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一种中药组合物、中药膏、中药膏的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及增加卵巢癌化疗敏感性和提高抗卵巢癌免疫应答中药配方技术领域，具体涉及一种用于增加卵巢癌化疗敏感性和提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物、由中药组合物制成的中药膏、中药膏的制备方法及其在制备增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提高抗卵巢癌免疫应答药物中的应用。

背景技术：

2.在卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，简称卵巢癌)的综合中，化疗占有重要地位，是延缓卵巢癌患者复发与赖以长期生存的主要措施。晚期患者的手术很难达到无肉眼残留病变的程度，对于残留的癌灶，有赖于术后化疗来杀灭。紫杉醇与铂类药物的联合应用仍然是目前卵巢癌的标准化疗方案。化疗初始反应较高，但多达80％的患者将最终复发并成为紫杉醇/铂耐药，这也是导致卵巢癌失败和预后不良的主要原因。70％以上卵巢癌表达toll样受体4(toll-like receptor4，tlr4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，myd88)信号通路肿瘤进展过程中篡夺或劫持了tlr4/myd88信号通路导致肿瘤细胞免疫逃逸，同时也参与细胞抗凋亡及肿瘤细胞化疗耐药。
3.前期体外细胞实验结果表明：在卵巢癌中，ao-i(即白术内酯-i)可以通过与ptx竞争性抑制结合md-2，阻断tlr4/myd88+依赖通路，增加紫杉醇对myd88+卵巢癌细胞的敏感性，降低卵巢癌细胞诱导的免疫抑制作用，改善机体免疫抑制状态。虽然ao-i可以降低卵巢癌细胞诱导的对免疫细胞的抑制作用，但是ao-i不具有触发免疫细胞对肿瘤抗原的识别和有效杀灭肿瘤细胞(如myd88+卵巢癌细胞)的作用，导致ao-i抗卵巢癌免疫应答存在一定的局限性。此外，ao-i是单体化合物，在卵巢癌中其剂型及不同给药途径导致其生物利用度低亟待解决。

技术实现要素：

4.本发明第一方面要解决在卵巢癌中，ao-i虽然可以降低卵巢癌诱导的免疫细胞的抑制作用，但是在免疫细胞识别和杀死肿瘤细胞方面存在一定局限，致使ao-i抗卵巢癌免疫应答的效果还有待提高的问题，提供了一种中药组合物，可以显著提高抗卵巢癌免疫应答的效果，主要构思为：
5.一种用于提高抗卵巢癌免疫应答效果的中药组合物，包括白术和生姜。在本方案中，白术中的有效成分为ao-i，生姜中的有效成分为6-s，本中药组合物同时包括白术和生姜，不仅可以使6-s与ao-i的联合形成一种可以口服的药剂，并可以显著提高其生物利用度，解决其剂型及不同给药途径的生物利用度的问题，便于卵巢癌患者服用，而且ao-i可以降低卵巢癌肿瘤细胞对免疫细胞的免疫抑制作用，同时，6-s可以通过促进卵巢癌肿瘤抗原的暴露来促进免疫细胞对卵巢癌肿瘤细胞的识别，二者可以相互配合和协同，使得6-s与ao-i的联合应用，不仅可以增加化疗抗卵巢癌细胞的作用，而且可以增强卵巢癌细胞免疫
应答的作用，从而可以解决ao-i不能促进免疫细胞识别和有效杀伤卵巢癌细胞的不足，显著提高抗卵巢癌的免疫应答效果及疗效。
6.为增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答的效果，优选的，各原料重量配比是：白术12份、生姜8份。
7.进一步的，所述白术采用的是麸炒白术。
8.本发明第二方面要解决提高中药组合物的生物利用度问题，提供了一种中药膏，采用所述中药组合物制备而成，其有效成分包括白术内酯-i和6-姜烯酚。
9.本发明第三方面要解决提高中药组合物中各有效成分收得率的问题，提供了一种利用所述中药组合物制备所述中药膏的方法，包括如下步骤：
10.步骤1、对中药组合物中的白术和生姜分别进行预处理，获得麸炒白术和生姜碎块，
11.步骤2、将中药组合物放入乙醇中浸泡，
12.步骤3、将浸泡后的中药组合物进行热回流提取，过滤，滤液另存，
13.步骤4、将滤液浓缩成中药膏。采用本制备方法可以显著提高中药组合物中各有效成分收得率。
14.优选的，步骤2中，采用处方量中药饮片6倍量的乙醇浸泡中药组合物。
15.优选的，步骤3中，在70℃的温度下，热回流提取至少2小时。
16.优选的，至少重复执行步骤3两次，并合并每次获得的滤液。以便进一步提高各有效成分收得率。
