(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.12.11C N 103436476 A (21)申请号 201310425907.8
(22)申请日 2013.09.17
CGMCC No.7815 2013.06.24
C12N 1/20(2006.01)
C12P 17/16(2006.01)
C12R 1/37(2006.01)
(71)申请人中国科学院烟台海岸带研究所
地址264003 山东省烟台市莱山区春晖路
17号
(72)发明人焦绪栋 秦松 崔玉琳 李莉莉
(74)专利代理机构沈阳优普达知识产权代理事
务所(特殊普通合伙) 21234
代理人张志伟
(54)发明名称
(57)摘要
于生物工程领域，具体为一种灵菌红素产生菌及
其制备方法与应用。该菌为普通变形杆菌Proteus
vulgaris ，于2013年6月24日在中国微生物菌种
保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC 保藏，保
藏编号：CGMCC No.7815，保藏单位地址：北京市
朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研
究所。该菌能够发酵产生灵菌红素PG ，采用改良
18～24h 、转速150～300rpm ，PG 产量可达80～
120mg/L 。所产的灵菌红素对金黄葡萄球菌、甲
型副伤寒沙门菌、白念球菌和铜绿假单胞菌具
有抑制活性，该菌在活性灵菌红素的生物制备方
面有很好的应用前景。(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图2页(10)申请公布号CN 103436476 A
*CN103436476A*
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1.一种灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌为普通变形杆菌Proteus vulgaris ，于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC 保藏，保藏编号：CGMCC No.7815，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.按照权利要求1所述的灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌代号为P3，在LB 培养基上菌落呈红，呈波纹状分布，革兰氏染阴性。
3.按照权利要求1所述的灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌的菌株16SrDNA 的GenBank 登陆号为：KF657723。
4.一种权利要求1所述的灵菌红素产生菌的制备方法，其特征在于：采集海边泥土，取样品1g ，加入100ml 无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB 固体培养基平板，28℃倒置培养24h ～48h ，筛选红菌落；经反复驯化分离纯化，得到灵菌红素产生菌；其中，LB 固体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L ，酵
母粉5g/L ，琼脂粉15g/L ，氯化钠10g/L ，pH7.0～7.5。
5.一种权利要求1所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于：灵菌红素产生菌应用在灵菌红素发酵制备中。
6.按照权利要求5所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于：种子培养基采用LB 液体培养基，其成分为1L 培养基中含有：10g 胰蛋白胨，5g 酵母粉，10gNaCl ，余量为水；取10～100μL-80℃保存的灵菌红素产生菌浓度为50～70wt%的甘油菌液，加入5～10mL 所述的LB 液体培养基中，28～30℃培养12～24h 至OD 600达0.6～1.0，以此作为种子液，进行发酵；发酵培养基采用改良的无机盐培养基，1L 培养基中含有：氯化钠0.5～1g ，磷酸二氢钾1g ，磷酸氢二钾3g ，氯化铵1～1.2g ，硫酸镁1g ，硝酸铵2g ，果糖或蔗糖20～50g ，酵母粉0.1～0.5g ，余量为水，pH
7.0～
8.0；
将上述种子液按照0.5～2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20～28℃，转速150～300rpm ，培养18～24h 得到发酵液。
7.按照权利要求6所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于：将发酵液经6000～10000rpm ，4～10℃
离心8～10min ，所得菌液的上清液用体积比为1:1～1:2的乙酸乙酯萃取，混匀后静置10～20min ，利用分液漏斗分离保存有机相；菌液沉淀用3～5倍体积的丙酮萃取，充分混匀，静置5～10min ，在4～10℃下，6000～8000rpm 离心3～5min ，取有机相；将获得的乙酸乙酯萃取液和丙酮萃取液经50～60℃减压蒸馏至总体积的1～2%，混合后冷冻干燥得灵菌红素粗品，灵菌红素产量80～120mg/L 。
8.按照权利要求7所述的灵菌红素产生菌的应用，其特征在于：将获得的灵菌红素溶于二甲基亚砜或酸性甲醇，配制浓度为0.5～1g/L ，对金黄葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白念球菌或铜绿假单胞菌具有抑制活性。权 利 要 求 书CN 103436476 A
