(10)申请公布号 CN 102847198 A
(43)申请公布日 2013.01.02C N 102847198 A
*CN102847198A*
(21)申请号 201210345312.7
(22)申请日 2012.09.17
A61L 27/22(2006.01)
A61L 15/32(2006.01)
A61L 31/04(2006.01)
(71)申请人浙江星月生物科技股份有限公司
地址311121 浙江省杭州市余杭区仓前街道
海曙路9号3幢2楼
(72)发明人陈隆坤
其他发明人请求不公开姓名
(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公
司 33201
代理人黄美娟 王兵
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种难溶于水的丝素蛋白膜及
其制备与应用：将质量浓度0.3~30%丝素蛋白溶
湿度10~70%条件下干燥，获得丝素蛋白膜；将丝
素蛋白膜在50~100℃，
相对湿度70~100%条件下放置20~200min ，再依次用乙醇水溶液、纯化水充
分浸洗，获得难溶于水的丝素蛋白膜；本发明以
丝素蛋白为原料，膜及其降解产物生物相容性好；
本发明制备工艺简单，环保无毒；所发明膜在湿
润环境下，致密而柔软，能阻止细胞、微生物及生
物大分子穿过；贴滑型膜的粗糙面有利于膜的固
定、创面止血和引导组织再生；在防粘连膜、护创
膜和人工膜补片领域具有广阔的市场。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书7页 附图3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页
1.一种难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于所述丝素蛋白膜按如下方法制备：
（1）以桑蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或
（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液，将丝离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；
素蛋白溶液的质量浓度用水调整至0.3~30%，倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为1~50mg/cm2模具，将模具在温度5~60℃，相对湿度10~70%条件下干
（3）将模具在温度50~100℃，相对湿度燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成丝素蛋白膜；
70~100%条件下放置20~200min进行湿热交联，然后置于体积浓度50~90%的乙醇水溶液中浸洗10~60min，去除模具，丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗30~150min至无醇，获得难溶于水的丝素蛋白膜。
2.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述截留液a的浓缩液制备方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20~60%的聚乙二醇水溶液中，静置1~10h，取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量1000~10000。
3.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a）将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000~6000g条件下离心5~20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2~20μm的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液。
4.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（2）所述模具为底部光滑平整且水平的模具。
5.如权利要求1或4所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（2）所述模具利用浮法玻璃制成的
底部光滑平整且水平的模具，所述模具内质量浓度0.3~30%的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为1~50mg/cm2模具，将模具在温度5~60℃，相对湿度10~70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成表面光滑的丝素蛋白膜；将模具在温度50~100℃，相对湿度70~100%条件下放置20~200min进行湿热交联，然后置于体积浓度50~90%的乙醇水溶液中浸洗10~60min，去除模具，丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗30~150min，获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。
6.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（2）所述模具为底部毛糙且水平的模具。
7.如权利要求1或6所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（2）所述模具底部为浮法玻璃经磨砂获得粗糙面的模具，所述模具内质量浓度0.3~30%的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为1~50mg/cm2模具，将模具在温度5~60℃，相对湿度10~70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成一面光滑，一面粗糙的丝素蛋白膜；将模具在温度50~100℃，相对湿度70~100%条件下放置20~200min进行湿热交联，然后置于体积浓度50~90%的乙醇水溶液中浸洗10~60min，去除模具，丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗30~150min，获得难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。
8.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述脱胶、溶解、透析方法为：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4~8L的2M碳酸钠水溶液中，90~100℃水浴20~60min，纯水清洗，该过
程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20~60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9~11M的溴
化锂水溶液中，55~65℃水浴30~300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白与溴化锂水溶液的质量体积比为0.1~0.2:1；c）透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000~20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10~12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。
9.如权利要求1~8之一所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述人工膜为引导骨再生膜、胸膜、硬脑膜、硬脊膜、鼓膜或眼角膜。
一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用
