(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110229373.6
(22)申请日 2021.03.02
(71)申请人 苏州大学
地址 215000 江苏省苏州市吴中区石湖西
路188号
(72)发明人 郑慧 陈相洁 龚方苑 龚政
(74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代
理事务所(普通合伙) 32257
代理人 苏张林
(51)Int.Cl.
A61K 31/122(2006.01)
A61K 9/00(2006.01)
A61K 9/14(2006.01)
A61P 29/00(2006.01)
A61P 19/02(2006.01)
(54)发明名称
的应用
(57)摘要
本发明涉及医药技术领域，并公开了薄荷酮
在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。本
(CIA)证实了薄荷酮可以通过下调关节炎症部位
和血细胞中炎症因子水平，以及通过调节不同亚
型T细胞的平衡，有效地缓解了类风湿性关节炎
症状，具有良好的抗类风湿性关节炎的作用。本
发明涉及的薄荷酮可用于制备类风湿性关
节炎的药物，为寻求安全有效的抗类风湿性关节
炎药物提供了一个新的方向。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 112755010 A 2021.05.07
C N 112755010
A
1.薄荷酮在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的薄荷酮在制备类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述薄荷酮通过下调关节炎症部位和血细胞中炎症因子水平来缓解类风湿性关节炎症状。
3.根据权利要求2所述的薄荷酮在制备类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF ‑α，IL ‑1β和IL ‑6。
4.根据权利要求1所述的薄荷酮在制备类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述薄荷酮通过调节不同亚型T细胞的平衡来缓解类风湿性关节炎症状。
5.根据权利要求4所述的薄荷酮在制备类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述不同亚型T细胞包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞。
6.一种类风湿性关节炎的药物，其特征在于，
所述药物中包括有效剂量的薄荷酮。7.根据权利要求6所述的一种类风湿性关节炎的药物，其特征在于，所述药物中还
包括药剂学上的常规药物赋形剂、
载体或稀释剂。8.根据权利要求6所述的一种类风湿性关节炎的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂或粉针剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 112755010 A
薄荷酮在制备类风湿性关节炎药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种天然植物成分薄荷酮(Menthone)在制备类风湿性关节炎药物中的应用。
背景技术
[0002]类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种临床常见的自身免疫病。患者的临床症状主要表现为局部关节炎症和软骨的破坏。RA的全球发病率为0.5％～1.0％，在任何年龄阶段均可发病。RA患者如果未能及时接受有效的，病情会逐渐加重，最终会引发关节畸形和功能丧失，导致残疾，影响患者日常生活能力。
[0003]在过去的十几年间，RA的手段已经得到了长足的发展。但是，由于其发病机制尚且未明，因
此，目前尚没有理想的方法完全治愈RA。在临床上，RA的方法一般分为五个大类：1.中药疗法；2.西药疗法；3.中西药结合疗法；4.基于纳米载药系统的药物；5.其他疗法。其中，西药疗法是目前使用较为广泛的RA疗法。然而，西药虽然有一定的疗效，但副作用大，不良反应多，某些生物制剂价格昂贵，目前难以普及。这些问题都制约了RA西医疗法的发展。中药疗法因其安全性高、副作用小、成本低廉受到越来越多的关注。随着近年来中医理论的不断发展完善，中药制剂因其在稳定性、生物活性和安全性方面的优势鼓励了人们对中药制剂开发的兴趣，同时对它们的潜力也产生了很大的期望。