17.一种如前文所述的中药组合物在制备提高抗肿瘤免疫应答效果药物中的应用。
18.一种如前文所述的中药膏在制备抗肿瘤应答效果药物中的应用。
19.与现有技术相比，使用本发明提供的一种中药组合物、中药膏、中药膏的制备方法及其应用，该中药组合物不仅可以使6-s与ao-i的联合形成一种可以口服的药剂，解决6-s与ao-i都是单体化合物，其剂型及不同给药途径的生物利用度低的问题，便于卵巢癌患者服用，而且ao-i可以降低卵巢癌细胞诱导的对免疫细胞的抑制作用，同时，6-s可以通过促进卵巢癌肿瘤抗原的暴露来触发免疫细胞对卵巢癌肿瘤细胞的识别，二者可以相互配合和协同，从而可以解决ao-i不能促进免疫细胞识别和有效杀灭卵巢癌细胞的弊端，显著提升抗肿瘤免疫应答效果。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
21.图1为采用hplc谱分析法所得到的谱图，其中，左图为对照品(6-s和ao-i)的代表性hplc谱图，右图为供试品(6-s和ao-i)的代表性hplc谱图。
22.图2为血液中的药浓度曲线，其中，左图为ao-i在体内血液中的药浓度曲线，右图为6-s在内血液中的药浓度曲线。
23.图3为各组小鼠体内移植瘤细胞凋亡和增殖情况。
24.图4为各组荷瘤小鼠生存期曲线图。
25.图5为各组荷瘤小鼠肝肾组织he染图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.白术内酯-i(atractylenolide i，简称ao-i，后文不再赘述)是从白术中富含的一种倍半帖内酯化合物，是白术的主要成分，属于α-亚甲基-γ-内酯基，其化学式为c
15h18
o2，结构式如下：
[0029][0030]
现有的研究表明，在卵巢癌中，ao-i可以通过与ptx竞争性抑制结合md-2，阻断tlr4/myd88依赖通路，一方面，ao-i与紫杉醇配合使用，可以增加紫杉醇对myd88+卵巢癌细胞的敏感性；另一方面，ao-i可以降低卵巢癌细胞诱导的免疫细胞的抑制作用，改善机体免疫抑制状态。虽然ao-i可以降低卵巢癌细胞诱导的免疫细胞的抑制作用，但是ao-i不具有触发免疫细胞对肿瘤抗原的识别和有效杀灭肿瘤细胞(如myd88+卵巢癌细胞)的作用。
[0031]
6-姜烯酚(简称6-s，后文不再赘述)是生姜中富含的一种化学物质，属于α，β-不饱和羰基，其化学式为c
17h24
o3，结构式如下：
[0032][0033]
最新研究发现：在卵巢癌中，6-s具有三个主要作用：一是6-s可以增加紫杉醇对卵巢癌细胞的敏感性，效果与ao-i类似；二是6-s可以作用于微管蛋白，作用的点位与ao-i完全不同，但是可以稳定微管蛋白从而阻滞肿瘤细胞的有丝分裂；同时可以促进抗原的递呈和暴露(具体是：6-s可以促进卵巢癌细胞表面抗原的暴露)，从而可以诱导免疫细胞对肿瘤细胞的识别和攻击，也就是说，6-s可以使得卵巢癌肿瘤细胞的抗原暴露出来，使得免疫细胞能够识别卵巢癌肿瘤细胞，进而可以促进免疫细胞对卵巢癌肿瘤细胞的反应(包括识别和杀死卵巢癌肿瘤细胞)，既有利于提升抗肿瘤免疫应答效果，又可以更好增加抗卵巢癌的化疗敏感性的作用。
[0034]
由于6-s可以促进卵巢癌细胞表面抗原的暴露，诱导免疫细胞对肿瘤细胞的识别和攻击；因此，在本实施例中，创造性地将ao-i与6-s联合用于卵巢癌，研究发现，ao-i可以降低卵巢癌细胞诱导的对免疫细胞的抑制作用，同时，6-s可以通过促进卵巢癌细胞表面抗原的暴露来促进免疫细胞对卵巢癌细胞的识别，二者相互配合和协同，使得6-s加入
ao-i后，不仅可以增加化疗抗卵巢癌细胞的作用，而且可以增加免疫抗卵巢癌细胞的作用，从而可以解决ao-i不能促进免疫细胞识别和杀灭卵巢癌肿瘤细胞的弊端，可以显著提升抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答的效果。因此，ao-i与6-s联合可以应用于制备增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答效果的药物中，尤其是可以应用于制备提高抗卵巢癌免疫应答的药物中。
[0035]
