(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010921942.9
(22)申请日 2020.09.04
(71)申请人 宜昌东阳光生化制药有限公司
地址 443300 湖北省宜昌市宜都市陆城滨
江路62号
(72)发明人 王鑫鑫 徐宇骋 刘翠翠 梁在华
高茂林 雷杰进 杨志雄 温素萍
毛兴艳 姚红涛 谢文平
(51)Int.Cl.
C07C 51/347(2006.01)
C07C 51/42(2006.01)
C07C 51/43(2006.01)
C07C 65/03(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提出了一种生物化学法制备原儿茶
酸的方法，采用生物发酵脱氢莽草酸与碱热转化
工艺相结合的生物化学法制备原儿茶酸既能够
降低产物对宿主的生长影响，
也避免了单独加酶催化导致成本升高、提取困难的弊端；经过条件
优化，使该方法制备原儿茶酸转化率大幅度提
高，同时操作简单、稳定性好、成本低，易于实现
工业化生产。权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 112047828 A 2020.12.08 C N 112047828
A
1.一种生物化学法制备原儿茶酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：含脱氢莽草酸的微生物发酵液经过膜过滤处理，得到第一处理液； S2：将所述第一处理液进行调碱、过滤及加热处理，之后调酸得到第二处理液；
S3：将所述第二处理液进行脱处理和干燥处理，得到第三处理物；
S4：使用有机溶剂将所述第三处理物进行提取处理，得到第四处理液；
S5：将所述第四处理液进行浓缩和溶解处理，得到第五处理液；
S6：将所述第五处理液进行结晶和干燥处理，以便得到高纯度原儿茶酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述膜过滤处理是采用孔径为0.1μm的陶瓷膜、截留量为1000Da和50-150Da的纳滤膜的至少之一进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，将所述第一处理液调碱至pH值为6～12，过滤并收集滤液，滤液于50～90℃处理30～90min，之后调酸至pH值为3～4，以便得到第二处理液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，将所述第二处理液与活性炭加热搅拌，过滤并收集滤液，之后进行干燥处理，以便得到第三处理物；
任选地，所述干燥处理为喷雾干燥；
任选地，所述活性炭的添加量为0.1～2质量％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述有机溶剂为乙酸乙酯或95％乙醇；
任选地，所述有机溶剂与第三处理物的体积比为(5～10):1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，将所述第四处理液浓缩至无馏分，加水溶解至100～150g/L，以便得到第五处理液；
任选地，所述溶解是于50～90℃下进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中，所述结晶处理包括室温结晶、低温结晶和水洗处理；
任选地，所述低温结晶温度是在0～10℃下进行的；
任选地，所述干燥处理是在40～80℃下进行的。
权 利 要 求 书1/1页CN 112047828 A
一种生物化学法制备原儿茶酸的方法
技术领域
[0001]本发明属于药物中间体领域，具体涉及一种生物化学法制备原儿茶酸的方法。
背景技术
[0002]原儿茶酸(Protocatechuic acid，PCA)，3,4-二羟基苯甲酸，分子式：(HO) 2C6H3COOH，溶于热水、乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯，微溶于冷水，不溶于苯、氯仿。存在于鳞始蕨科植物乌蕨的叶，冬青科植物冬青的叶等植物中。