一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用技术领域
[0001]
本发明涉及活性产物的发酵生产及制备，属于生物工程领域，具体为一种灵菌红
素产生菌及其制备方法与应用。背景技术
[0002] 灵菌红素(Prodigiosins ，PG)是一类具有三吡咯环的天然红素的总称，又名灵
杆菌素、灵菌素，分子式为C 20H 25N 3O(M=323.1968)，是一类脂溶性红素。PG 固体是一种呈暗
红的素，具有绿反光，熔点151～152℃，几乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和苯等有机溶剂。在碱性或中性溶液中呈橙黄，酸性溶液中呈红。在不同的酸碱条件下呈特有的最大紫外吸收波长：酸性条件在530～540nm 之间有特征吸收峰，碱性条件在466～480nm 之间有特征吸收峰。该素具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制、抗肿瘤等活性，在染、抑制赤潮方面也受到关注，在抗肿瘤方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质。
[0003] PG 可由一些链霉菌属（streptomyces ）、沙雷氏菌属（serratia ）及假单胞菌属（pseudomonas ）等部分菌株产生的次级代谢产物，1929年由Amok 等在研究Serratia 生长时发现，并由Harashima 等首次从粘质沙雷菌(Serratia marcescens)中分离并纯化出来。关于PG 的研究始于美国，而后在欧美一些发达国家有了长足的发展，其中关于沙雷氏菌属(Serratia)产PG 的研究最多。Williams 以粘质沙雷氏菌(S.marcescens)Nima 株为出发菌株，摇瓶培养96h 后得到PG 的最高产量为0.0235g/L ；Alonzo 等以S.marcescens 为出发菌株，通过调节培养基的碳氮比，利用摇瓶培养48h 得到PG 的最高产量为0.1g/L ；Katsumt 与Nakamura 以S.marcescens R-2为出发菌株，摇瓶培养48h 得到灵菌红素的最高产量为0.17g/L ；Sole 等以S.marcescens 为出发菌株，通过调节培养基的pH ，摇瓶培养48h 得到PG 的最高产量为0.2g/L ；由于PG 更多的活性为人们所发现，其生产亦逐渐受到人们的重视。CangS 等以一株可以利用乙醇的S.marcescens S389为出发菌株，摇瓶培养48h ，使得PG 的产量
提高了数十倍，达到了2.95g/L ；Jungdon B 等以Serratia sp.KH-95(KFCC10970)为出发菌株，尝试利用反应器扩大发酵合成PG ，通过一系列的工艺条件优化，在有内置吸附剂的生物反应器中，得到了PG 产量最大为13.1g/L 。
[0004] 产PG 的菌多自海水或土壤中分离，在PG 的产量上还不是很理想，从自然资源中筛选得到具有高产PG 的微生物的途径很有应用前景；PG 的生产和另外一些表型（如：酪蛋白酶活性、血细胞凝集素活性）的产生也有一定联系，从遗传学角度解释这些现象需要做进一步研究。目前，PG 的摇瓶生产产量可观，但是与工业化大生产有一定距离。PG 属天然素，可大量用于食品工业，医疗事业等，现研究主要集中在PG 诱导肿瘤细胞凋亡的作用上，PG 的药理功效，药理机制以毒副作用等方面都尚未解决，这些方面都有待进一步深入研究。发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种灵菌红素产生菌及其制备方法与应用，解决发酵制备
活性灵菌红素中存在的优质菌株缺少、发酵周期长等问题。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 一种灵菌红素产生菌，该菌为普通变形杆菌Proteus vulgaris，于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号：CGMCC No.7815，保藏单位地址：北京
市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。[0008] 所述的灵菌红素产生菌，该菌代号为P3，在LB培养基上菌落呈红，呈波纹状分布，革兰氏染阴性。
[0009] 所述的灵菌红素产生菌，该菌的菌株16SrDNA的GenBank登陆号为：KF657723。[0010] 所述的灵菌红素产生菌的制备方法，采集海边泥土，取样品1g，加入100ml无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB固体培养基平板，28℃倒置培养24h～48h，筛选红菌落；经反复驯化分离纯化，得到灵菌红素产生菌；其中，LB固体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉15g/L，氯化钠10g/L，pH7.0～7.5。
[0011] 所述的灵菌红素产生菌的应用，灵菌红素产生菌应用在灵菌红素发酵制备中。[0012] 所述的灵菌红素产生菌的应用，种子培养基采用LB液体培养基，其成分为1L培养基中含有：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，余量为水；取10～100μL-80℃保存的灵菌红素产生菌浓度为50～70wt%的甘油菌液，加入5～10mL所述的LB液体培养基中，28～30℃培养12～24h至OD
达0.6～1.0，以此作为种子液，进行发酵；发酵培养基采用改良
600