但是ao-i和6-s都是单体化合物，不能直接用于卵巢癌的，基于此，本实施例首先提供了一种用于增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答效果的中药组合物，包括白术和生姜，其中，白术内富含白术内酯-i(ao-i)；白术是一种常见的中药，白术生用健脾燥湿，利水消肿，常常用于水湿内停之痰饮、水气外溢之水肿和风湿痹痛。麸炒白术能缓和燥性，增强健脾益胃消食的作用。《本草蒙荃》记载“麸制抑酷性，勿伤上膈”。麦麸性味甘、淡，能和中益脾，与药物共制能缓和药物的燥性，所以白术经过麸炒，可以增强健脾和中的作用。因此，在优选的实施方式中，该中药组合物中的白术可以优先采用麸炒白术。可以理解，在实施时，本中药组合物可以是有白术和生姜组成，当然，也可以在本中药组合物中增加一些其它的中药，使得本中药组合物至少包括白术和生姜。本中药组合物可以用于增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答效果。
[0036]
生姜是一种药食两用的中药材，是姜科多年生草本植物姜的新鲜根茎，别名有姜根、百辣云、因地辛等，可入药。生姜内富含6-姜烯酚(6-s)，生姜味辛、性微温，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳、解毒的功效，在传统中医中，生姜主要用于风寒感冒、脾胃寒症、胃寒呕吐、肺寒咳嗽、解鱼蟹毒等。
[0037]
该中药组合物是一个古方，选自宋
·
陈自明《妇人大全良方
·
产后呕逆不食方论第八》：治产后更无它疾，但多呕逆不能食。白术(五分)生姜(六分)，上细切，酒、水各二升，煎取一升，分三服。可件，该古方主要用于妇人产后多呕逆不能食的病症，而本发明创造性地将该中药组合物用于卵巢癌中增加化疗敏感性和提升抗免疫应答效果，不仅可以解决ao-i和6-s都是单体化合物，不能直接用于卵巢癌的的问题，而且可以显著提升抗卵巢癌的免疫应答和疗效。
[0038]
在本中药组合物中，白术和生姜的用量可以根据实际需求而定，但为了提高增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提高抗卵巢癌免疫应答的效果，通常在一副药中，白术的用量可以优先采用9-12g，而生姜的用量可以优先采用3-10g。而在配置本中药组合物时，各原料按重量配比，白术可以采用12份，生姜可以采用8份。例如，在一副中药组合物中可以包括12g白术和8g生姜。在使用时，可以将本中药组合物熬制成汤药服用。
[0039]
由于对于化疗期间的病人而言，化疗用药及辅助用药较多，不易服用大量汤药，因此，为解决这一问题，同时也为了提高中药组合物在体内的生物利用度，可以将所述中药组合物进一步煎煮成浓缩膏剂，既便于化疗病人口服，又可以解决ao-i和6-s都是单体化合物，直接口服不能有效被吸收的问题，在实施时，可以将中药组合物浓缩成15ml左右的中药复方浸膏(简称中药膏，后文不再赘述)。该中药膏的有效成分(即活性成分)包括ao-i和6-s。
[0040]
为便于将上述中药组合物制成中药膏，本实施例进一步提供了一种将所述中药组合物制成中药膏的制备方法，包括如下步骤：
[0041]
步骤1、对中药组合物中的白术和生姜分别进行预处理，获得麸炒白术和生姜碎
块。如前文所述，麸炒白术能缓和燥性，增强健脾益胃消食的作用，使得麸炒白术的效果明显优于白术，因此，在本步骤中，可以先利用现有的方法将白术制成麸炒白术，待用。同时，可以将生姜切碎，获得生姜碎块，以便增加生姜的表面积，更有利于后续浸泡。
[0042]
步骤2、将中药组合物放入浸泡液中浸泡，所述浸泡液至少包括乙醇。由于本中药组合物中的有效成分内酯类、姜烯醇和姜烯酚类等均是醇溶性物质，利用乙醇事先浸泡本中药组合物，更有利于后续提取出各组分的有效成分。在实施时，可以优先采用50％及50％以上的乙醇来浸泡中药组合物，以便最大限度的提取出有效成分。浸泡液需要有足够的量，例如，可以采用处方量中药饮片6倍量的浸泡液来浸泡中药组合物，又如，浸泡液的量至少浸过各组分药物3cm以上。在一种优选的实施方式中，所述浸泡液可以是50％的乙醇和等量的水混合而成。浸泡时间可以根据实际需求而定，例如，可以浸泡半小时、一小时、两小时、三小时等，为最大限度的提取出有效成分，浸泡时间可以大于或等于两小时。
[0043]
步骤3、加热浸泡后的中药组合物和浸泡液进行热回流提取，过滤，滤液另存。例如，可以在煎药锅中浸泡所述中药组合物，当浸泡时间达到要求后，可以用强火煎煮至沸腾，然后转为小火使药物保持轻微沸腾的状态，这个过程中，温度可以保持于70℃左右，时间可以是至少2小时，然后进行过滤，收集滤液。
[0044]
为提高各有效成分的收得率，在更进一步的实施方式中，可以重复上述步骤2和步骤3至少两次，以便多次提取中药组合物中的有效成分，最后合并每次获得的滤液即可。这样不仅可以提高中药组合物中各有效成分的收得率，而且有利于各有效成分更纯。
[0045]
