(10)申请公布号 CN 102559563 A
(43)申请公布日 2012.07.11C N 102559563 A *CN102559563A*
(21)申请号 201210054656.2
(22)申请日 2012.03.05
CGMCC NO.5493 2011.11.29
C12N 1/20(2006.01)
A23K 1/14(2006.01)
A23L 1/317(2006.01)
A23L 1/315(2006.01)A23L 1/314(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
(71)申请人江南大学
地址214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号
(72)发明人陈卫 赵建新 田丰伟 张灏
王刚 张秋香 刘小鸣 陈海琴
宋元达 宁佳
(74)专利代理机构北京君智知识产权代理事务
所 11305
代理人向华
(54)发明名称
(57)摘要
特菌生长的乳酸片球菌CCFM7902及其用途。它
具有耐酸性、耐胆盐能力、在体外对单核细胞增
中对单核细胞增生李斯特菌的生长具有抑制作
用、对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株
HT-29细胞具有保护作用、对单核细胞增生李斯
特菌感染小鼠肝脾具有保护作用。所述乳酸片球
菌CCFM7902可以用于制备生产青贮饲料、发酵香
肠等食品。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书12页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 1 页
1.一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。
2.根据权利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902，其特征在于它具有下述性质：
(1)具有耐酸性，在pH3.0下能存活；
(2)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％；
(3)在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用；
(4)对单核细胞增生李斯特菌在食品中的生长具有抑制作用；
(5)对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用；
(6)对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。
3.根据权利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有该菌株的工作发酵剂生产青贮饲料与发酵香肠中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在所述工作发酵剂中乳酸片球菌CCFM7902的浓度是109cfu/g以上。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的工作发酵剂是按照下述方法制备得到的：
按照以MRS液体培养基重量计1～2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h进行活化，连续以相同方式进行活化2-3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计1-3％接种量再接种于MRS 培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h，接着在温度2-6℃与转速3500-4500r/min的条件下进行离心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然
后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为109cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度 -80℃的条件下预冻2-6h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的冻干保护剂悬液是按照下述方法制备得到的：
将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的青贮饲料是按照下述步骤制备的：
首先，将青贮饲料原料揉切至1～4cm后待用。
然后，将0.5重量份根据权利要求5所述方法制备的工作发酵剂溶入到200-250重量份温度30℃-40℃的水中，搅拌溶解得到一种工作发酵剂悬液；
接着，把该工作发酵剂悬液喷洒到2000重量份的青贮饲料原料中，翻拌均匀，将青贮饲料原料的水含量控制在以重量计65％-75％；当饲料原料的水含量超过其范围时，让饲料原料在日光下晾晒，使其含水量达到其范围；当饲料原料的水含量低于其范围时，往其饲料原料中喷洒水，使其含水量达到其范围；
最后，把如此处理的青贮饲料原料装入青贮饲料桶中压实，然后密封，在常温下发酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的青贮饲料。
8.根据权利要求3或7所述的用途，其特征在于所述的饲料原料是一种或多种选自稻草、玉米秸秆、高粱秸秆、小麦秸秆、天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物或嫩
枝树叶的青贮饲料。
9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵香肠是按照下述步骤制备的：
首先，将选自猪肉、牛肉、羊肉或鸡肉的肉切碎，在温度-6℃～-8℃的冷藏室中进行预冻24h；
然后，让预冻肉与食盐、白砂糖、亚硝酸钠、复合磷酸盐按照重量比100∶3∶1.5∶0.015∶0.3充分混合得到一种混合物，所述的复合磷酸盐是由多聚磷酸钠、焦磷酸钠和磷酸氢二钠按照重量比2∶1∶1复配而成的，
接着，将所述的混合物置于温度0～4℃下腌制24h，加入按照肉重量计5-10％香辛料，搅拌混合，然后加入根据权利要求5所述方法制备的工作发酵剂，其加入量是以肉重量计0.5～1％，接着把含有工作发酵剂的肉灌注到肠衣中，得到一种灌肠；
最后，所述的灌肠在温度14℃～18℃与相对湿度85％的条件下发酵20天；发酵结束后在温度66-70℃进行烘烤，冷却后得到所述的发酵香肠。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。
一种乳酸片球菌CCFM7902及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，还涉及所述乳酸片球菌CCFM7902的用途。
【背景技术】
