织裂解。
[0026] 2）室温（15-30℃）静止放置5分钟。
[0027] 3）4℃，12000 g离心15分钟，收集上清并转移到新的离心管中。
[0028] 4）每1 mL RNAiso Plus里加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡至液体呈乳状, 室温放置5分钟。
[0029] 5）4 ℃，12 000 g离心15分钟，此时分三层，取上层水相（包含RNA）转移到新管中，小心不要吸到中间层。
[0030] 6）加0.5-1 mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟。
[0031] 7）4 ℃，12 000 g，离心10分钟，保留RNA沉淀，弃掉上清。
[0032] 8）加1 mL 75 %乙醇，洗涤RNA沉淀。
[0033] 9）4 ℃，7500 g，离心5分钟，弃上清。
[0034] 10）打开管盖，倒置于滤纸上，自然晾干或进行真空干燥。不要干燥时间太长使得RNA难以溶解。乙醇挥发完全后以DEPC水溶解RNA，可以用头吹打溶解。溶解后测RNA 浓度。
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