步骤4、将滤液浓缩成中药膏。本步骤可以在真空浓缩器中实现，以便将滤液浓缩成15ml左右的中药复方浸膏；在这个过程中，温度可以控制为60-70℃，以免损伤药性。采用这种方式制备中药膏，不仅可以有效提取和保留中药组合物中的各有效成分，而且可以提高中药组合物中各有效成分收得率。在实施是，可以通过这种方式将中药组合物制成15ml左右的中药膏，可以将汤剂浓缩膏剂，不仅可以使药效显著，而且可以减少化疗患者服药的困难。
[0046]
1药物质量检测：检验所制备的中药膏的质量，具体如下：
[0047]
1.1材料及设备
[0048]
α-亚甲基-γ-内酯基化合物对照品(ao-i批号：a0541)、α，β-不饱和羰基化合物对照品(6-s批号：a0370)购自成都麦思特生物科技有限公司；
[0049]
谱分析所用乙腈、磷酸为谱纯，购自merck公司；
[0050]
乙醇为分析纯购自成都化学试剂厂；实验用水为三蒸水；
[0051]
仪器：waters 2695高效液相谱仪，配备uv检测器，自动进样器和柱温箱(美国waters公司)；mettler-toledo电子精密分析天平(瑞士mettler-toledo公司)，ld4-2型低速离心机(北京医用离心机厂)；tgl-16g型台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)；xk96-a型快速混匀器(江苏姜堰市新康仪器厂)。
[0052]
1.2检测方法
[0053]
1.2.1制备供试品溶液：取适量采用上述方法制备的中药膏方，加乙醇适量溶解，并用油性过滤器过滤，取清液至10ml量瓶中，定容至刻度，即得供试品溶液。
[0054]
1.2.2制备标准溶液：取ao-i对照品和6-s对照品，各精密称取约5mg，置于5ml量瓶中，加乙醇溶解定容至刻度，即得两种对照品含量均为1mg
·
ml-1
的溶液。
[0055]
1.2.3谱分析：采用hplc谱分析供试品溶液，其中，谱条件：使用waters xbridge谱柱(250
×
5mm，4.6μm)，乙腈(a)-0.2％磷酸(b)为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～10min，5～5％a；10～30min，5～30％a；30～40min，30～80％a；40～45min，80～5％a；流速1.0ml
·
min-1
，检测波长277nm，柱温30℃，加入10μl外部标准溶液，进样量10μl。
[0056]
1.3检测结果
[0057]
如图1所示，通过对比对照品，可以得出中药膏方供试品中ao-i的含量为4.83mg/ml；6-s的含量为0.17mg/ml，表明通过上述制备方法所制备的中药膏中，各有效成分的占比较高，不仅表明上述制备方法中中药组合物内各有效成分收得率较高，而且表明中药膏方的质量好。
[0058]
本实施例所提供的中药组合物及中药膏中，有效成分为包括ao-i和6-s，二者联合应用于卵巢癌中，不仅可以解决单独采用ao-i时存在的问题，而且可以显著增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答的效果，可开发成增加抗卵巢癌的化疗敏感性和提升抗卵巢癌免疫应答效果的药物，尤其是可以应用于制备提高抗卵巢癌免疫应答的药物中，如下，提供了相关的试验：
[0059]
2动物体内试验
[0060]
2.1试验一、药代动力学
[0061]
2.1.1试验动物
[0062]
成年sd雌性大鼠(8周龄，体重为200
±
20g)，购自四川成都达硕试验动物有限公司，质量证书编号scxk(川)2020-030(中国成都)。所有动物实验均符合四川省肿瘤研究所实验动物伦理委员会的要求。
[0063]
2.1.2试验方法
[0064]
1、前处理：将18只成年sd雌性大鼠按照体表面积换算给予等效剂量中药膏方灌胃0.5ml，每次灌胃给药前12h禁食不禁水，给药结束后5min、10min、15min、30min、45min、1.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、36h，以尾静脉丛的采血方式断尾采血，进行hplc谱分析有效含量。
[0065]
2、制备血浆样本：取sd雌性大鼠尾静脉血浆样品500μl，置于1.5ml的离心管中，加入10μl外标溶液，混匀后加入800μl乙酸乙酯，涡旋2min，10800rpm离心5min，取出700μl上清液于40℃水浴氮气吹干，加入100μl甲醇复溶，获得血浆样本。
[0066]
3、采用hplc谱分析血浆样本中各有效成分的含量，其中，所述有效成分包括ao-i和6-s，
[0067]
谱条件为：使用waters xbridge谱柱(250
×