[0004]目前常用于RA的中药成分是雷公藤，然而其具有一定的毒性。其常见的副作用主要表现在对生殖系统的损伤、诱发再生障碍性贫血、极少数病人可发生心源性休克而危及生命。因而开发更加高效、安全的中药成分用于RA的是目前亟待解决的问题。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种有效类风湿性关节炎的中药成分及其在制备类风湿性关节炎药物中的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供了一种薄荷酮在制备改善类风湿性关节炎的药物中的应用。
[0007]薄荷酮(Menthone)，分子式为C
10H
18
O，其是以薄荷醇为原料，经氧化反应而得；也
可以从天然薄荷、天竺葵、老鹳草、芳须芒草等天然原料中提取得到。薄荷酮有提神醒脑、强效镇痛、抗凝血、帮助皮肤组织再生、化痰、排解粘液、止吐、解除充血的特性。薄荷酮是配制香叶油的香料，微量用于香茅醇中或用于玫瑰等花香香精中，有提调花香之作用；也可以作为食用凉味香精的原料和牙膏赋香的香料。但是目前并没有发现薄荷酮具有预防或类风湿性关节炎的功效。
[0008]进一步地，所述薄荷酮能够通过下调关节炎症部位和血细胞中炎症因子水平来缓解类风湿性关节炎症状。其中，所述炎症因子包括TNF‑α，IL‑1β和IL‑6。
[0009]进一步地，所述薄荷酮能够通过调节不同亚型T细胞的平衡来缓解类风湿性关节炎症状。其中，所述不同亚型T细胞包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞。
[0010]本发明还提供了一种类风湿性关节炎的药物，所述药物中包括有效剂量的薄荷酮。
[0011]进一步地，所述药物中还可包括药剂学上的常规药物赋形剂、载体或稀释剂。[0012]进一步地，所述药物的剂型为注射剂或粉针剂。
[0013]本发明通过大量的实验证实了薄荷酮对类风湿性关节炎的缓解作用。
[0014]首先，对薄荷酮能否抑制2fTGH细胞一型干扰素(interferon,IFN)信号通路及具体机制进行了研究。结果显示，薄荷酮可以显著抑制IFN信号通路，包括下调IFNα刺激和非刺激下的干扰素诱导基因(ISGs)水平；薄荷酮能够明显下调一型干扰素信号通路关键蛋白Tyk2的蛋白水平，促进Tyk2蛋白的泛素化修饰。
[0015]其次，构建了胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型(CIA)，采用局部注射的方式给小鼠后肢肿胀部位注射薄荷酮，观察薄荷酮对小鼠局部关节症状的作用。结果显示，连续局部注射薄荷酮(100mg/kg)14天后，小鼠的关节形态明显恢复，炎症因子表达明显下调，IFN信号通路得到明显抑制，表明薄荷酮可以显著缓解类风湿性关节炎症状。
[0016]最后，通过向CIA小鼠局部注射的方式给小鼠后肢肿胀部位注射薄荷酮，进一步验证薄荷酮的抗风湿功能。结果显示，薄荷酮可以通过抑制一型干扰素信号通路来改善小鼠体内炎症反应，改善各种不同亚型T细胞比例，从而缓解类风湿性关节炎的症状。
[0017]本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0018]目前已有的类风湿性关节炎的药物大多具有较为严重的副作用，在使用过程中存在诸多限制。
本发明从Menthone对机体固有免疫调控的角度出发，阐明了一种中药单体成分—薄荷酮Menthone可以通过抑制机体免疫反应，从而缓解了类风湿性关节炎小鼠局部症状，为Menthone的抗风湿药物研发提供新方向。这种中药单体成分薄荷酮提取自植物，是一种天然植物成分，毒性较小。Menthone有望成为一种更加安全的药物用于类风湿性关节炎。
附图说明
[0019]图1：在2fTGH细胞中不同浓度Menthone处理细胞24h，利用qPCR检测干扰素信号通路下游基因Ifit1的mRNA。
[0020]图2：在2fTGH细胞中Menthone(100μM)处理24h后，IFNα刺激细胞不同时间，利用Western Blot检测IFIT1、PKR蛋白水平。
[0021]图3：在2fTGH细胞中Menthone处理细胞24h，利用Western Blot检测一型干扰素信号通路关键蛋白。
[0022]图4：在2fTGH细胞中转染Flag‑Ub 48h后Menthone处理细胞24h，免疫共沉淀Tyk2后，利用Western Blot检测Tyk2泛素化修饰。
[0023]图5：CIA小鼠模型关节炎部位He染。
