(10)申请公布号 CN 102342299 A (43)申请公布日 2012.02.08
C N 102342299 A
*CN102342299A*
(21)申请号 201110234995.4(22)申请日 2011.08.09CCTCC NO:M202046 2002.12.11
A01N 63/02(2006.01)A01N 25/04(2006.01)A01N 25/12(2006.01)
A01P 7/04(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
(71)申请人镇江市润宇生物科技开发有限公司
地址212009 江苏省镇江市丁卯经十二路
668号申请人高小文
吴铭忻(72)发明人
高小文(54)发明名称
本发明是一种可以导致植物害虫快速致病死亡的短稳杆菌农药及其制造方法。短稳杆菌农药包括短稳杆菌悬浮剂和短稳杆菌母药。短稳杆菌(拉丁文学名为Empedobacter brevis)GXW15-4是解剖罹病死亡的害虫尸体分离、提取的一种植物害虫病原细菌，现保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC NO ：M202046)。短稳杆菌悬浮剂采用三级发酵装置发酵方法制造，短稳杆菌母药采用短稳杆菌悬浮液制造过程中的一级发酵产物或者二级发酵产物经高速分离、三级冷冻干燥方法制造。短稳杆菌农药对多种植物鳞翅目害虫杀虫效果好。施用短稳杆菌农药可避免农产品被化学农药污染，且对植物本身、对植物害虫天敌、对人畜禽安全性高。 (83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 4 页序列表 1 页 附图 1 页
1.短稳杆菌农药是用短稳杆菌GXW15-4制造出来的鳞翅目害虫杀虫剂，包括短稳杆菌悬浮剂和短稳杆菌母药，其特征在于：稀释喷雾至植物表皮后，短稳杆菌GXW15-4经口吸进入植物害虫体内，24小时内导致植物害虫病变死亡。
2.根据权利要求1所述的短稳杆菌(拉丁文学名为Empedobacter brevis)GXW15-4，是解剖罹病死亡的植物害虫尸体提取、筛选的一种植物害虫病原菌，该菌种现保臧在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号CCTCC NO：M202046，其特征在于：短稳杆菌GXW15-4菌体呈短杆状，长2.6-
3.8μm，宽0.8-1.1μm，两端钝圆，用扫描电镜观察其内部有约1μm3的正方体晶体状。
3.根据权利要求1所述的短稳杆菌悬浮剂，可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物鳞翅目害虫的防治，产品特征在于：含有高浓度短稳杆菌GXW15-4活体的乳白悬浮液。
4.根据权利要求1所述的短稳杆菌母药，既可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物害虫防治，
也可经深加工形成短稳杆菌农药其他剂型，还可与化学农药复配后用于兼治植物其他病虫害，产品特征在于：具有高含量短稳杆菌GXW15-4活体的淡黄粉末。
5.短稳杆菌悬浮剂制造方法，其特征包括以下步骤：
(1)解剖罹病死亡的害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15-4菌株。
(2)将分离、提取出来的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2。
(3)选出试管LB斜面活力强的优良菌株，用摇床培养法扩大培养，培养条件与步骤(2)相同。
(4)用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，培养基质采用灭菌后的大豆粉(或者豆奶粉)4.5％、蚕蛹粉3％、钙粉1％、食盐0.5％，加适量水和短稳杆菌GXW15-4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤2相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装形成短稳杆菌悬浮剂产品。
6.短稳杆菌母药制造方法，其特征包括以下步骤：
(1)将短稳杆菌悬浮液制造过程中的一级发酵产物或者二级发酵产物放置高速离心机中进行先期脱水处理。
(2)将高速离心脱水处理后的产物用三级冷冻干燥机进行干燥处理，温度分别控制在-5℃、-15℃、-75°，使其成为含水量小于5％的粉剂，包装形成短稳杆菌母药。
短稳杆菌农药及其制造方法
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及从罹病死亡的植物害虫体内提取短稳杆菌(拉丁文学名为Empedobacter brevis)GXW15-4、选用微生物发酵工艺制造短稳杆菌悬浮剂、选用微生物发酵及脱水工艺制造短稳杆菌母药的方法。
[0002] 短稳杆菌GXW15-4，是本公司高级农艺师高小文于2001年9月解剖罹病死亡的斜纹夜蛾尸体发现的一种植物害虫病原菌，于2002年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号CCTCC NO：M202046。
[0003] 短稳杆菌GXW15-4菌体呈短杆状，长2.6-3.8μm，宽0.8-1.1μm，两端钝圆，用扫描电镜观察其内部有约1μm3的正方晶体状。
[0004] 依据中国科学院微生物研究所检测鉴定报告([2009]微检字第175号)，短稳杆菌GXW15-4理化试验结果见表1：
[0005] 表1短稳杆菌农药理化试验结果(BIOLIG GN2)表
[0006]
试验项目 结果