5mm，4.6μm)，乙腈(a)-0.2％磷酸(b)为流动相，梯度洗脱，程序为：0～10min，5～5％a；10～30min，5～30％a；30～40min，30～80％a；40～45min，80～5％a；流速1.0ml
·
min-1
，检测波长277nm，柱温30℃，进样量10μl。
[0068]
4、绘制各有效成分的时间-浓度曲线，如图2所示。
[0069]
2.1.3试验结果
[0070]
根据图2可知：大鼠口服中药膏方后，其有效成分ao-i和6-s在大鼠体内吸收较快，消除亦较快，给药20min即可测到，在体内可以持续12h，24h后血浆中均检测不到。其达峰时间t
max
分别为1.5h和1.0h；半衰期t
1/2
分别为1.81h和1.93h。其中，ao-i在体内的药物浓度出现了双峰现象，但是第二次峰值的高度明显低于第一次，表明ao-i在体内存在二次吸收现
象。综上表明，口服中药膏方后，其有效成分ao-i和6-s能被很好的利用，吸收率很高。
[0071]
2.2实验二、药效学
[0072]
2.2.1试验动物
[0073]
成年c57雌性小鼠(6-8周龄，体重为20
±
2g)，购自四川成都达硕试验动物有限公司，质量证书编号scxk(川)2020-054(中国成都)。饲养条件及动物处理同上。
[0074]
上皮性卵巢癌细胞株id8细胞，由四川省肿瘤医院肿瘤防治中心提供；id8细胞已证实为myd88阳性细胞。
[0075]
2.2.2试验试剂
[0076]
紫杉醇粉末，由四川省肿瘤医院研究所提供，紫杉醇的配制：配20mg/ml的紫杉醇原液(0.018g紫杉醇粉末，0.45ml的无水乙醇，0.45ml的聚氧乙烯蓖麻油)；稀释紫杉醇原液：取0.15ml的紫杉醇原液与2.85ml的生理盐水，配制成1mg/ml浓度的紫杉醇稀释液，待用。
[0077]
ao-i的配制：配20mg/ml的ao-i原液(20mgao-i粉末，加0.5ml的无水乙醇，0.5ml的聚氧乙烯蓖麻油)；稀释ao-i原液：取1mlao-i原液与6ml生理盐水，配成2.8mg/ml浓度的ao-i稀释液，待用。
[0078]
6-s的配制：配20mg/ml的6-s原液(20mg6-s粉末，加0.5ml的无水乙醇，0.5ml的聚氧乙烯蓖麻油)；稀释6-s原液：取1ml6-s原液与6ml生理盐水，配成2.8mg/ml浓度的6-s稀释液，待用。
[0079]
s液的配制：无水乙醇与聚氧乙烯蓖麻油1:1比例配制，保存在4℃冰箱，获得s溶液，待用。
[0080]
2.2.3试验方法
[0081]
2.2.3.1 id8细胞培养
[0082]
培养方法：d8细胞在rpmi 1640培养基中生长；添加3％胎牛血清(fbs)、0.15％青霉素、庆大霉素和1％胰岛素。id8细胞保存在培养瓶中，置于5％co2和37℃的培养箱。
[0083]
实验步骤：从液氮容器中取出冻存的上皮性卵巢癌细胞株id8冻存管一支，迅速放入37℃的水浴箱中不停摇动，直至完全融化；吸取全部冻存液移入准备好的含有5ml培养基的15ml离心管中混合均匀，1000r/min离心5min，弃上清液，加3-5ml培养基重悬至细胞培养瓶中，放入培养箱静置培养；把配制好的装有培养液和胰蛋白酶消化液的瓶子放入37℃水浴锅内预热，从培养箱内取出id8细胞，吸出培养基、加入0.25％胰蛋白酶消化液2-3ml，消化时间为2min，加入1-2ml培养基终止消化反应。用毛细吸管反复吹打贴壁id8细胞，制成单细胞悬液；按相应比例吸取细胞悬液，接种于新培养瓶内，补加约5-7ml培养基；置于培养箱静置培养。
[0084]
2.2.3.2卵巢癌荷瘤小鼠模型构建
[0085]
将培养好的id8细胞悬浮液移入离心管中，1000r/min室温离心5min，弃上清液，加入无血清1640培养基，混匀细胞，利用血球计数板进行细胞计数，并利用伊文思蓝染计算活细胞数，细胞悬浮液与伊文思蓝染液的比值为1:20；
[0086]
调整离心管内细胞悬液的细胞密度为3
×
107/ml，其中，每毫升细胞悬液中的细胞数＝4个大格细胞总数/4
×
10000
×
20)；
[0087]
对c57雌性小鼠进行接种，取1ml注射器吸取100ul的细胞悬液，酒精棉球消毒皮
density，md)，数据以均数
±
标准差(x
±
sd)表示，得到表1。本次检测结果pcna阳性产物主要分布在细胞核，阳性细胞呈黄或棕黄，阴性细胞呈蓝，底物呈白，如图3所示。
[0103]
表1 pcna检测荷瘤小鼠卵巢癌组织内细胞增殖情况(iod)，统计结果(x
±
sd)
[0104][0105]