的无机盐培养基，1L培养基中含有：氯化钠0.5～1g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾3g，氯化铵1～1.2g，硫酸镁1g，硝酸铵2g，果糖或蔗糖20～50g，酵母粉0.1～0.5g，余量为水，pH7.0～8.0；
[0013] 将上述种子液按照0.5～2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20～28℃，转速150～300rpm，培养18～24h得到发酵液。
[0014] 所述的灵菌红素产生菌的应用，将发酵液经6000～10000rpm，4～10℃离心8～10min，所得菌液的上清液用体积比为1:1～1:2的乙酸乙酯萃取，混匀后静置10～20min，利用分液漏斗分离保存有机相；菌液沉淀用3～5倍体积的丙酮萃取，充分混匀，静置5～10min，在4～10℃下，6000～8000rpm离心3～5min，取有机相；将获得的乙酸乙酯萃取液和丙酮萃取液经50～60℃减压蒸馏至总体积的1～2%，混合后冷冻干燥得灵菌红素粗品，灵菌红素产量80～120mg/L。
[0015] 所述的灵菌红素产生菌的应用，将获得的灵菌红素溶于二甲基亚砜或酸性甲醇，配制浓度为0.5～1g/L，对金黄葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白念球菌或铜绿假单胞菌具有抑制活性。
[0016] 本发明的优点及有益效果是：
[0017] 1、本发明所提供的灵菌红素产生菌P3来自山东省烟台市莱山区海岸带的泥土中，经人工富集、筛选、分离及纯化获得，能够高效发酵产生灵菌红素的细菌。经生理生化指标鉴定及16SrDNA分析，该菌为普通变性杆菌（Proteus vulgaris），代号P3。在常规LB固体培养基上菌落呈红，革兰氏染为阴性。
[0018] 2、本发明能够发酵生产灵菌红素的细菌及其在灵菌红素发酵生产与制备中的应用。该菌的纯培养物在改良的无机盐培养基和优化的培养条件下，24h灵菌红素的产量可达120mg/L。与现有的菌株相比，大幅缩短了发酵周期，有效提高了单位时间内灵菌红素的产
量。
[0019] 3、本发明针对灵菌红素的制备，提供一种低温萃取的制备工艺，利用低温高速离心、乙酸乙酯和丙酮萃取、低温浓缩、冷冻干燥，有效的保护了所制备的灵菌红素的活性。
附图说明
[0020] 图1：灵菌红素P3PG在甲醇溶液中紫外可见光吸收光谱扫描图。
[0021] 图2：灵菌红素P3PG质谱图（LC-MS）。其中，A谱为总离子流图；B、C谱为3.94min 的质谱图。
具体实施方式
[0022] 针对本发明所用菌种及其灵菌红素的发酵制备及活性分析，采用下述方式具体实施。但本发明所述的实施方式不限于此。
[0023] 实施例1：灵菌红素产生菌的筛选分离
[0024] 采集山东省烟台市莱山区海边泥土，取样品1g，加入100ml无菌去离子水，梯度稀释后涂布LB固体培养基平板，28℃倒置培养24h～48h，筛选红菌落。经反复驯化分离纯化，得到一株灵菌红素产生菌P3。其中，LB固体培养基的成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/ L，酵母粉(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，余量为水；pH7.0～7.5，121℃，20min高压灭菌，待冷却至50～60℃时，倒制平板。
[0025] 平板观察该菌落呈明亮的红，呈波纹状分布，革兰氏染为阴性。该菌于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，经鉴定该菌的分类命名为普通变性杆菌（Proteus vulgaris）。
[0026] 对获得的菌株进行16SrDNA序列测定，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，反应总体系为，取PCR产物2～5μl进行1wt%琼脂糖凝胶电泳，EB染后紫外检测.用琼脂糖凝胶纯化试剂盒（购自大连宝生物公司）切胶回收1.5kb大小的PCR产物进行测序分析。菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank，并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利用MEGA4.0软件，构建系统发育树，分析各分离菌株的进化地位。经鉴定：该菌株16SrDNA的GenBank登陆号为：KF657723。[0027] 实施例2：灵菌红素产生菌P3的发酵培养
[0028] 种子培养基采用LB液体培养基，其成分为1L培养基中含有：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，
余量为水。
[0029] 取10～100μL-80℃保存的灵菌红素产生菌P3浓度为50～70wt%的甘油菌液，加入5～10mL LB液体培养基中，28～30℃培养12～24h至OD
600
达0.6～1.0，以此作为种子液，进行发酵。
[0030] 发酵培养基采用改良的无机盐培养基，1L培养基中含有：氯化钠(NaCl)0.5～1g，
磷酸二氢钾（KH
2PO
4
）1g，磷酸氢二钾（K
2
HPO
4
）3g，氯化铵（NH
4
Cl）1～1.2g，硫酸镁（MgSO
4
）
1g，硝酸铵（NH
4HO
3
）2g，果糖或蔗糖20～50g，酵母粉0.1～0.5g，余量为水，pH7.0～8.0。
[0031] 将种子液按照0.5～2wt%接种至上述发酵培养基中，避光，培养温度20～28℃，转速150～300rpm（转/分钟），培养18～24h得到发酵液。
[0032] 实施例3：灵菌红素P3PG的制备
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