(10)申请公布号 CN 102586383 A
(43)申请公布日 2012.07.18C N 102586383 A
*CN102586383A*
(21)申请号 201210066604.7
(22)申请日 2012.03.15
CGMCC No.5849 2012.03.06
C12P 39/00(2006.01)
C12P 19/30(2006.01)
C12R 1/125(2006.01)
C12R 1/13(2006.01)
C12R 1/15(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/38(2006.01)C12R 1/865(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(71)申请人齐鲁制药有限公司
地址250100 山东省济南市历城区工业北路
243号
(72)发明人王晶翼 潘怀明 孙英侠 毕晓峰
薛永玲
(74)专利代理机构济南金迪知识产权代理有限
公司 37219
代理人赵龙
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种胞磷胆碱的制备方法，是以
嘧啶从头合成为基础反应，在有微生物A 的培养
理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20～
38℃反应10～72小时，控制pH 5～7.5，累积生
成胞磷胆碱；利用简单的起始原料碳、氮源，在含
有胆碱原料的培养液中，利用代谢过程合成胞磷
胆碱的前体胞嘧啶系核苷酸，在此反应溶液中反
应累积生成胞磷胆碱；该方法避免使用价格昂贵
的嘧啶系核苷酸或其前体原料，使得胞磷胆碱的
制备成本大大降低。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书7页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 7 页
1.一种胞磷胆碱的制备方法，以嘧啶从头合成为基础反应，该方法包括：在有微生物A 的培养液存在的情况下，或者还有微生物B的培养液或处理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20～38℃反应10～72小时，控制pH 5～7.5，累积生成胞磷胆碱；
所述的胆碱原料选自胆碱、氯化胆碱、磷酸胆碱、碘化胆碱或溴化胆碱；
所述微生物A选自属于棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Rseudomonas)、酿酒酵母属(Saccharomyces cerevisiae)中的一个或2个以上属的菌株。
所述微生物B选自①啤酒发酵的工业啤酒酵母菌体，或者②含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌之一，或者是③含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌的转化体、培养液或提取物。
2.如权利要求1所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于所述微生物A为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QL28001保藏号CGMCC No.5849，谷氨酸棒状杆菌保藏号ATCC No.13032，洋葱假单胞菌保藏号ATCC No.25416，柠檬节杆菌保藏号ATCC No.11624，酿酒酵母保藏号ATCC No.40075之一。
3.如权利要求1所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌QL28001接种于含有0.1-5％葡萄糖、0.5-5％牛肉膏、1-10％蛋白胨、0.5-5％酵母粉、0.5-1％氯化钠成分的培养液中，32℃培养至糖耗尽时，得微生物A的培养物；
按5wt％的接种量将微生物A的培养物接种于培养液中，所述培养液是含有碳源、氮源和微量元素的水溶液，该培养液碳源浓度为8-20wt％、氮源浓度为3-6wt％、微量元素浓度为0.2-5wt％，并添加0.1-3％的磷酸盐，30～35℃培养5～25h；得含有微生物A的培养液，或者将培养液离心收集菌体；
(2)向步骤(1)的含有微生物A的培养液中加入胆碱原料，胆碱原料加量为培养液重量的0.5-3wt％，在反应温度20～38℃，反应10～72小时，控制pH 5～7.5条件下反应累积生成胞磷胆碱；
或者，
将步骤(1)的含有微生物A的培养液按照5-30wt％的接种量接种于含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料和微生物B的培养液中，在反应温度20～38℃，反应10～72小时，控制pH 5～7.5，在此培养液中反应累积生成胞磷胆碱。该培养液中碳源浓度为8-20wt％，氮源浓度为3-6wt％，微量元素浓度为0.2-5wt％，微生物B浓度为5-30wt％，胆碱原料加量为培养液重量的0.5-3wt％，30～35℃培养5～25h。