[0024]图6：Menthone(100mg/kg)局部注射CIA小鼠发病部位14天，分离小鼠滑膜组织，采用Realtime qPCR方法检测小鼠滑膜组织中炎症因子(IL‑1β、IL‑6、TNFα)水平。N＝5，数据显示mean±SD,p<0.05*，p<0.01**,p<0.001***。
[0025]图7：Menthone(100mg/kg)局部注射CIA小鼠发病部位14天，分离小鼠滑膜组织，采用Realtime qPCR方法检测小鼠滑膜组织中ISGs(Ifit1、Isg15、Mx1)水平。N＝5，数据显示
mean±SD,p<0.05*，p<0.01**,p<0.001***。
[0026]图8：Menthone(100mg/kg)局部注射CIA小鼠发病部位14天，分离小鼠血细胞，采用Realtime qPCR方法检测小鼠全血中ISGs(Ifit1、Viperin、Isg15)水平。N＝5，数据显示mean±SD,p<0.05*，p<0.01**,p<0.001***。
[0027]图9：Menthone(100mg/kg)局部注射CIA小鼠发病部位14天，分离小鼠血细胞，采用Realtime qPCR方法检测小鼠全血中各种不同亚型T细胞(Th1、Th2、Th17、Treg)关键转录因子(T‑bet、Gata3、Rorγt、Foxp3)水平。N＝5，数据显示mean±SD,p<0.05*，p<0.01**,p< 0.001***。
[0028]图10：Menthone(100mg/kg)局部注射CIA小鼠发病部位14天，分离小鼠血细胞，采用Realtime qPCR方法检测小鼠全血中炎症因子(IL‑1β、IL‑6、TNFα)水平。N＝5，数据显示mean±SD,p<0.05*，p<0.01**,p<0.001***。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0030]如无特殊说明，本发明实施例所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
[0031]实施例1：Menthone抑制一型干扰素信号通路
[0032]在前期研究中发现，类风湿性关节炎模型小鼠的局部关节中，一型干扰素信号通路处于激活状态。当抑制一型干扰素信号通路后，类风湿性关节炎模型小鼠的症状有所缓解。因此，一型干扰素可能是类风湿性关节炎的重要靶点。
[0033]为了探索Menthone是否能调控一型干扰素信号通路，将2fTGH细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入Menthone(10、100μM)，阴性对照组(Ctrl)加入等体积的DMSO。37℃孵育24h后，使用Trizol裂解细胞，之后提取细胞中总RNA并逆转录成cDNA，利用荧光定量PCR技术检测干扰素信号通路下游重要干扰素刺激基因(ISGs)Ifit1的mRNA水平。所得结果如图1所示。
[0034]随后，将2fTGH细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入Menthone (100μM)，阴性对照组(Ctrl)加入等体积的DMSO。37℃孵育24h后，用IFNα(1000U/mL)刺激细胞6、12h。用NP‑40裂
解液将细胞裂解，制备蛋白样品，用SDS‑PAGE电泳后，转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，PBST洗涤后，加入二抗室温孵育1h，PBST 洗涤后，加入发光底物进行曝光、显影和定影。所得结果如图2所示。
[0035]图1和图2的结果显示，Menthone可以显著抑制IFN信号通路，包括下调IFNα刺激和非刺激下的ISGs水平。
[0036]实施例2：Menthone下调一型干扰素关键蛋白Tyk2蛋白水平
[0037]为了进一步分析Menthone调控一型干扰素信号通路具体机制，将2fTGH细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入Menthone(100μM)，阴性对照组(Ctrl)加入等体积的DMSO。37℃孵育24h后，用NP‑40裂解液将细胞裂解，制备蛋白样品，用SDS‑PAGE电泳后，转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，PBST洗涤后，加入二抗室温孵育1h，PBST洗涤后，加入发光底物进行曝光、显影和定影。所得结果如图3所示。
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