白光tunel法的基本原理为：细胞凋亡时抽提dna进行电泳检测，dna断裂时暴露的3-oh在末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)的催化下加上荧光素(fitc)标记的dutp，tunel法通过显微镜进行检测。具体实验步骤为：取出的小鼠移植瘤组织经全自动脱水机脱水(脱水时长：75％酒精4h，85％酒精2h，95％酒精1h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h，二甲苯10min，二甲苯10min，石蜡1h，石蜡2h，石蜡3h)，包埋，切片后进行如下操作：载玻片防脱片处理：使用apes侵泡，捞片后置烤箱60℃、60min以使切片紧密粘附；切片常规脱蜡至水；用胰蛋白酶k(proteinase k)工作液在37℃处理组织25min；pbs漂洗3次；制备tunel反应混合液：50μl、1号液+450μl、2号液混匀；玻片干后，加50μl tunel反应混合液于标本上，加盖玻片在暗湿盒中反应，条件为：37℃，1h；pbs漂洗3次；玻片干后加50μl、3号液(converter-pod)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应，条件为：37℃，30min；pbs漂洗3次；滴加50-100μldab显剂，观察反应，条件为：25℃，10min；pbs漂洗3次；苏木素轻度复染，几秒后自来水冲洗；酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以上标本均按病理检验sop程序进行脱水、修剪、包埋、切片、染、封片等，最后镜检。镜检过程为：采用3dhistech(hungary)生产的pannoramic250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，每张切片先于40倍下观察全部组织，再根据表达情况再分别选取3个具有代表性的区域400倍采集图像。采用image-pro plus 6.0图像分析系统测定凋亡光密度(integrated optical density，iod)和面积(area)，得到表2，凋亡细胞核颜为浅黄或棕黄，阴性细胞核为蓝或浅蓝，背景为白，如图3所示。
[0106]
表2 tunel法检测荷瘤小鼠卵巢癌组织内凋亡细胞表达强度，统计结果
[0107][0108]
(2)抑瘤率：第三次紫杉醇给药后，小鼠处理方法同上，在测定肿瘤细胞凋亡和增殖之前，先拍照称重肿瘤质量，记录数据，并根据如下公式计算抑瘤率，并得到表3。
[0109]
抑瘤率(％)＝100％
×
(空白组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/空白组肿瘤体积
[0110]
表3荷瘤小鼠各组抑瘤率(％)和半数死亡时间(week)
[0111][0112]
(3)生存期：每组14只荷瘤小鼠中随机抽取6只，共36只，结束后正常饮食，记录每只小鼠死亡时间和每只小鼠肿瘤体积达到1000mm3的时间，并得到表3及图4。
[0113]
(4)药物安全性评价：血常规和血生化指标：至结束后，每组8只荷瘤小鼠中随机抽取4只荷瘤小鼠，共24只。用眼球取血法取小鼠0.5ml全血于edtak2抗凝管、1.5ml离心管中，离心管在3000r/min的转速下离心10min。利用elisa法检测小鼠血清生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、尿素氮(bun)、肌酐(cr)，得到表4。
[0114]
表4荷瘤小鼠各组血肝功能(alt、ast)和肾功能(cr、bun)指标，统计结果
[0115][0116]
肝肾组织学检测：至结束后，每组剩余4只荷瘤小鼠，共24只。摘取全部肝脏组织和双侧肾脏，用生理盐水洗净脏器表面的血污后用滤纸吸干，肝肾组织he染，得到图5。
[0117]
2.2.3.5统计学方法
[0118]
基于上述测量所获得的数据，采用统计软件(如spss 22.0)进行分析，计量资料以表示，进行正态性检验，符合正态分布和方差齐性时，采用t检验或one-wayanova检验，不符合正态分布和方差齐性的数据时，采用秩和检验；计数资料以n(％)表示，采用x2检验，p《0.05差异有统计学意义。
[0119]
2.2.3.6实验结果
[0120]
(1)首次紫杉醇给药后
[0121]
如表1及图3所示，与空白组相比，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组、6-s联合紫杉醇组、紫杉醇组细胞增殖活性明显降低，6组组间差异有统计学意义(p＝0.0031《0.01)，但5个给药组组间差异无统计学意义(p》0.05)。说明5组给药组均有效抑制肿瘤细胞增殖，且疗效相当。