4.如权利要求3所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的培养液中还添加有0.005-0.05wt％的表面活性剂；优选的，表面活性剂为吐温-80。
5.如权利要求1所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)将微生物A接种于含有0.5％葡萄糖、0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％氯化钠成分的培养液中，32℃培养至糖耗尽时，分离菌体得微生物A的培养物；
2)将步骤1)微生物A的培养物按照5-20wt％的接种量接种于含有碳源、氮源、微量元素的培养液中，在反应温度20～38℃，反应10～30小时分离菌体；所述培养液中碳源浓度为8-20wt％，氮源浓度为3-6wt％，
微量元素浓度为0.2-5wt％；
3)将步骤2)菌体按照5-30wt％加入含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料、表面活性剂和微生物B的培养液中，在反应温度20～38℃，反应20～72小时，控制pH 5～7.5，在此培养液中反应生成累积胞磷胆碱。所述培养液中碳源浓度为8-20wt％，氮源浓度为3-6wt％，微量元素浓度为0.2-5wt％，微生物B浓度为5-30wt％，胆碱原料加量为培养液重量的0.5-3wt％；或者，
将步骤2)的菌体按照5-30wt％加入含有碳源、氮源、微量元素、胆碱原料的培养液中，在反应温度20～38℃，反应20～72小时，控制pH 5～7.5，在此培养液中反应生成累积胞磷胆碱；所述培养液中碳源浓度为8-20wt％，氮源浓度为3-6wt％，微量元素浓度为0.2-5wt％，胆碱原料加量为培养液重量的0.5-3wt％。
6.如权利要求5所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于步骤3)的培养液中还添加有0.005-0.05wt％的表面活性剂，或/和步骤2)、3)的培养液中还添加有0.1-3％的磷酸盐；优选的，表面活性剂为吐温-80。
7.如权利要求3或5所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于，所述碳源选自以下之一：
a、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、山梨糖、葡萄糖酸、糖蜜、甘油或淀粉水解物，
b、丙酮酸、乳酸、柠檬酸或丙酮酸，
c、玉米浆或甘蔗渣。
8.如权利要求3或5所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于所述氮源选自玉米浆、酵母粉、酵母浸膏、硫酸铵、氨水、氨气、醋酸铵、谷氨酰胺、尿素之一或组合。
9.如权利要求3或5所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于所述的微量元素选自镁盐、锰盐、钴盐、铜盐、钾盐、D-生物素中的一种或组合；优选硫酸镁、磷酸二氢钾、D-生物素之一或组合。
10.如权利要求1所述的胞磷胆碱的制备方法，其特征在于反应条件为pH 6～7，反应温度30～35℃，反应时间控制在30～48小时。
胞磷胆碱的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种胞磷胆碱的制备方法，具体涉及发酵法制备胞磷胆碱，属于生物制药技术领域。
背景技术
[0002] 胞磷胆碱(CDPC)是磷脂类磷脂酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成必须的辅酶。胞磷胆碱临床上
广泛用于脑缺血、脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和老年性痴呆等疾病的。胞磷胆碱又名胞二磷胆碱，胞苷二磷酸胆碱。胞磷胆碱已知的制备方法有化学合成法、使用酵母等微生物菌体的酶法、利用基因重组微生物进行转化的酶法等。
[0003] 这些制备方法中的共同点是作为原料使用了价格昂贵的胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、胞嘧啶等嘧啶系核苷酸及其前体乳清酸、尿嘧啶等，使得胞磷胆碱的制备成本较高。
[0004] 使用酵母等微生物菌体的酶法制造胞磷胆碱，是以胞苷酸和磷酸胆碱作为原料，利用微生物提供反应所需磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。
[0005]