试验项目 结果 试验项目 结 试验项目 结果 细胞形态 杆状 革兰氏染 阴性 氧化酶 + 接触酶 + 对照 - D -蜜二糖 - P -苯乙醇酸 - L -组氨酸 - a -环糊精 + 甲基葡萄苷 - 衣康酸 + 羟基脯氨酸 + 糊精 + D -阿洛酮糖 - a -氧代丁酸 + L -亮氨酸 + 糖原 + D -棉子糖 - D -氧代戊二酸 + L -乌氨酸 - T w e e n 40 + L -鼠李糖 - D -氧代戊酸 + L -苯丙氨酸 + T w e e n 80 + D -山梨醇 - D ，L -乳酸 - L -脯氨酸 + N -乙酰半乳糖胺 - 蔗糖 - 丙二酸 - L -焦谷氨酸 - N -乙酰葡萄糖胺 - D -海藻糖 - 丙酸 + D -丝氨酸 - 核糖醇 - 松二糖 - 奎尼酸 - L -丝氨酸 + L -阿拉伯糖 - 木糖醇 - D -己糖酸 - L -苏氨酸 + D -阿糖醇 - 丙酮酸甲酯 + 葵二酸 - D ，L -肉碱 - D -纤维二糖 - 丁二酸-甲酯 + 丁二酸 - g -氨基丁酸 - i -赤藓醇 - 乙酸 + 溴代丁二酸 + 尿刊酸 - D -果糖 - 顺-阿康酸 - 琥珀酰氨酸 - 肌苷 + L -果糖 - 柠檬酸 - 葡糖醛酰胺 - 尿苷 + D -半乳糖 - 甲酸 - L -丙氨酰胺 + 胸苷 + 龙胆二糖 - D -半乳糖酸内酯 - D -丙氨酸 - 苯基乙胺 - a -D -葡萄糖 + D -半乳糖醛酸 - L -丙氨酸 + 腐胺 - m -肌醇 - D -葡糖酸 - L -丙氨酰甘氨酸 + 2-氨基乙醇 - a -D -乳糖 - b -甲基葡糖苷 - L -天冬酰胺 + 2，3.丁二醇 - L a c t u i o s e - D -葡糖醛酸 - L -天冬氨酸 + 甘油 + 麦芽糖 + a - - L -谷氨酸 + D ，E -甘油磷酸盐 - D -甘露醇 - b - + 甘氨酰天冬氨酸 + D -葡糖-1-磷酸 + D -甘露糖
- g - + 甘氨酰谷氨酸 + D -葡糖-6-磷酸 +
[0007]
随着社会的发展和人类的进步，人们对农产品化学污染越来越担忧，迫切期望以生物 农药替代化学农药。为此，国际上很多发达国家投入相当大的人力、财力发展生物农药，但生物杀菌剂产品开发的较多，生物杀虫剂产品开发的进展不快。 [0008] 就对化学农药抗药性较强的小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等重大鳞翅目害虫
的生物农药应用而言，国内外市场上主要产品仍然是德国人贝尔奈(Berliner)于100年前发明并研究制造出来的苏云金杆菌杀虫剂(BT)，目前为止尚未有其他替代产品，更未有用短稳杆菌GXW15-4制造杀虫剂的先例。
[0009] 本发明填补用短稳杆菌制造杀虫剂的空白，可望形成继苏云金杆菌(BT)之后的一个全新且全部拥有中国自主知识产权的短稳杆菌农药产业。
[0010] 本发明所称的短稳杆菌农药包括短稳杆菌悬浮剂和短稳杆菌母药。短稳杆菌悬浮剂是一种含有高浓度短稳杆菌GXW15-4活体的乳白悬浮液。短稳杆菌母药是一种具有高含量短稳杆菌GXW15-4活体的淡黄粉末。
[0011] 短稳杆菌悬浮剂可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物鳞翅目害虫的防治。短稳杆菌母药既可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物害虫防治，也可深加工形成其他剂型的短稳杆菌农药，还可与化学农药复配后用于兼治植物其他病虫害。
[0012] 短稳杆菌农药喷施于植物表皮后，短稳杆菌GXW15-4经口吸进入植物害虫体内，24小时内导致植物鳞翅目害虫病变死亡。
[0013] 施用短稳杆菌农药可避免农作物被化学农药污染，且对植物本身、对植物害虫天敌、对人畜禽安全性好。
[0014] 短稳杆菌GXW15-4可采用微生物三级发酵技术大量繁殖。发酵产物可直接形成短稳杆菌悬浮剂，其制造步骤为：
[0015] (1)解剖罹病死亡的害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15-4菌株。
[0016] (2)将分离、提取出来的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2。
[0017] (3)选出试管LB斜面活力强的优良菌株，用摇床培养法扩大培养，培养条件与步骤(2)相同。
[0018] (4)用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，采用灭菌后的大豆粉(或者豆奶粉)4.5％、蚕蛹粉3％、钙粉1％、食盐0.5％等作为培养基质，加适量水和短稳杆菌GXW15-4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤(2)相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装即为短稳杆菌悬浮剂产品。
[0019] 短稳杆菌GXW15-4一级发酵产物或者二级发酵产物经高速离心脱水、三级冷冻干燥便可形成短稳杆菌母药，其制造步骤为：
[0020] (1)将短稳杆菌悬浮液制造过程中的一级发酵产物或者二级发酵产物放置高速离心机中进行先期脱水处理。
[0021] (2)将高速离心脱水处理后的产物用三级冷冻干燥机进行干燥处理，温度分别控制在-5℃、-15℃、-75°，使其成为含水量小于5％的粉剂，包装形成短稳杆菌母药。[0022] 短稳杆菌悬浮剂和短稳杆菌母药制造工艺流程如附图所示。
[0023] 附图说明：附图是短稳杆菌农药制造工艺图。
[0024] 经南京农业大学测定，短稳杆菌悬浮剂对小菜蛾幼虫有明显的杀虫活性。经环境保护部南京环境科学研究所试验，短稳杆菌悬浮剂田间正常使用对斑马鱼、大型溞、小球藻、蜜蜂、鹌鹑均为低风险。经江苏省疾病预防控制中心检验，短稳杆菌悬浮剂对雌雄大鼠属微毒级，对家兔皮肤无刺激性，属弱致敏物。经中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控
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