[0122]
如表2及图3所示，与空白组相比，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组、6-s联合紫杉醇组、紫杉醇组细胞凋亡明显升高，6组组间差异有统计学意义(p＝0.0174《0.05)，但5个给药组间差异无统计学意义(p》0.05)；说明5组给药组均有效促进肿瘤细胞凋亡，且疗效相当。
[0123]
(2)第三次紫杉醇给药后
[0124]
如表1及图3所示，与空白组相比，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组肿瘤细胞增殖活性明显降低，紫杉醇组肿瘤细胞增殖活性降低，5组组间差异有统计学意义(p《0.001)；中药膏方联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0071《0.01)，ao-i和6-s联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0109《0.05)，ao-i联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0152《0.05)，6-s联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0158《0.05)，紫杉醇组与空白组比较(p》0.05)。说明紫杉醇组明显出现耐药现象，抗肿瘤疗效大幅下降，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组仍有效抑制肿瘤细胞增殖活性，而且可以明显看出：中药膏方联合紫杉醇组抑制肿瘤细胞增殖活性的效果显著好于ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组，不仅表明ao-i和6-s都是单体化合物，在小鼠体内的生物利用度较低，中药膏方联合紫杉醇组的生物利用度更高，而且表明中药膏方联合紫杉醇组抑制肿瘤细胞增殖活性的效果显著更好；同时，也可以看出：ao-i和6-s联合紫杉醇组抑制肿瘤细胞增殖活性的效果明显好于ao-i联合紫杉醇组和6-s联合紫杉醇组，表明6-s与ao-i的联合有利于提高紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖活性的效果。
[0125]
如表2及图3所示，与空白组相比，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组癌细胞凋亡表达强度继续保持在较高水平，而紫衫组癌细胞凋亡表达强度显著下将到了较低水平，6组组间差异有统计学意义(p《0.001)；中药膏方联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0165《0.05)；ao-i和6-s联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0117《0.05)，ao-i联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0065《0.05)，6-s联合紫杉醇组与紫杉醇组比较(p＝0.0064《0.05)，紫杉醇组与空白组比较(p》0.05)，说明紫杉醇组明显出现耐药现象，抗肿瘤疗效显著下降，中药膏方联合紫杉醇组、ao-i和6-s联合紫杉醇组、ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组仍能有效促进肿瘤细胞凋亡，而且可以明显看出：中药膏方联合紫杉醇组促进肿瘤细胞凋亡的效果好于ao-i和6-s联合紫杉醇组，表明中药膏方联合紫杉醇组在小鼠体内的生物利用度更高；ao-i和6-s联合紫杉醇组促进肿瘤细胞凋亡的效果显著好于ao-i联合紫杉醇组以及6-s联合紫杉醇组，表明6-s与ao-i的联合有利于提高紫杉醇促进肿瘤细胞凋亡的效果，具体而言，由于ao-i可以降低卵巢癌肿瘤细胞对免疫细胞的免疫抑制作用，配合6-s后，6-s可以通过促进卵巢癌表面抗原的暴露来触发免疫细胞对卵巢癌细胞的识别，进而在ao-i降低卵巢癌细胞诱导的对免疫细胞的抑制作用的基础上提升卵巢癌细胞免疫应答效果，通过抑制作用与免疫应答效果的配合，实现类似于协同增强的效果，达到进一步促进肿瘤细胞凋亡的目的，从而可以显著提高生存周期，提高抗卵巢疗效。
[0126]
(3)荷瘤小鼠抑瘤率和生存期
[0127]