[0006] 此过程中的起始物胞苷酸的价格是非常昂贵的，使得制备成本居高不下。[0007] CN1074938公开了胞苷二磷酸胆碱的制备方法，该方法是以微生物提供反应所需胞苷三磷酸合成酶、磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)等一系列酶，一步催化完成胞磷胆碱的制备。CN1653188公开了胞苷5’-二磷酸胆碱的制备方法，该方法采用胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶在水溶性介质中与生物催化剂接触，蓄积生成CD
P-胆碱。CN102199643A 公开了一种胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。CN101538598A提供一种胞二磷胆碱的制备方法，其特征是以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱；其中，所述的胞苷一磷酸前体为乳清酸或胞苷；所述的小分子化学效应物质为镁离子、钾离子中的任意一种或两种，与甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一种或几种的组合物。
[0008] 以上方法的起始原料乳清酸或尿嘧啶或胞苷酸等价格都比较昂贵，成本也较高。
发明内容
[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供一种以嘧啶从头合成为基础反应的微生物发酵法制备胞磷胆碱的方法。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的方法不使用嘧啶系核苷酸或其前体如乳清酸、尿嘧啶等价格昂贵的原料，而使用工业上易于得到的、廉价的、可提供胆碱的原料(如氯化胆碱、磷酸胆碱等)经过微生物发酵，制备胞磷胆碱。
[0012] 本发明的方法以嘧啶从头合成为基础反应，由简单的起始原料碳、氮源开始，利用一些特定微生物体内合成代谢途径，合成磷酸核糖、氨基酸以及一碳单位与二氧化碳等简单物质，继而合成制备胞磷胆碱的前体胞嘧啶系核苷酸，在含有可提供胆碱的原料如磷酸胆碱或氯化胆碱等的培养液中，由微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下累积生成胞磷胆碱。
[0013] 嘧啶核苷酸的从头合成途径的原料是天冬氨酸、谷氨酰胺、CO2等，这些氨基酸来自生物体内的氨基酸合成代谢。反应过程中的关键酶在不同生物体内有所不同，在细菌中，嘧啶核苷酸的生物合成，受到终产物反馈控制的点有三个：合成途径的第一个调节酶是氨基甲酰磷酸合成酶，它受尿嘧啶核苷酸(UMP)的反馈抑制；另两个调节酶是天冬氨酸氨甲酰转移酶和胞苷三磷酸(CTP)合成酶，它们都受胞苷三磷酸(CTP)的反馈抑制。前者被抑制将影响尿苷酸和胞苷酸的合成，后者被抑制只影响胞苷酸的合成。
[0014] 很多微生物发酵能够产生胞嘧啶系核苷酸，如果解除UMP、CTP的反馈抑制作用，截止嘧啶合成途径中的起始氨基酸天冬氨酸的分支代谢途径，并选择产胞嘧啶系核苷酸活跃时期的菌体或培养物作为产胞嘧啶系核苷酸的酶源，能够较快速的代谢生成胞嘧啶系核苷酸，在该微生物或其它微生物提供的磷酸胆碱转胞苷酰酶的参与下，累积生成胞磷胆碱。从而避免使用价格昂贵的嘧啶系核苷酸为前体物，进一步降低制备成本。
[0015] 本发明以此为出发点，选择了适宜该方法的菌株，通过微生物发酵制备胞磷胆碱。[0016] 发明详述
[0017] 本发明的技术方案如下：
[0018] 一种胞磷胆碱的制备方法，以嘧啶从头合成为基础反应，该方法包括：在有微生物A的培养液存在的情况下，或者还有微生物B的培养液或处理物存在的情况下，将胆碱原料在反应温度20～38℃反应10～72小时，控制pH 5～7.5，累积生成胞磷胆碱。[0019] 所述的胆碱原料选自胆碱、氯化胆碱、磷酸胆碱、碘化胆碱或溴化胆碱。
[0020] 所述微生物A选自属于棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Rseudomonas)、酿酒酵母属(Saccharomyces cerevisiae)中的一个或2个以上属的菌株。所用菌株具备以下特征：[0021] (1)能够代谢产生胞嘧啶系核苷产物；
[0022] (2)具有嘧啶系结构类似物抗性，能够解除UMP、CTP产物的反馈抑制作用；[0023] (3)代谢酶系统中的胞苷脱氨酶缺失，阻断所合成的胞嘧啶系核苷酸脱氨恢复转化为尿嘧啶系核苷酸；
[0024] (4)能够截止高丝氨酸脱氢酶作用途径，积累嘧啶从头合成的前体物天冬氨酸；[0025] (5)具有磷酸胆碱转胞苷酰酶活性，能够将所合成的胞苷酸系产物如胞苷酸、胞苷三磷酸等转化为胞磷胆碱，该酶可以来自天然微生物或者是转导子编码磷酸胆碱转胞苷酰酶的DNA而得到的转化体。
[0026] 所述微生物B选自①啤酒发酵的工业啤酒酵母菌体，或者②含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌之一，或者是③含有磷酸胆碱转胞苷酰酶的大肠杆菌、谷氨
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议