[0003]原儿茶酸具有抗菌、抑菌作用，体外试验时对绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、产碱杆菌及枯草杆菌和金黄葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用{胡睿智，贺宇佳，李柏珍，等.原儿茶酸的生理功能及其在畜禽生产中的应用[J].动物营养学报,2019,031 (011):4979-4986.}。除此之外，还具有显著抗氧化、降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，抑制肿瘤细胞生长和诱导HL60白血病细胞、HepG2肝癌细胞凋亡、减慢心等药理作用。亦可祛痰、平喘，临床用于慢性气管炎。
[0004]原儿茶酸主要应用于医药合成、有机中间体合成、染料合成和化学试剂等领域，并且是多种医药产品的核心原料(如抗肿瘤药埃罗替尼、钠通道失活门抑制剂藜芦定、呼吸系统药物盐酸麦皮凡林、乙型肝炎药胡黄连苷II、新型促胃肠动力药盐酸伊托必利、麻醉药益迷兴等)。
[0005]在食品、饲料方面，原儿茶酸作为饲料添加剂在畜禽养殖中，用于促进动物的生长发育，提高饲料转化率，改善胴体品质和肉质风味，全面增强动物免疫功能和防御疾病的能力，克服了化学合成有机酸的毒副作用与食品安全隐患，避免了中草药添加剂成分复杂、使用不便、质量标准难以控制等不足。
[0006]目前，原儿茶酸的来源主要是植物提取和化学合成。
[0007]原儿茶酸存在于鳞始蕨科植物乌蕨和冬青科植物冬青的叶子中。除此之外五味子、杜仲、松塔和紫丁香叶等植物也可作为原儿茶酸的提取来源。但植物提取存在着成本高、效率低的缺点，且原材料受产地、季节和产量情况限制，难以形成大规模生产应用。[0008]原儿茶酸的化学合成法由香草醛作为底物，与氢氧化钠、氢氧化钾水溶液经高温、加压反应制得，后续在此基础上有相关的技术改进报道，如降低反应温度至200℃和采用催化剂等方式。化学合成生产原儿茶酸虽然已有多年的成熟工艺和规模化生产，但产品纯度不高，微量杂质及异构体不可控制，作为药用、食品饲料方面应用，存在安全性风险。且反应条件较为剧烈，存在较高的生产安全隐患。
[0009]随着原儿茶酸在医药、饲料等领域应用的不断推广，原儿茶酸的产量和需求量稳定增长，化学法
和植提法难以满足未来市场的需求，催生了生物发酵生产原儿茶酸的工艺。生物酶法生产的原儿茶酸，纯度高，其他微杂质极少，并且明确无危害，度白，分散性好，在医药方面使用，安全性高。
[0010]专利CN 107058409报道了一种用微生物全细胞催化天然花青素转化原儿茶酸的方法，但其产物浓度仅为33mg/L。2015年，Okai等人利用棒状杆菌表达来自大肠杆菌的谷氨
酸-丙酮酸裂解酶生产原儿茶酸，该菌株发酵96h，原儿茶酸的表达量为1140.0±11.6mg/L，时空产率过低{Naoko,Okai,Takanori，等.Production of protocatechuic acid by Corynebacterium glutamicum expressing chorismate-pyruvate lyase from Escherichia coli[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2016.}。专利CN109477066提供一种以糖类为原料可以有效地制造原儿茶酸或其盐的微生物、及使用该微生物有效地制造原儿茶酸或其盐的方法。通过强化3-脱氢莽草酸脱水酶、分支酸丙酮酸裂解酶活性和4-羟基苯甲酸羟化酶的活性，利用葡萄糖产原儿茶酸，产量最高可以达到82.5g/L。但该方法存在着4-羟基苯甲酸、分支酸等副产物，将会给分离纯化带来较大困难。
[0011]中科院天津工物所构建了利用葡萄糖产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌，发酵37h，产量为33.3g/L。但该机构报道称可以构建生产原儿茶酸前体物3-脱氢莽草酸的大肠杆菌工程菌，然后将3-脱氢莽草酸(DHS)发酵液在全细胞生物催化剂作用下产79g/L原儿茶酸。已知悉其CN201711002831中3-脱氢莽草酸产量在94g/L左右，但并未有相关转化的实验数据披露，且引入了全细胞生物催化剂，不仅需要额外发酵，还会给提取带来困难，增加了成本和提取复杂程度。
[0012]CN109266591公开了一种利用苯酚为原料生产原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)的基因工程菌及其构建方法，该工程菌含有对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD和羟化酶基因pobA，以苯酚为原料，通过生物转化法将苯酚进行加羧获得对羟基苯甲酸，然后将对羟基苯甲酸3位氧化获得原儿茶酸。但并未报道产量情况，且底物为苯酚，对环境影响较大。[0013]杨秀清等报道了以对羟基苯甲酸为底物，利用羟化酶合成原儿茶酸的方法，但产量与底物浓度均较低，难以满足工业化生产{杨秀清.原儿茶酸的生物转化[J].微生物学通报,2019,46(12):3378-3387.}。