如表3及图4所示，抑瘤率分析显示，中药膏方联合紫杉醇组抑瘤率86.0％最高，表明中药膏方联合紫杉醇组的抑瘤效果最好，紫杉醇组抑瘤率47.7％最低，组间差异有统计学意义(p＝0.0028《0.01)；半数死亡时间显示，中药膏方联合紫杉醇组的半数死亡时间最长，即中药膏方联合紫杉醇组的生存周期最长，ao-i和6-s联合紫杉醇组的半数死亡时间次之，并远大于ao-i联合紫杉醇组及6-s联合紫杉醇组的半数死亡时间，ao-i联合紫杉醇组和6-s联合紫杉醇组的半数死亡时间相当，紫杉醇组的半数死亡时间最短，且远小于中药膏方
联合紫杉醇组及ao-i和6-s联合紫杉醇组。中药膏方联合紫杉醇组的抑瘤率(或生存周期)显著大于ao-i联合紫杉醇组及6-s联合紫杉醇组，实现了非线性增长，效果显著；ao-i和6-s联合紫杉醇组的抑瘤率(或生存周期)低于中药膏方联合紫杉醇组的抑瘤率，一方面主要是受到生物吸收率的影响，导致两组存在差异，另一方面可能是因为中药膏方中还包含有除ao-i和6-s以外的其它有效成分，中药膏方中的各组分相互协同实现了更好的抑瘤效果；ao-i联合紫杉醇组的抑瘤率(或生存周期)与6-s联合紫杉醇组的抑瘤率(或生存周期)接近，且高于紫杉醇组，表明两组的效果相当；中药膏方联合紫杉醇组及ao-i和6-s联合紫杉醇组的抑瘤率(或生存周期)显著高于ao-i联合紫杉醇组及6-s联合紫杉醇组的抑瘤率，至少表明6-s与ao-i的联合可以实现更好的抑瘤效果并可以显著提高小鼠的生存周期，并进一步表明6-s与ao-i的联合可以显著增强小鼠的免疫能力，即表明在ao-i的基础上，6-s可以进一步提升抗卵巢癌免疫应答的效果，使得小鼠的免疫细胞在抗卵巢癌肿瘤细胞中持续、有效发挥作用，起到提高抗卵巢癌免疫应答的作用，从而使得6-s与ao-i的联合可以显著增加小鼠的生存周期。
[0128]
(6)安全性分析
[0129]
如表4及图5所示，安全性分析结果表明：各组荷瘤小鼠肝脏、肾脏组织he染未见明显组织损伤，各组间各指标差异无统计学意义(p》0.05)，表明紫杉醇、ao-1、6-s、中药膏方均无明显毒性反应。
[0130]
不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，包括白术和生姜。2.根据权利要求1所述的用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，各原料重量配比是：白术12份、生姜8份。3.根据权利要求1所述的用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，所述白术采用的是麸炒白术。4.一种用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药膏，采用权利要求1-3任一所述的中药组合物制备而成，其特征在于，有效成分包括白术内酯-i和6-姜烯酚。5.一种制备权利要求4所述中药膏的方法，包括如下步骤：步骤1、对中药组合物中的白术和生姜分别进行预处理，获得麸炒白术和生姜碎块，步骤2、将中药组合物放入乙醇中浸泡，步骤3、将浸泡后的中药组合物进行热回流提取，过滤，滤液另存，步骤4、将滤液浓缩成中药膏。6.根据权利要求5所述的用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，采用处方量中药饮片6倍量的乙醇浸泡中药组合物。7.根据权利要求5所述的用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，步骤3中，在70℃的温度下，热回流提取至少2小时。8.根据权利要求5所述的用于提高抗卵巢癌免疫应答的中药组合物，其特征在于，至少重复执行步骤3两次，并合并每次获得的滤液。9.一种权利要求1-3任一所述的中药组合物在制备提高抗卵巢癌免疫应答药物中的应用。10.一种权利要求4所述的中药膏在制备提高抗卵巢癌免疫应答药物中的应用。

技术总结

本发明涉及一种中药组合物、中药膏、中药膏的制备方法及其应用，所述中药组合物包括白术和生姜；本中药组合物，不仅可以使6-姜烯酚与白术内酯-I的联合形成一种可以口服的药剂，解决了6-S与AO-I作为单体化合物的临床使用限制，以及传统中药膏剂口服的吸收度和有效部位的生物利用度的问题，便于卵巢癌患者服用，而且AO-I可以降低卵巢癌细胞诱导的免疫细胞的免疫抑制作用，同时，6-S可以通过促进卵巢癌肿瘤抗原的表达和表面暴露，促进免疫细胞对卵巢癌肿瘤细胞的识别，二者可以相互配合和协同，从而可以解决AO-I诱导的免疫细胞的免疫抑制作用和6-S促进免疫细胞识别，杀伤卵巢癌肿瘤细胞的弊端，显著提升抗卵巢癌的免疫应答和疗效。效。效。