（一）技术领域
[0001] 本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法，特别涉及一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备和应用。
（二）背景技术
[0002] 蚕丝是强度最好的天然纤维之一，由70~80%的丝素蛋白和20~30%的丝胶蛋白组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸--甘氨酸-丝氨酸”(GAGAGS)的重复单元构成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的85%以上。该重复序列绝大多数位于丝素蛋白的结晶区，并自组装成反向平行折叠链构象（anti-parallel β-sheet）结构。这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的特性。
[0003] 丝胶蛋白在体内会引起炎症反应，在使用前需要需进行脱胶处理（degummed）。丝素蛋白由分子量为325KD和25KD两种蛋白组成，其降解产物为氨基酸。大量的研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性，其体内炎症反应（inflammatory responses）要远低于胶原和聚乳酸等常用生物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史，经编织后作为人工韧带和组织补片已在研究领域应用。但在目前的生物材料研究领域应用更多的是再生型丝素蛋白。即丝素蛋白经过脱胶、溶解、提纯后，再通过物理、化学的方法，形成海绵状、膜状、凝胶状、微球状等形态。
[0004] 在丝素蛋白膜的制备方面，中国发明专利“一种可溶—高弹性丝素蛋白膜的制备方法”（CN101234212A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在聚苯乙烯培养皿在恒温恒湿箱内（温度40~70℃，相对湿度60~80%）直接干燥形成厚度为30~50um可溶性膜。中国发明专利“再生丝素蛋白膜及其制备方法”（公开号CN 101760027A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在PS 皿内直接干燥成膜（未对干燥条件提出要求），再用极性溶剂（C1-C5醇和水混合物、水或水蒸汽）结合力学拉伸，进行溶胀变
性处理，以改善丝素蛋白膜的脆性，即增加拉伸伸长率。中国发明专利“一种难溶于水的透明丝素蛋白膜及其制备方法”（CN101967282A）中，在提纯后的丝素蛋白溶液中加入多元醇作为交联剂，将两者混合物在模具中经鼓风干燥成膜，再在相对湿度为30~98%的环境中处理1~48小时（未对处理温度提出要求），获得所需要的膜。中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方法”（CN1316465）中，通过加入环氧树脂来交联丝素蛋白制备不溶于水的丝素蛋白膜。
[0005] 现有丝素蛋白膜的制备方法，均是丝素蛋白溶液或其混合物灌注在模具内，通过溶剂挥发干燥，溶质沉积于模具底部，进而形成厚度约10~500um的可溶或难溶于水的膜。在该步骤的成膜过程中，模具底部上表面的平整性和水平性，模具是否处于振动环境，吹在溶液表面的风速，都将影响膜厚度的均一性和膜表面的微观结构；该步骤成膜过程中，干燥的温湿度条件，也将影响膜的透明性和膜均一性（如温度过高，会在膜内形成微气泡）；该步骤中膜的干燥程度，也影响膜的性能；该步骤膜的干燥时间约几小时到几天，模具所处环境的洁净程度，将影响膜的微生物和内毒素含量；该步骤形成的膜，再通过后续步骤的极性溶
液或湿热条件等处理，处理温湿度也会对膜的结晶程度造成影响。
[0006] 针对上述问题，本发明专利期望通过最简单和最经济的方法，获得一种难溶于水的丝素蛋白膜。
（三）发明内容
[0007] 本发明目的是提供一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备方法和应用，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性、促凝和交联等添加剂，制备工艺简单，利于大量生产；模具底面采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台；通过改变模具底部上表面的光滑或粗糙程度，将获得两种不同表面结构的丝素蛋白膜：底部光滑模具制备的双滑型膜，膜的两面均是光滑面，膜为半透明至近透明状，而底部毛糙模具制备的贴滑型膜，一面光滑，另一面粗糙，粗糙面有利于膜在创面的固定，利于止血、细胞粘附和增殖；通过控制该膜的厚度及其结晶程度，产生不同理化性能（如力学、柔韧度）和生物学性能（体内降解速率），满足不同用途的需要；该膜在湿润条件会吸收30~40%水分，膜会变的柔软（厚度10~100um），大于150um的柔韧性较差；膜降解产物为氨基酸，膜及其降解产物具有良好的生物相容性；膜能阻止细胞、微生物及生物大分子穿过，具有一定的水汽渗透性能；该膜在防粘连膜、护创膜或人工膜（引导骨再生膜、牙周膜、胸膜、硬脑膜或硬脊膜、鼓膜、眼角膜）等领域具有广阔的市场。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
（1）以桑蚕蚕丝[0009] 一种难溶于水的丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜按如下方法制备：
为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取
（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；
液的质量浓度用纯化水调整至0.3~30%（优选0.5～15%）（取部分丝素蛋白溶液在60℃烘干至恒重，计算丝素蛋白溶液的含水量，从而计算用纯化水调整丝素蛋白溶液所需的水量）倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为1~50mg/cm2模具（优选2~30mg/cm2，更有效3~20mg/cm2），在温度5~60℃（优选35~55℃，更优选45℃），相对湿度（RH）10~70%（优选20~50%，最优选40%）条件下干燥至无肉眼可见的水分，模具重量增加了所加入丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的1.2~1.8倍，在模具内形成丝素蛋白膜；
（3）将模具在温度50~100℃（优选60~80℃，更优选65~70℃），RH为70~100%（优选85~95%，最优选90%）条件下放置20~200min（优选60~150min，最优选120min）进行湿热交联，然后置于体积浓度50~90%（优选75%）的乙醇水溶液中浸洗10~60min（优选30min），去除模具，丝素蛋白膜再用纯化水充分浸洗30~150min（优选60~120min）至无醇，获得难溶于水的丝素蛋白膜，通常厚度为10~500μm，优选厚度20~200μm。
[0010] 进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液的制备方法是将透析后的透析袋放入质量浓度20~60%的聚乙二醇水溶液中，静置1~10h进行浓缩，取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量1000~10000。
[0011] 进一步，步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a）将截留液a
或截留液a的浓缩液于4℃、3000~6000g条件下离心5~20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2~20μm 的滤器过滤，去除不溶性颗粒，取滤液即为所述的丝素蛋白溶液。
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