[0002] 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在分类上属李斯特菌属，该属有8个菌种，普遍认为仅有单核细胞增生李斯特菌能引起食物中毒。该菌为革兰氏阳性小杆菌，需氧或兼性厌氧，生长温度3-45℃，具有嗜冷性，能在低至4℃的温度下生存和繁殖。李斯特菌在自然界中广泛存在，土壤、水、食品都是其生境，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷个体均属是易感人。食源性单核细胞增生李斯特菌可引起脑膜炎、败血症和流产，发病率虽不高，但死亡率有时可达20％-50％。食品中存在的李斯特菌对人类的安全具有较大威胁，也是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
[0003] 益生菌是一种通过改善平衡宿主的肠道内菌，拮抗肠道内病原菌，从而对宿主起到有益作用的
活性微生物。拮抗作用具有菌株特异性，并非所有的益生菌都对同一种病原菌起作用。益生菌中有很多属于乳酸菌，乳酸菌代谢可以产生有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等多种代谢产物，可以抑制食品中的腐败菌和病原菌。刘洁等(上海交通大学学报(农业科学版)，24(3)：221-225，2006)研究发现，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有明显的抑制作用，其发酵液对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用受pH影响显著；周伟、李平兰等(食品科学，27(2)：121-125，2006)研究了植物乳杆菌素L-1对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用，并探讨了温度、pH及盐对抑制效果的影响。单核细胞增生李斯特菌对细胞的粘附是其侵染的前提，乳酸菌可以通过占位作用排除致病菌，或者它分泌代谢产物以抑制致病菌。除此之外，乳酸菌还能够增强机体免疫反应，从而达到清除致病菌的作用。Sinea等人(FEMS immunology and medical microbiology、50(380-388)，2006)应用细胞模型发现，其所用的乳酸杆菌是通过代谢产物而非粘附作用对单核细胞增生李斯特菌产生抑制拮抗作用并刺激细胞的自身免疫。由此可见，乳酸菌及其代谢产物可能对单核细胞增生李斯特菌的污染具有一定的预防或干预作用，有作为抗生素的辅助剂的潜能，筛选具有优良拮抗特性的乳酸菌对于抑制单增李斯特菌的污染很有必要。本发明经过体外筛选、细胞模型和应用研究发现，从泡菜中分离出的一株乳酸片球菌CCFM7902对单核细胞增生李斯特菌具有明显的抑制作用。
[0004] 目前公开的关于乳酸片球菌及其抑菌物质的文献很有限，其中关于乳酸片球菌素的报道较多，如CN101050437和CN102115720A分别公开了生产片球菌素的方法；CN102127578A公开了一种积累片
球菌素的方法，可以增加片球菌素的生产量。也有少数专利是关于乳酸片球菌作为发酵剂的作用，如CN101289647公开的一株片球菌能够在发酵香肠中作为发酵剂的应用，改善发酵香肠的风味。本发明在体外拮抗的基础上，通过细胞模型发现乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用，动
物模型中乳酸片球菌对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。此乳酸片球菌具有潜在的应用价值。可应用于食品体系中，为控制单核增生李斯特菌提供了一种基于生物拮抗的控制方法，对于减少动物疾病发生，提高相关产品的安全性具有重要意义。[0005] 因此，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量试验研究，终于完成了本发明。
【发明内容】
[0006] [要解决的技术问题]
[0007] 本发明的目的是提供一种具有抑制单核细胞增生李斯特菌生长的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902。
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述乳酸片球菌CCFM7902的用途。
[0009] [技术方案]
[0010] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0011] 本发明涉及一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5493。[0012] 本发明的乳酸片球菌CCFM7902具有下述性质：
[0013] (1)具有耐酸性，在pH3.0下能存活；
[0014] (2)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐浓度达0.3％；
[0015] (3)在体外对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用；
[0016] (4)对单核细胞增生李斯特菌在食品中的生长具有抑制作用；
[0017] (5)对单核细胞增生李斯特菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用；[0018] (6)对单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保护作用。
[0019] 本发明还涉及所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有该菌株的工作发酵剂生产青贮饲料与发酵香肠中的用途。
[0020] 在所述的工作发酵剂中乳酸片球菌CCFM7902的浓度是109cfu/g以上。[0021] 根据本发明，所述的工作发酵剂是按照下述方法制备得到的：
[0022] 按照以MRS液体培养基重量计1～2％接种量，将乳酸片球菌CCFM7902原始菌种接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h进行活化，连续以相同方式进行活化2-3代，得到活化培养物，然后按照以MRS液体培养基重量计1-3％接种量再接种于MRS培养基中，在温度37℃的条件下培养20-28h，接着在温度2-6℃与转速3500-4500r/ min的条件下进行离心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入冻干保护剂悬液，调整菌液浓度为109cfu/ml，混匀后装入冻干瓶中，在温度-80℃的条件下预冻2-6h，然后转入真空冷冻干燥机进行冻干，于是得到所述的工作发酵剂，它在温度4℃下保存。
[0023] 根据本发明，所述的冻干保护剂悬液是按照下述方法制备得到的：
[0024] 将脱脂乳、海藻糖与去离子水按照重量比为1∶1∶8进行混合溶解，得到的溶液在温度115℃的条件下灭菌10min，得到所述的冻干保护剂悬液，它在温度4℃下保存。[0025] 在本发明中，所述的青贮饲料是按照下述步骤制备的：
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