[0014]专利CN110184288中公布了一种以60g/L 3-脱氢莽草酸为底物，3-脱氢莽草酸脱水酶催化制备原儿茶酸，反应5h底物转化率>98％，该方法虽然底物浓度较高，但需要加入额外的酶进行催化，增加发酵成本和提取困难度。
[0015]综上所述，现有的生物合成原儿茶酸技术，因产物本身具有抑菌的活性，因此导致发酵生物量以及产量难以提升，存在着产量低、副产物多等问题，且需要引入外源基因或者酶进行催化制备，既增加了生产成本，也给后续的提取分离带来了困难，制约了工业化的发展。
发明内容
[0016]本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。[0017]为此，本发明提出了一种生物化学法制备原儿茶酸的方法，包括如下步骤：[0018]S1：含脱氢莽草酸的微生物发酵液经
过膜过滤处理，得到第一处理液；
[0019]S2：将所述第一处理液进行调碱、过滤及加热处理，之后调酸得到第二处理液；[0020]S3：将所述第二处理液进行脱处理和干燥处理，得到第三处理物；
[0021]S4：使用有机溶剂将所述第三处理物进行提取处理，得到第四处理液；
[0022]S5：将所述第四处理液进行浓缩和溶解处理，得到第五处理液；
[0023]S6：将所述第五处理液进行结晶和干燥处理，以便得到高纯度原儿茶酸。[0024]发明人发现，采用生物发酵脱氢莽草酸与碱热转化工艺相结合的生物化学法制备
原儿茶酸既能够降低产物对宿主的生长影响，也避免了单独加酶催化导致成本升高、提取困难的弊端；经过条件优化，使该方法制备原儿茶酸转化率大幅度提高，同时操作简单、稳定性好、成本低，易于实现工业化生产。
[0025]根据本发明的实施例，所述生物化学法制备原儿茶酸的方法还可以具有以下附加特征：
[0026]根据本发明的实施例，步骤S1中，所述膜过滤处理是采用孔径为0.1μm的陶瓷膜、截留量为1000Da和50-150Da的纳滤膜的至少之一进行的。
[0027]根据本发明的实施例，步骤S2中，将所述第一处理液调碱至pH值为6～12，过滤并收集滤液，滤液于50～90℃处理30～90min，之后调酸至pH值为3～4，以便得到第二处理液；[0028]任选地，所述调碱使用的碱为氢氧化钠，所述调碱使用的酸为硫酸。
[0029]根据本发明的实施例，步骤S3中，所述将所述第二处理液与活性炭加热搅拌，过滤并收集滤液，之后进行干燥处理，以便得到第三处理物；
[0030]任选地，所述活性炭的添加量为0.1～2质量％；
[0031]任选地，所述干燥处理为喷雾干燥，所述喷雾干燥进风口设置为150～200℃，优选为170～180℃，出风口设置为50～100℃，优选为70～90℃。
[0032]根据本发明的实施例，步骤S4中，所述有机溶剂为乙酸乙酯或95％乙醇；[0033]任选地，所述有机溶剂与第三处理物的体积比为(5～10):1；
[0034]任选地，所述提取的时间为1～2h。
[0035]根据本发明的实施例，步骤S5中，将所述第四处理液浓缩至无馏分，加水加热溶解至100～150g/L，以便得到第五处理液。
[0036]根据本发明的实施例，步骤S6中，所述结晶处理包括室温结晶、低温结晶和水洗处理；
[0037]任选地，所述低温结晶温度是在0～10℃下进行的；
[0038]任选地，所述室温结晶的时间为12h，低温结晶的时间为24h；
[0039]任选地，所述干燥处理是在40～80℃下进行的。
[0040]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0041]图1显示了脱氢莽草酸发酵液含量检测；
[0042]图2显示了DHS转化为PCA中间样检测；
[0043]图3显示了PCA产品含量检测。
具体实施方式
[0044]下面详细描述本发明的实施例。下面面试的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0045]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
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